賈晨波，郭洋，馬成蓮，蘇建宇，徐春燕

寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021

枸杞（Lycium barbarumL.）隸屬于茄科枸杞屬，其根系較為發(fā)達(dá)，抗旱能力強(qiáng)，是寧夏重要的經(jīng)濟(jì)作物。近年來，隨著寧夏枸杞種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大，枸杞病害的發(fā)生也越來越多，例如白粉?。╓ang et al.，2015）、炭疽?。ㄙZ倩等，2014）及根腐?。–ariddi et al.，2018）等，這些病害常常會(huì)造成枸杞的減收減產(chǎn)，嚴(yán)重影響著枸杞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。其中，根腐病是極為常見的一種土傳病害，多發(fā)生在植物根部或莖部，其病原物的生活史的一部分或大部分存在于土壤中。在條件適宜時(shí)，病原物萌發(fā)并侵染植物根部或莖部導(dǎo)致植物發(fā)生病害。已報(bào)道枸杞根腐病病原菌種類有腐皮鐮刀菌、同色鐮刀菌、串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、疫霉菌和立枯絲核菌（劉振榮，1980；王國珍等，1994；李暉等，1998）等。根腐病的發(fā)生一般從植株根莖附近開始，局部皮層逐漸腐爛并向周圍擴(kuò)散，輸導(dǎo)組織被破壞，營養(yǎng)物質(zhì)不能從地下及時(shí)足量地運(yùn)輸?shù)街仓甑厣喜糠?，后期外皮脫落只剩木質(zhì)部，最終致使全株枯萎死亡，危害嚴(yán)重時(shí)可毀壞整個(gè)果園。

目前國內(nèi)外對(duì)于根腐病的研究較多，涉及大豆、人參和大白菜（Nyandoroet al.，2019；Li et al.，2020；郭梅等，2019）等多種作物上病原菌的分離、鑒定、致病性檢測（伍曉麗等，2020）和根腐病的防治（崔云龍等，1995；陳伶俐，2015）等方面。目前對(duì)于枸杞根腐病的研究較少，且主要集中于枸杞根腐病的發(fā)生現(xiàn)狀與防治辦法等方面，部分研究報(bào)道了枸杞根腐病的致病菌分離、毒力測定及其生物學(xué)特性（李捷等，2017），但對(duì)枸杞健康株和根腐病患病株的土壤及植物相關(guān)部位微生物群落結(jié)構(gòu)的差異研究甚少。土壤微生物是土壤的重要部分（Naet al.，2019），植物土傳病害的發(fā)生、發(fā)病程度一般與病原菌、益生菌及植物所在土壤生態(tài)環(huán)境有密切的關(guān)系。例如，盧圣鄂等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，黃精根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)豐富度的降低和具有致病性的真菌相對(duì)豐度的增加有可能導(dǎo)致了黃精根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變和根腐病的發(fā)生。宋旭紅等（2017）基于高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌種群豐富度和多樣性的顯著降低有可能是造成黃連根腐病的重要原因之一。余金陽等（2020）認(rèn)為大蒜根腐病發(fā)生的主要原因是微生物群落結(jié)構(gòu)失衡?？梢?，許多工作已經(jīng)在多種植物上證實(shí)了根腐病的發(fā)生與土壤微生物多樣性及物種組成變化有密切的關(guān)系。因此，感染根腐病的枸杞植株與健康枸杞植株之間的土壤微生物群落組成及多樣性有怎樣的差異也值得深入研究。

2019年6月，寧夏中寧縣花豹灣村枸杞園的寧杞1號(hào)枸杞遭遇大面積死亡，植株大量干枯，挖出死株可見根部腐爛，經(jīng)鑒定為根腐病所致。本研究采集了該地患病株和健康株的根表、根際和根圍土壤樣品，提取土壤中的宏基因組DNA，利用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對(duì)16S rDNA和ITS片段進(jìn)行測序，對(duì)比患病株和健康株根表、根際和根圍土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的差異，該研究有助于我們了解枸杞根腐病發(fā)生與微生物群落之間的關(guān)系，豐富我們對(duì)枸杞根腐病的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 采集地概況

