郭珊珊，劉繼紅

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科，云南 昆明 650101）

在正常情況下，女性陰道內(nèi)微生物群落主要由乳酸桿菌組成，它能維持陰道的酸性環(huán)境，有抑菌保護(hù)作用[1?2]，與其他細(xì)菌共同形成了一個(gè)相對(duì)平衡的群落。孕期由于雌激素增多、免疫力低下等生理環(huán)境及結(jié)構(gòu)的變化[3]，陰道菌群失衡，易引起各種陰道炎，如細(xì)菌性陰道?。╞acterial vaginosis，BV）、霉菌性陰道炎等疾病[4]。這些致病菌上行感染易導(dǎo)致胎膜早破（premature rupture of membranes，PROM）、早產(chǎn)、絨毛膜羊膜炎等不良妊娠結(jié)局。孕期陰道炎以BV 對(duì)妊娠結(jié)局影響最為嚴(yán)重，且多為無(wú)癥狀感染者，增加了孕期臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)的難度。目前臨床上越來越多的人重視BV 與PROM、早產(chǎn)等不良妊娠的研究，這也是產(chǎn)科研究的熱門課題[5]。陰道微生物群落以厭氧菌居多，培養(yǎng)困難，因此通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法很難全面認(rèn)識(shí)陰道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)[6?7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，第2 代高通量測(cè)序技術(shù)越來越多的被用于微生物群落的研究，它能更全面、更準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)陰道菌群結(jié)構(gòu)[8]，為全面分析孕期陰道菌群結(jié)構(gòu)提供了可能。因此本文利用Illumina 高通量測(cè)序技術(shù)，通過對(duì)比分析胎膜早破與正常妊娠孕婦陰道菌群結(jié)構(gòu)，以期對(duì)預(yù)防和治療胎膜早破提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)收集2020 年1 月至2020 年12 月在昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院分娩的孕周 <28 周；28～34 周；34～37 周；37～39 周；39～41 周各10 例共50 例胎膜早破者為試驗(yàn)組（TMZPZ）；隨機(jī)選取符合納入標(biāo)準(zhǔn)的30 例正常妊娠為對(duì)照組（Control），其中未足月胎膜早破30 例（PPROM）、未足月正常組18 例（WZY）、足月胎膜早破組20例（PROM）、足月正常組12 例（ZY）。年齡平均范圍：28.7～30.6（29.64±0.48）歲，參與本研究的所有患者均簽署知情同意書，并獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：審-PJ-2019-50）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)[9]（1）單胎妊娠；（2）昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院常規(guī)產(chǎn)檢、分娩的孕婦；（3）選取經(jīng)臨床診斷為胎膜早破的為實(shí)驗(yàn)組；（4）陰道分泌物分析（細(xì)菌）白帶清潔度I°～I(xiàn)I°、陰道分泌物培養(yǎng)陰性的且胎膜完整的為正常對(duì)照組。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)[9]（1）雙胎妊娠；（2）有生殖道畸形的孕婦（如雙子宮、縱膈子宮畸形等）；（3）合并妊娠期內(nèi)外科感染相關(guān)性疾病；（4）患急慢性傳染病的孕婦；（5）近1 月應(yīng)用抗生素、免疫抑制劑或陰道局部用藥者；（6）近3 d 做過婦檢或陰道B 超、陰道沖洗、近3 d 有性生活等；（7）資料缺失及中途退出研究。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本的采集簽署知情同意書后，嚴(yán)格消毒后，由產(chǎn)科醫(yī)師用窺陰器窺開陰道，用無(wú)菌棉拭子在陰道后穹窿分別提取陰道分泌物，分別放置在3 個(gè)無(wú)菌試管中，并進(jìn)行分組、編號(hào)、保存及送檢。

1.3.2 陰道分泌物分析及微生物DNA 提取其中2 個(gè)陰道分泌物樣本送至本院檢驗(yàn)科行常規(guī)分析，另一樣本送昆明漢嶺生物科技有限公司，利用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit 試劑盒完成樣本微生物DNA 提取、檢測(cè)。

1.4 高通量測(cè)序

利用細(xì)菌16 s rDNA V3+V4 區(qū)域通用引物對(duì)16 s rDNA 基因可變區(qū)（V3+V4）采用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。純化、質(zhì)控后使用MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行2×300 bp 的雙端測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對(duì)原始的下機(jī)數(shù)據(jù)拆分、拼接、過濾、有效數(shù)據(jù)去噪等，獲得最終的feature 特征表[10]。根據(jù)feature 注釋結(jié)果，利用SILVA（Release 132，https://www.arb-silva.de/documentation/release-132/）以及NT-16S 數(shù)據(jù)庫(kù)做物種分類及后續(xù)分析。利用豐富度、均勻度指數(shù)、非度量多維尺度分析描述陰道菌群的Alpha 多樣性及Beta 多樣性分析，最后在門、屬、種水平等級(jí)分析陰道菌群結(jié)構(gòu)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 樣品序列統(tǒng)計(jì)和稀釋曲線

