王曉珍，劉 錄，吳安超，王鉞涵，周志宏，楊竹雅

（云南中醫(yī)藥大學(xué)云南省高校中藥飲片工程研究中心，云南 昆明 650500）

頭頂一顆珠，為百合科（Liliaceae）延齡草屬（Trillium L.）多年生草本植物延齡草（Trillium tschonoskiiMaxim.）的干燥根莖，又名芋兒七、佛手七等，是土家族民族民間習(xí)用四大神藥之一。該藥性溫，味甘、微辛，有小毒，具有鎮(zhèn)靜、止痛、活血、止血的功效，主要用于治療眩暈頭痛、神經(jīng)衰弱、腰腿疼痛、月經(jīng)不調(diào)等病癥[1]。

目前從頭頂一顆珠中分離得到的化合物約90 個(gè)，以甾體皂苷為主，包括延齡草皂苷、偏諾皂苷、薯蕷皂苷和克里托皂苷等，此外還含有黃酮苷、倍半萜苷、苯丙素苷、多糖等[2]。現(xiàn)代研究表明頭頂一顆珠具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)心臟功能和免疫調(diào)節(jié)等作用[3?8]。

作者對云南產(chǎn)頭頂一顆珠化學(xué)成分研究表明，其富含偏諾皂苷元類型甾體皂苷，此類皂苷具有止血及收縮子宮平滑肌作用，但未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。云南部分彝族地區(qū)民間醫(yī)生使用本品治療產(chǎn)后出血。本文報(bào)道頭頂一顆珠對子宮平滑肌的收縮作用，并對其活性部位進(jìn)行初步化學(xué)成分分析，為充分開發(fā)利用頭頂一顆珠提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 儀器BL-420F 型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），SQG-4 型四腔器官浴槽系統(tǒng)（成都儀器廠），HH-S25 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市大地自動(dòng)化儀器廠），AB204-S 型電子分析天平（瑞士Mettlertoledo 公司），BS110S 型賽多利斯電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。Bruker AM-400AM-500 Spectrometer 核磁共振儀，VG Autospec 3000 system spectrometer 質(zhì)譜儀。薄層硅膠G 和色譜柱硅膠（青島海洋化工廠），Sephadex LH-20（GE Healthcare 公司），MCI（日本三菱公司）。

1.1.2 試劑宮血寧膠囊（云南白藥集團(tuán)股份有限公司，規(guī)格0.13 g/每粒，產(chǎn)品批號ZMA1402），己烯雌酚（天津金耀氨基酸有限公司，規(guī)格1 mL：0.5 mg，批號0204281）。試劑均為化學(xué)純。

1.1.3 動(dòng)物健 康成年雌性未孕SD 大鼠46 只，體重200～230 g，昆明楚商科技有限公司提供。

1.1.4 材料試驗(yàn)用藥材樣品于2018 年9 月采自云南華坪縣（栽培品），由云南省藥物研究所趙仁主任藥師鑒定為百合科延齡草屬植物延齡草Trillium tschonoskiiMaxin 的干燥根莖。

1.2 方法

1.2.1 頭頂一顆珠樣品制備取2 kg 干燥延齡草，經(jīng)適當(dāng)粉碎，用10 倍量70%乙醇冷浸提取5 次，36、24、24、12、12 h/次，合并提取液，減壓回流得總浸膏；浸膏加水10 L，攪拌，靜置，過濾，沉淀用5 L 水洗滌，干燥，得沉淀70.5 g（F0）；洗滌液與濾液合并，經(jīng)大孔吸附樹脂層析，以乙醇-水（0∶100～40∶60）梯度洗脫，濃縮得F1～F5段，以乙醇-水（70∶30）梯度洗脫，濃縮得F6段。

1.2.2 動(dòng)物分組46 只雌性大鼠隨機(jī)分為7 組，每組至少6 只，分別為：陽性組（宮血寧膠囊）、F1～F6組。

1.2.3 正常大鼠離體子宮平滑肌條的制備[9?10]試驗(yàn)前2 d 取大鼠，腹腔注射己烯雌酚0.1 mg/kg 一次，復(fù)制動(dòng)情期大鼠模型。試驗(yàn)時(shí)，頸椎脫臼處死大鼠，剖腹取出子宮，立即置于盛有任-洛氏液（取NaCl 9.0 g、KCl 0.42 g、CaCl20.24 g、NaHCO30.15 g、葡萄糖1.0 g，用生理鹽水制備成1 000 mL 的溶液，即得）的玻璃培養(yǎng)皿中，通氧。小心剝離附于子宮壁上的結(jié)締組織和脂肪組織，將兩側(cè)子宮平滑肌剪成長度1 cm 的小段，備用。每段子宮肌條的兩端分別用線結(jié)扎，一端固定于放入通有氧氣（速度為1～2 個(gè)氣泡/s）盛有任-洛氏液20 mL 的浴槽中，保持浴槽中的營養(yǎng)液溫度為（37±0.5）℃，另一端與張力傳感器相連。離體子宮平滑肌條靜息后，調(diào)節(jié)負(fù)重1 g，平衡30 min，待子宮平滑肌條收縮平穩(wěn)后開始試驗(yàn)。