2019年 8月于寧夏回族自治區(qū)中寧縣花豹灣（37°17′N，105°39′E）采集樣品。中寧縣屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，境內(nèi)光照充足，日照時(shí)間長，年均日照時(shí)數(shù) 2855.0—3219.7 h，年均氣溫 8.3—11.0 ℃，地勢南高北低，平均海拔1140—1600 m，年均降水量78.5—335.0 mm（雷蕾等，2020）。該縣地勢平坦，土層深厚，得益于黃河與清水河的交匯灌溉，土壤富含各種礦物質(zhì)和微量元素，為枸杞種植提供了得天獨(dú)厚的土壤條件。

1.2 樣品采集

所選樣地的枸杞栽培種為寧杞1號(hào)，根據(jù)枸杞植株莖葉的形態(tài)選出待采樣的植株，挖出整個(gè)植株的根。根據(jù)根的形態(tài)判斷植株是否患病，共選擇 3株患根腐病的病株和3株健康植株分別采集樣品，健康株隨機(jī)選擇，一般距離患病株10 m以內(nèi)，所有患病株與健康株均選自同一塊種植地。以植株主干為中心，圍繞植株每120°為一份，按距離枸杞根部由遠(yuǎn)及近的方法，依次采集根圍、根際土壤和根組織樣品。3份土壤樣品等比例混勻，分別獲得根圍樣品BZGW1和根際樣品BZGJ1。3個(gè)方向采集到的根組織進(jìn)行混合，用于制備根表樣品BZGB1。同樣的方法獲得第2株和第3株患病株根組織及根圍樣品 BZGW2和 BZGW3、根際樣品 BZGJ2和BZGJ3，根組織用于制備根表樣品 BZGB2和BZGB3。使用同樣的方法采集健康株的根表組織、根際土壤、根圍土壤樣品各3個(gè)。將根上的土壤抖落，然后用毛刷小心刷下的土壤用 20目標(biāo)準(zhǔn)篩除去根等雜物后即為根際土壤樣品，大約20 g左右；距根須1 cm以外一圈采集的土壤用20目標(biāo)準(zhǔn)篩除去根等雜物后即為根圍土壤樣品，大約100 g左右；根組織帶回實(shí)驗(yàn)室處理得到根表樣品。所有樣品采集后均迅速低溫保藏并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室，于?20 ℃暫存。

1.3 根表樣品的制備

取根組織浸沒于無菌PBS溶液，于4 ℃下180 r·min?1。低溫孵育 20 min，保留洗滌液；取出植物組織在同樣的條件下再次孵育20 min，合并兩次洗滌液并于 10000 r·min?1低溫離心 10 min，收集的沉淀物即為根表樣品。

1.4 DNA抽提和PCR擴(kuò)增

根據(jù) DNeasy PowerSoil Pro Kit（QIAGEN’s Second-generation Inhibitor Removal Technology?）分別抽提患病株的九個(gè)樣品和健康株的九個(gè)樣品土壤微生物總DNA，檢測合格后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16s rDNA和ITS片段的高通量測序。使用 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAG CAG-3′）和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCT AAT-3′）對(duì)16S rRNA基因“V3+V4”區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用 ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAG TAA-3′）和 ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGA TGC-3′）對(duì)ITS1區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測合格后利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用 Trimmomatic軟件對(duì)原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接，過濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基，過濾質(zhì)控后50 bp以下的reads，根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)reads拼接成一條序列，最小overlap長度為10 bp；拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2。使用的UPARSE軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/)，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) 對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì) Silva數(shù)據(jù)庫和（https://www.arb-silva.de/）和 Unite數(shù)據(jù)庫（https://unite.ut.ee/），設(shè)置比對(duì)閾值為70%。所有的分析都基于抽平后的數(shù)據(jù)，采用Excel 2016和SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，根據(jù)單因素方差分析檢驗(yàn)顯著性，所有數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，展示數(shù)據(jù)時(shí)分別將相應(yīng)樣品名合并為BZGB、BZGJ、BZGW和JKGB、JKGJ、JKGW。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性比較