通過對(duì)80 例孕婦資料收集，孕婦年齡為28.7～30.6 歲，均為云南本地育齡女性，其中少數(shù)民族16 人，漢族54 人，初產(chǎn)婦55 人，經(jīng)產(chǎn)婦25 人，經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)年齡、民族、產(chǎn)次等基線資料對(duì)陰道菌群結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響，主要結(jié)合陰道菌群的變化進(jìn)行研究討論。

通過對(duì)80 例樣本進(jìn)行測(cè)序質(zhì)控后最終得到6281086 條序列。根據(jù)稀釋曲線提示樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是合理的，見圖1、圖2。

圖1 胎膜早破組與對(duì)照組稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of TMZPZ group and Control group

圖2 足月/未足月胎膜早破組與足月/未足月對(duì)照組稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curve of PPROM，WZY，PROM and ZY group

2.2 陰道微生物群落的多樣性

胎膜早破組及對(duì)照組在物種豐富度及均勻度指數(shù)秩和檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；因此，對(duì)于以上各分組Alpha 多樣性均不顯著，也表明各分組菌群結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，見表1。

表1 各分組豐富度及均勻度指數(shù)的多樣性分析Tab.1 Diversity analysis of the richness and evenness indices of each grouping

根據(jù)OTUs 數(shù)各分組樣本的微生物群落非度量多維尺度分析（nonmetric multidimensional scaling，NMDS），見圖3、圖4。各組stress=0.02，小于0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明各分組之間物種有顯著差異，具有Beta 多樣性。

圖3 胎膜早破與對(duì)照組的微生物群落非度量多維尺度分析Fig.3 The NMDS of TMZPZ and Control group

圖4 未足月/足月胎膜早破組與未足月/足月對(duì)照組的微生物群落非度量多維尺度分析Fig.4 The NMDS of PPROM，WZY，PROM and ZY group

2.3 陰道微生物群落結(jié)構(gòu)

2.3.1 在門、屬水平等級(jí)胎膜早破組與正常對(duì)照組物種組成分析在門水平，TMZPZ 與control 組主要菌群均以厚壁菌門（Firmicutes）為主（相對(duì)豐度 >75%），TMZPZ 中放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Fusobacteria）明顯增加，見圖5。在屬水平等級(jí)，TMZPZ 組、Control 組均以乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為主要優(yōu)勢(shì)菌，但TMZPZ 中陰道菌群種類明顯增多，乳酸桿菌屬相對(duì)豐度明顯降低但仍大于 75%；TMZPZ 組加德納菌屬（Gardnerella）、纖毛菌屬（Sneathia）、變異菌屬（Atopobium）、脲原體屬（Ureaplasma）、普氏菌屬（Prevotella）等明顯增多，見圖6。

圖6 胎膜早破組與對(duì)照組在屬水平等級(jí)微生物物種組成Fig.6 Microbial species composition at genus level of TMZPZ and Control

2.3.2 在種等級(jí)水平各分組的物種分析本研究陰道微生物群落總體結(jié)構(gòu)可分為五種主要的微生物群落結(jié)構(gòu)類型（community state type，CSTs），其中四種以不同的乳桿菌為優(yōu)勢(shì)，如卷曲乳酸桿菌（L.crispatus）、格氏乳酸桿菌（L.gasseri）、惰性乳酸桿菌（L.iners）和詹氏乳酸桿菌（L.jessenii），分別在 CSTⅠ、CSTⅡ、CSTⅢ和 CSTⅤ中占主導(dǎo)地位。該研究結(jié)果主要以CSTⅠ為主，其次為CSTⅢ、CSTIV-B，CST V、CST II 所占比例很少，見圖7。

圖7 樣本在種水平等級(jí)上的微生物群落類型聚類圖Fig.7 Cluster diagram of microbial community types at species level

TMZP 組中檢測(cè)的物種數(shù)目比control 組高；其中PPROM 的物種多樣性最高，為529 個(gè)；WZY組的多樣性最低，為207 個(gè)，見圖8。

圖8 樣本微生物群落在種水平分布維恩圖Fig.8 Venn diagram of sample microbial community distribution at species level

TMZPZ 組與control 組在種水平等級(jí)物種最為豐富物種為卷曲乳桿菌、惰性乳桿菌、詹氏乳桿菌、加德納菌類等，2 組均以卷曲乳酸桿菌為主要優(yōu)勢(shì)菌，但TMZPZ 組中卷曲乳酸桿菌相對(duì)豐度明顯降低，而惰性乳酸桿菌、加德納菌等明顯增多，見圖9。