所有樣品測序共產(chǎn)生 1131102條真菌有效序列，聚類為1603個(gè)OTUs；產(chǎn)生479376條細(xì)菌有效序列，聚類為6704個(gè)OTUs。根表、根際和根圍土壤的真菌和細(xì)菌群落測序覆蓋度（Coverage）分別高于0.99和0.96（表1），表明樣品測序深度基本能夠反映微生物的真實(shí)情況。健康株根表真菌群落的Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、Shannoneven指數(shù)均顯著大于患病株（P<0.05），即健康株根表真菌群落的豐富度、多樣性和均勻度均顯著大于患病株（P<0.05）。健康株根圍土壤真菌的多樣性和均勻度也顯著大于患病株（P<0.05）。健康株根表、根際和根圍土壤真菌之間的群落豐富度差異顯著（P<0.05），健康株根表和根際土壤真菌均勻度差異也很顯著（P<0.05）；患病株根表、根際土壤真菌與根圍土壤真菌的群落豐富度差異顯著（P<0.05）。綜上，寧杞1號(hào)枸杞健康株根表真菌群落的α多樣性顯著高于患病株，而健康株的3個(gè)樣品中，根際土壤真菌群落的豐富度和多樣性最高。健康株和患病株之間，根表、根際和根圍土壤的細(xì)菌群落Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)和Shannoneven指數(shù)均無顯著差異（P<0.05），即健康株和患病株之間各部位樣品中細(xì)菌豐富度、多樣性和均勻度指數(shù)均無顯著差異。此外，健康株的根表與根際、根圍土壤的細(xì)菌群落豐富度、多樣性和均勻度指數(shù)均有顯著差異（P<0.05），患病株的根表與根際、根圍土壤的細(xì)菌群落豐富度、多樣性和均勻度指數(shù)也均有顯著差異（P<0.05）。

表1 微生物群落的Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index of the microbial communities

2.2 OTU水平的Venn圖比較

健康株和患病株各樣品中16S rDNA“V3+V4”區(qū)和ITS1片段的OTU分析結(jié)果顯示（圖1）：健康株的根表和根際土壤中特有的真菌 OTU數(shù)目多于患病株，根圍土壤中特有的真菌 OTU數(shù)目少于患病株；健康株根表特有的細(xì)菌 OTU數(shù)目多于患病株，根際和根圍土壤中特有的細(xì)菌 OTU數(shù)目少于患病株。綜上，患病株根表特有的真菌和細(xì)菌OTU數(shù)目均少于健康株，該結(jié)果表明患病株根表微生物類群少于健康株根表，患病株根表的微生物多樣性減少。

圖1 基于OTU水平的Venn圖Fig. 1 Venn diagram based on OTU levels

2.3 基于OTU水平的主成分分析

基于 bray_curtis計(jì)算距離的 PCoA分析（圖2A）檢測到寧杞1號(hào)各樣品真菌群落之間的總差異為 37.69%，健康株根表、根際和根圍土壤的真菌群落距離較近，表明健康株根表、根際和根圍部位的物種組成趨于相似，而患病株根表的真菌群落距根際和根圍真菌群落較遠(yuǎn)，即物種組成有一定的差異性。此外，健康株和患病株各相同部位的群落組成也有一定的差異性。由此可見，健康株的各部位土壤真菌群落組成較為相似，根腐病患病株不同部位群落的組成具有一定的差異性。細(xì)菌群落之間的總差異為 51.32%（圖2B），健康株與患病株根表的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，根際和根圍的細(xì)菌群落間坐標(biāo)距離較近，表明其健康株與患病株根際和根圍部位的細(xì)菌群落組成基本一致或相似。由此可見，根腐病患病株和健康株各部位的真菌群落結(jié)構(gòu)差異更大，而患病株和健康株各部位的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)總體差異較小，二者細(xì)菌群落的差異主要在根表部位。

圖2 真菌和細(xì)菌OTU水平的PCoA分析Fig. 2 PCoA analysis of OTU levels in fungi and bacteria

2.4 微生物群落組成分析

2.4.1 真菌群落組成分析

門水平上，真菌群落中子囊菌門（Ascomycota）在所有樣品中均是優(yōu)勢門，平均占比達(dá)75.7%，且患病株不同部位樣品中的豐度均大于健康株的相應(yīng)樣品，其中在患病株根表上豐度最大（94.4%）；被孢霉門（Mortierellomycota）豐度占第二，平均占比14.4%，健康株不同部位樣品中的豐度大于患病株（圖3A），且在根表上的差異最大，健康株根表為24.8%，患病株根表僅為3.6%。屬水平上（圖3B），將每個(gè)樣品中低于1%的物種歸為others，與unclassified和norank一并剔除掉，豐度高于1%的明確物種占47.3%—66.5%。健康株根表的優(yōu)勢真菌依次為Mortierella（24.8%）、Fusarium（11.3%）、Alternaria（7.4%）和Plectosphaerella（2.5%），患病株根表的優(yōu)勢真菌依次為Fusarium（31.5%）、Plectosphaerella（10.1%）、Alternaria（7.2%）和Mortierella（3.6%）?？梢娊】抵旰突疾≈旮淼膬?yōu)勢屬組成無較大差異，但優(yōu)勢屬豐度差異較大?；疾≈旮鞰ortierella的豐度比健康株根表低85.48%，F(xiàn)usarium的豐度高1.79倍，Plectosphaerella高3.04倍，Alternaria的豐度無較大差異。健康株根際土壤中的主要真菌依次為Mortierella（17.8%）、Fusarium（6.2%）、Metarhizium（6.8%）和Lophiotrema（4.9%），患病株的根際土壤中主要真菌為Fusarium（27.3%）、Mortierella（14.2%）、Clonostachys（6.9%）和Plectosphaerella（3.2%），說明健康株和患病株根際土壤中的優(yōu)勢屬組成和豐度差異均較大，患病株根際土壤中Fusarium的豐度比健康株高3.4倍，Mortierella的豐度低20.22%。健康株根圍土壤中的主要真菌為Mortierella（20.9%）、Fusarium（15.7%）、Acaulium（4.9%）和Alternaria（4.5%），患病株根圍土壤的主要真菌為Alternaria（14.1%）、Fusarium（8.6%）、Metarhizium（5.4%）和Mortierella（5.2%），可見健康株和患病株根圍土壤中的優(yōu)勢屬組成無較大變化，但優(yōu)勢屬豐度差異較大。患病株根圍土壤中Mortierella和Fusarium的豐度分別比健康株低75.12%和45.22%，而Alternaria的豐度高2.13倍。健康株和患病株根表的優(yōu)勢真菌占比不同，但其種類未發(fā)生改變；而根際和根圍土壤中的優(yōu)勢真菌占比和種類均有差異。作為優(yōu)勢屬的Fusarium在患病株根表和根際的豐度均高于健康株；Mortierella在健康株根表、根際和根圍的豐度均高于患病株；Alternaria在健康株和患病株根表的豐度幾乎無差別，而在患病株根際和根圍中的豐度均大于健康株；Plectosphaerella在患病株根表和根際土壤中的豐度顯著大于健康株。綜上，門水平上寧杞1號(hào)枸杞根表部位Ascomycota和Mortierellomycota豐度的變化及屬水平上根表部位Fusarium、Mortierella和Plectosphaerella三類重要真菌豐度的變化可能與其根腐病的發(fā)生有重要的關(guān)聯(lián)。

圖3 門水平和屬水平上真菌群落的相對(duì)豐度Fig. 3 Relative abundance of fungal communities at the phylum and genus level

2.4.2 細(xì)菌群落組成分析

變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）是細(xì)菌群落中的優(yōu)勢門（圖4A），平均占比達(dá)86.5%，變形菌門和放線菌門在根表的豐度大于根際和根圍，而綠彎菌門、酸桿菌門和芽單胞菌門在根表的豐度小于根際和根圍。屬水平上，將細(xì)菌群落每個(gè)樣品中豐度均低于1%的物種歸為others，與unclassified和norank一并剔除掉，豐度高于1%的明確物種占15.6%—43.4%（圖4B），其中健康株根表的主要細(xì)菌為Arthrobacter（12.5%）、Mycobacterium（4.9%）、Lelliottia（4.3%）和Stenotrophomonas（2.1%），患病株根表的主要細(xì)菌為Arthrobacter（20.9%）、Lelliottia（4.2%）、Allorhizobium（2.7%）和Mycobacterium（1.9%）?？梢?，健康株和患病株的根表優(yōu)勢細(xì)菌組成和豐度差異較大?；疾≈旮鞟rthrobacter的豐度比健康株根表高67.20%，Mycobacterium的豐度低61.22%，Lelliottia的豐度無較大差異。健康株的主要根際細(xì)菌有Arthrobacter（8.7%）、RB41（3.8%）、Blastococcus（1.8%）和Nitrospira（1.4%），患病株的主要根際細(xì)菌有Arthrobacter（8.2%）、RB41（2.2%）、Nitrospira（1.7%）和Blastococcus（1.3%）?？梢娊】抵旰突疾≈旮H的主要優(yōu)勢屬組成一致，但各豐度稍有差異，患病株根際土壤中RB41的豐度比健康株根際低42.11%，Blastococcus的豐度低27.78%，Nitrospira的豐度高21.43%，Arthrobacter的豐度差異較小。健康株根圍土壤的主要細(xì)菌有Arthrobacter（4.7%）、RB41（1.9%）、Sphingomonas（1.3%）和Nitrospira（1.2%），患病株根圍土壤的主要細(xì)菌有Arthrobacter（6.8%）、Sphingomonas（1.9%）、Nitrospira（4.8%）和MND1（1.4%）。可見，健康株和患病株的根圍優(yōu)勢細(xì)菌組成無較大差異，優(yōu)勢屬豐度差異較大。患病株根圍土壤中Arthrobacter的豐度比健康株根圍高 30.9%，Nitrospira的豐度高3倍，Sphingomonas的豐度高46.15%。健康株和患病株的根際優(yōu)勢細(xì)菌占比稍有不同，組成基本一致；健康株和患病株根表與根圍的優(yōu)勢細(xì)菌組成和占比均不一致。細(xì)菌群落中，健康株和患病株根表優(yōu)勢屬Arthrobacter和Lelliottia的豐度遠(yuǎn)大于根際和根圍，且Arthrobacter在患病株根表的豐度顯著大于健康株，提示根表Arthrobacter豐度的變化可能與寧杞 1號(hào)枸杞根腐病的發(fā)生也有一定的關(guān)系。