圖9 胎膜早破組與對(duì)照組的Circos 圖Fig.9 Circos diagram of TMZPZ and control group

3 討論

利用第2 代高通量測(cè)序技術(shù)本研究發(fā)現(xiàn)，孕期無(wú)論是正常還是胎膜早破孕婦陰道菌群均呈現(xiàn)一種低Alpha 多樣性的狀態(tài)，但Beta 多樣性顯著。既往MacIntyre 等[9]學(xué)者表示，孕期陰道菌群呈現(xiàn)一種低Alpha 多樣性和乳酸桿菌為優(yōu)勢(shì)的菌群狀態(tài)，并且菌群穩(wěn)定性較高。Xinyuan Liang 等[11]通過研究也發(fā)現(xiàn)隨著妊娠的進(jìn)展，陰道微生物群的Beta 多樣性顯著增加。本研究結(jié)果與上述學(xué)者一致。根據(jù)維恩圖可知胎膜早破組陰道菌群更具多樣性，其中未足月胎膜早破組的物種多樣性最高；未足月正常對(duì)照組的多樣性最低，而足月比未足月正常妊娠的物種數(shù)更有多樣性。此前有研究也顯示，孕32 周以后陰道菌群復(fù)雜性與胎齡呈正相關(guān)，增加至分娩前[11]，因此，足月正常妊娠陰道菌群更具多樣性，與筆者所得結(jié)論一致，這是正常的陰道微生態(tài)變化。而在胎膜早破組中，未足月胎膜早破者陰道菌群多樣性最大，筆者推測(cè)此時(shí)期出現(xiàn)足月陰道微生態(tài)變化即為異常狀態(tài)，易引發(fā)BV，導(dǎo)致PPROM，這有待更多研究證實(shí)。

通過研究發(fā)現(xiàn)妊娠期陰道微生物群落類型主要為5 種，以CSTⅠ為主，CSTⅢ及CSTⅣ次之，而CSTⅤ、CSTⅡ所占比例很少。這與上述MacIntyre 等[9]提出的孕期陰道微生物群落以CSTⅠ為主的觀點(diǎn)一致，但與Romero 等[3]提出的CSTⅢ為主不一致。Hyman 等[12]指出種族對(duì)孕期陰道微生物群落有影響。本研究的結(jié)果與上述學(xué)者不一致是否與種族有關(guān)有待研究。有研究發(fā)現(xiàn)[13]CSTⅣ可分為CSTⅣ-A、CSTⅣ-B 兩種類型，其中CSTⅣ-A 中惰性乳酸桿菌占比較高，而CSTⅣ-B 中加德納菌、奇異菌、普氏菌、纖毛菌等較多，CSTⅣ-B 增多與BV 有關(guān)，而BV 易引發(fā)胎膜早破，故本研究CST Ⅳ-B 的增多，多考慮與胎膜早破相關(guān)。

眾所周知，乳酸桿菌是革蘭陽(yáng)性菌也是厭氧菌，它在預(yù)防泌尿生殖系統(tǒng)感染如BV、霉菌感染等起著至關(guān)重要的作用[14?15]。其中卷曲乳酸桿菌可產(chǎn)生大量H2O2，而惰性乳酸桿菌產(chǎn)生H2O2的量很少，H2O2可殺死致病菌，對(duì)維持陰道內(nèi)環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡起著重要作用[16]。Rinku Pramanick[17]表示無(wú)癥狀的BV 婦女的陰道內(nèi)卷曲乳桿菌的減少，易使陰道微生態(tài)穩(wěn)定性降低；來自南非的研究也表明卷曲乳桿菌與女性正常陰道微生態(tài)關(guān)系密切[18]。上述表明卷曲乳桿菌能維持陰道正常菌群微生態(tài)，并且能抵抗BV 的發(fā)生。本研究顯示孕婦陰道內(nèi)以卷曲乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌，不同的是在胎膜早破組中卷曲乳桿菌明顯減少，而惰性乳桿菌、各種厭氧菌等明顯增多。惰性乳桿菌不易產(chǎn)生乳酸、H2O2[19]，它對(duì)陰道內(nèi)的保護(hù)作用很小，而且它有些特征類似于加德納菌[20]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)孕期陰道內(nèi)加德納氏菌、普氏菌、纖毛菌等厭氧菌增多，會(huì)使乳酸桿菌減少，并與BV 相關(guān)[11]。這些異常增多的細(xì)菌易發(fā)生胎膜早破[21]。Liang Xinyuan 等[11]提出孕晚期陰道使用益生菌可能有助于調(diào)節(jié)陰道菌群。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)與BV 相關(guān)的菌群更容易引起早期早產(chǎn)而不是晚期早產(chǎn)[22]。對(duì)于妊娠早期，特別是妊娠前3 個(gè)月陰道內(nèi)菌群的多樣性及豐富度是關(guān)系后期足月和早產(chǎn)的關(guān)鍵時(shí)間段[23]。妊娠早期陰道菌群的研究可能是預(yù)防妊娠晚期發(fā)生胎膜早破、早產(chǎn)等的關(guān)鍵。因此，孕早期治療BV 或預(yù)防性補(bǔ)充陰道益生菌，增加陰道內(nèi)乳酸桿菌的量，維持陰道內(nèi)酸性環(huán)境，減少惰性桿菌、加德納菌、纖毛菌、奇異菌等細(xì)菌的異常增多是否可以避免或減少孕晚期胎膜早破、早產(chǎn)、母嬰感染的發(fā)生，從而改善胎兒的妊娠結(jié)局，這將是筆者后續(xù)研究的方向。