圖4 門水平和屬水平上細(xì)菌群落的相對(duì)豐度Fig. 4 Relative abundance of bacterial communities at the phylum and genus Level

2.5 屬水平上LEfSe物種差異分析

LEfSe使用 non-parametric factorial Kruskal-Wallis sum-rank test（非參數(shù)因子克魯斯卡爾—沃利斯秩和驗(yàn)檢）檢測具有顯著豐度差異特征，然后進(jìn)行線性判別分析（LDA）來明確具有顯著豐度差異特征的物種。真菌群落（圖5A）的LDA分析（LDA>3，P<0.05） 表 明 unclassified_f_Didymellaceae、Ilyonectria、Mortierella、Lophiotrema和unclassified_k_Fungi的豐度分別對(duì)患病株根表、根際和健康株根表、根際、根圍差異效果影響最大。細(xì)菌群落（圖5B）的LDA分析（LDA>3.5，P<0.05）表明Allorhizobium、g_unclassified_f_Enterobacteriaceae、MND1、RB41、norank_f_Gemmatimonadaceae、norank_c_Gitt_GS_136的豐度分別對(duì)患病株根表、健康株根表、患病株根際、健康株根際、健康株根圍差異效果影響最大。屬水平上，患病株和健康株的各樣品中存在顯著豐度差異的物種各不相同，其中，優(yōu)勢屬M(fèi)ortierella是健康株根表具有顯著豐度差異特征的物種。

圖5 屬水平的LDA判別結(jié)果圖Fig. 5 LDA discriminant result chart of genus level

2.6 微生物功能預(yù)測

為探究患病株和健康株的微生物群落在功能分布上的差異，利用PICRUSt2對(duì)細(xì)菌群落進(jìn)行功能預(yù)測（圖6），將預(yù)測結(jié)果與 KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)比發(fā)現(xiàn)，所有的細(xì)菌群落功能預(yù)測共有新陳代謝、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、細(xì)胞過程、有機(jī)系統(tǒng)和與人類疾病有關(guān)的六大類。其中，屬于新陳代謝的功能豐度占比最大，主要以碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素的代謝、核苷酸代謝、脂類代謝為主。其次為屬于環(huán)境信息處理的膜運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)，以及屬于遺傳信息處理的翻譯、復(fù)制和修復(fù)機(jī)制等?；疾≈旰徒】抵旮淼墓δ茇S度大于根際和根圍，且患病株根表的功能豐度大于健康株，這可能與根表微生物靠近植株、微生物與植株之間的相互作用較多有關(guān)。

圖6 細(xì)菌群落的功能預(yù)測Fig. 6 Function prediction of bacterial community

根據(jù) FUNGuild功能預(yù)測可獲得樣品中真菌的功能分類及各功能分類在不同樣品中的豐度信息（圖7）。根據(jù)營養(yǎng)獲取方式將真菌分為三大類：病理營養(yǎng)型、共生營養(yǎng)型和腐生營養(yǎng)型，基于這 3種營養(yǎng)方式，將對(duì)環(huán)境資源的吸收利用采取相似方式的劃分為同一個(gè)guilds。屬于Animal Pathogen-Endophyte-Lichen Parasite-Plant Pathogen-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph和Plant Pathogen這兩個(gè)類群的功能豐度較高，這兩個(gè)類群分別屬于腐生營養(yǎng)型和病理營養(yǎng)型，其中Animal Pathogen- Endophyte-Lichen Parasite-Plant Pathogen-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph對(duì)應(yīng)的真菌只有Fusarium，Plant Pathogen對(duì)應(yīng)的真菌有Plectosphaerella、Clonostachys、Lectera等。兩個(gè)類群在患病株根表的功能豐度（26223）和根際的功能豐度（21779）遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于健康株根表的功能豐度（8330）和根際的功能豐度（4547），在患病株根圍部位的功能豐度（5174）的豐度小于健康株的根圍功能豐度（9445）。

圖7 真菌群落的功能預(yù)測Fig. 7 Function prediction of fungal community

3 討論

土壤中的微生物與植物的土傳病害關(guān)系密切（Bakker et al.，2010；郭瑞英等，2005），微生物群落失衡會(huì)導(dǎo)致植物感病，植株在感染病原菌后，微生物群落結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化（Jeannotte et al.，2005）。本研究發(fā)現(xiàn)，患病株根表的真菌群落多樣性低于健康株，這與根腐病引起的三七根際土壤真菌多樣性變化一致（Wuet al.，2015）；健康株和患病株根表、根際和根圍細(xì)菌群落的豐富度、多樣性和均勻度均無顯著差異，而針對(duì)黃芪根腐病的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)病程度與根圍土壤細(xì)菌群落的多樣性呈正相關(guān)（閆歡等，2020），由此可見，根腐病發(fā)生與土壤微生物群落之間的關(guān)聯(lián)不僅和植物類型有關(guān)，也可能與發(fā)病程度有關(guān)。一些研究表明病原真菌的積累是黃連根腐病發(fā)生的重要原因之一（陳姍姍等，2018），此外，建立在土壤和植物根系上的真菌群落似乎更容易受到隨機(jī)因素的影響（Ylvaet al.，2011；Wanget al.，2013；Peayet al.，2010）。根系分泌物是植物與土壤微生物群落相互作用的關(guān)鍵介質(zhì)（Vives-Periset al.，2020），健康株和患病株根表的真菌群落多樣性差異大可能是根系分泌物所引起的。根系分泌物為植株和植物根系共生微生物形成了獨(dú)特的生存微環(huán)境，這些微生物相當(dāng)于植物與土壤的聯(lián)系紐帶，當(dāng)靠近植株的微生物群落發(fā)生變化的時(shí)候，植株首先會(huì)感知到并釋放分泌物，不同微生物會(huì)對(duì)植物根系釋放的化合物有不同的反應(yīng)（Bertrandet al.，2001）。

分析門水平和屬水平上真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成發(fā)現(xiàn)，真菌群落中子囊菌門是絕對(duì)的優(yōu)勢門，F(xiàn)usarium、Mortierella和Alternaria是主要的優(yōu)勢屬，其中Mortierella在患病株 3個(gè)部位的平均豐度（7.67%）小于健康株（21.19%）。Mortierella是土壤中常見的有益微生物，與土壤肥力密切相關(guān)，能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，改善土壤健康狀況，并有效促進(jìn)植株的生長（Liet al.，2018），可能具有生防功能。這可能是Mortierella在健康株中的豐度較高的原因之一。Fusarium是子囊菌門的一類，是苜蓿（楊劍鋒等，2020）、豌豆（Chittem et al.，2015）、大豆（Arias et al.，2013）和馬鈴薯（楊波等，2019）等多種作物根腐病的致病菌，李捷（2017）在甘肅枸杞根際土壤中也分離到了Fusarium且確定為致病菌。枸杞是多年生作物，產(chǎn)業(yè)化種植過程中，土壤一般都是單作土壤，極其容易造成土壤的同質(zhì)性，這樣就更容易導(dǎo)致更多潛在病原菌的累積，例如隸屬于子囊菌門的Fusarium，本研究結(jié)果提示鐮刀菌可能也是寧夏枸杞根腐病的主要致病菌之一。Alternaria同樣被認(rèn)為是造成作物病害的一種病原菌（高芬等，2008），多在植株葉斑或果實(shí)（Song et al.，2020；王彩霞等，2019；周園園等，2019）上分離得到，在枸杞上主要會(huì)引起枸杞干果霉變（岳苑等，2019），但還未有研究證實(shí)其為枸杞根腐病的致病菌。Arthrobacter是土壤中較為常見的細(xì)菌，其作為優(yōu)勢屬在根表豐度最大且患病株根表的豐度大于健康株，在西洋參根腐病（蔣景龍等，2018）相關(guān)的群落變化研究中同樣發(fā)現(xiàn)Arthrobacter節(jié)桿菌為優(yōu)勢屬，與本研究有結(jié)果一致，推測其與寧杞1號(hào)根腐病的發(fā)生有一定的相關(guān)性。健康株和患病株的各樣品有顯著豐度差異的物種均不相同，產(chǎn)生這種差異的原因以及該差異與植株的關(guān)系值得研究。本研究中真菌群落結(jié)構(gòu)的變化比細(xì)菌群落更為顯著，而造成根腐病的主要病原菌多為真菌，因此，盡量限制真菌的傳播，構(gòu)建穩(wěn)定的真菌群落非常重要，有利于從源頭上控制根腐病的發(fā)生，益生微生物之間還可以相互“配合”，通過協(xié)同作用最大限度地獲取土壤以及宿主體內(nèi)的養(yǎng)分，促進(jìn)植物的生長。

PICRUSt2分析得到新陳代謝、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理等六大類功能以及 46個(gè)二級(jí)功能，其中新陳代謝類的功能豐度較大，這與楊盼等（2020）對(duì)苜蓿根際土壤細(xì)菌群落功能預(yù)測分析的研究結(jié)果一致，這可能與植株的分泌物有關(guān)（Shiet al.，2011）。利用FUNGuild預(yù)測真菌群落的功能，結(jié)果表明屬于腐生營養(yǎng)型的 Animal Pathogen-Endophyte-Lichen Parasite-Plant Pathogen-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph和Plant Pathogen這兩個(gè)類群的功能豐度較高，其中Fusarium較高的功能豐度與其在群落組成中較高的豐度相對(duì)應(yīng)，且患病株根表和根際的豐度大于健康株，功能分析進(jìn)一步說明Fusarium可能是枸杞的關(guān)鍵致病菌。Plectosphaerella在三七（Hanet al.，2020）中首次被證明為致病菌，其會(huì)不會(huì)引起枸杞根腐病的發(fā)生有待進(jìn)一步驗(yàn)證；而有益菌屬M(fèi)ortierella在健康株根表、根際和根圍土壤的豐度均高于患病株，且并未在腐生營養(yǎng)型這個(gè)分類中，說明真菌群落組成和結(jié)構(gòu)差異可能引起了其功能上的差異，進(jìn)一步引起群落結(jié)構(gòu)的失衡，最終可能導(dǎo)致寧杞1號(hào)根腐病的發(fā)生。

4 結(jié)論

患病株根表的真菌多樣性顯著低于健康株，而健康株和患病株根際、根圍土壤的真菌多樣性及根表、根際和根圍土壤的細(xì)菌多樣性差異不顯著。Fusarium、Alternaria與Mortierella為寧杞1號(hào)枸杞根表、根際和根圍土壤中的主要真菌群落，其中患病株根表和根際的Fusarium豐度最大，患病株根圍的Mortierella豐度最大，健康株各部位的Mortierella豐度較大。細(xì)菌群落中變形菌門、放線菌門、綠彎菌門豐度較高，優(yōu)勢屬Arthrobacter在患病株根表的豐度顯著高于健康株。真菌群落中Fusarium的功能豐度最高，且Fusarium在患病株根表和根際的功能豐度大于健康株，與相應(yīng)的物種組成豐度相一致，說明Fusarium可能是枸杞根腐病的關(guān)鍵致病菌。細(xì)菌群落中參與新陳代謝的功能豐度最大，患病株根表細(xì)菌的功能豐度大于健康株根表?；谌郝浣M成與功能預(yù)測的分析共同說明了寧杞1號(hào)根腐病患病株根表的真菌多樣性顯著低于健康株，子囊菌門的Fusarium是患病株根表和根際的優(yōu)勢類群且功能豐度最大。