1.2.4 延齡草不同餾分對離體子宮平滑肌條的影響記錄子宮平滑肌正常曲線，而后按濃度梯度依次向浴槽中分別累積加入陽性藥物（宮血寧膠囊）和F1～F6各餾分組，使終濃度為：1×10-7g/mL、3×10-7g/mL、1×10-6g/mL、3×10-6g/mL、1×10-5g/mL、3×10-5g/mL、1×10-4g/mL，制作累積曲線。每次加入受試藥物后，觀察10 min 內(nèi)子宮平滑肌的收縮情況，之后用任-洛氏液沖洗3 次，穩(wěn)定10 min 后加入另一受試藥物進(jìn)行觀察。給藥后，觀察離體子宮平滑肌的收縮頻率（次/10 min）；收縮強(qiáng)度，以每次收縮所達(dá)到的最高點(diǎn)（g）表示的變化；收縮活動(dòng)力（收縮強(qiáng)度×收縮頻率）。試驗(yàn)重復(fù)6 次。

1.2.5 頭頂一顆珠活性部位化學(xué)成分分離F6段用經(jīng)硅膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇（7∶1-1∶1）為溶劑洗脫，經(jīng)硅膠柱色譜（三氯甲烷-丙酮）、MCI（水-甲醇）和Sephadex LH-20（甲醇）反復(fù)純化得化合物1（0.2 g）、2（0.3 g）和化合物3（0.4 g）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試藥對大鼠離體子宮收縮頻率（次/10 min）的影響

受試藥F2～F5在所試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)對大鼠離體子宮平滑肌收縮頻率無影響（P>0.05）。F6在濃度1×10-5g/mL、3×10-5g/mL、1×10-4g/mL 時(shí)，與給藥前相比，均能顯著增加大鼠離體子宮平滑肌收縮頻率（P<0.05）。陽性藥物宮血寧膠囊的濃度在3×10-5g/mL、1×10-4g/mL 時(shí)，能顯著增加大鼠離體子宮平滑肌收縮頻率（P<0.05）。此外F1在3×10-5g/mL 和1×10-4g/mL 濃度梯度下能夠顯著降低大鼠離體子宮平滑肌收縮頻率（P<0.05），見表1。

表1 受試藥對大鼠離體子宮收縮頻率（次/10 min）的影響（）Tab.1 The effect of the medicine on the frequency of isolated rat uterine contractions（times/10 min）（）

表1 受試藥對大鼠離體子宮收縮頻率（次/10 min）的影響（）Tab.1 The effect of the medicine on the frequency of isolated rat uterine contractions（times/10 min）（）

與給藥前相比，△P <0.05，*P <0.01。

2.2 受試藥對大鼠離體子宮收縮強(qiáng)度（g）的影響

F6濃度增加到1×10-4g/mL 時(shí)，與給藥前相比，能夠顯著增加大鼠離體子宮平滑肌收縮強(qiáng)度（P<0.05），表明該部位為延齡草影響大鼠離體子宮收縮強(qiáng)度的主要活性部位。陽性藥物宮血寧膠囊的濃度在1×10-4g/mL 時(shí)，能顯著增加大鼠離體子宮平滑肌收縮頻率（P<0.05）。此外，受試藥F4在3×10-5g/mL、1×10-4g/mL 時(shí)表現(xiàn)為降低大鼠離體子宮平滑肌收縮頻率（P<0.05），見表2。

表2 受試藥對大鼠離體子宮平滑肌收縮強(qiáng)度（g）的影響（）Tab.2 The effect of the medicine on the contraction strength（g）of rat uterine smooth muscle in vitro（）

與給藥前相比，△P <0.05，*P <0.01。

2.3 受試藥對大鼠離體子宮平滑肌活動(dòng)力的影響

F6濃度增加到1×10-5g/mL、3×10-5g/mL、1×10-4g/mL 時(shí)，與給藥前相比，能夠顯著增加大鼠離體子宮平滑肌活動(dòng)力（P<0.05），表明該部位為延齡草影響大鼠離體子宮收縮活動(dòng)力的主要活性部位。陽性藥物宮血寧膠囊的濃度在3×10-5g/mL、1×10-4g/mL 時(shí)，能顯著增加大鼠離體子宮平滑肌活動(dòng)力（P<0.05）。而受試藥F1在1×10-4g/mL 時(shí)表現(xiàn)出降低大鼠離體子宮平滑肌活動(dòng)力（P<0.05），見表3。

表3 受試藥對大鼠離體子宮平滑肌活動(dòng)力的影響（）Tab.3 The effect of the medicine on the motility of isolated rat uterine smooth muscle（）

表3 受試藥對大鼠離體子宮平滑肌活動(dòng)力的影響（）Tab.3 The effect of the medicine on the motility of isolated rat uterine smooth muscle（）

與給藥前相比，△P<0.05，*P<0.01。

2.4 延齡草活性部位F6 化學(xué)成分分析

采用薄層色譜法，以乙酸乙酯-丙酮-水（3∶2∶0.4）為展開劑，10%硫酸乙醇為顯色劑，顯示F0和F6成分基本一致，有三個(gè)主要成分，且這三個(gè)主要成分在F1-F5中均未檢出。通過對F6餾分進(jìn)行化學(xué)成分分離，得到這三個(gè)主要成分，經(jīng)波譜解析，化合物數(shù)據(jù)如下：

化合物1：白色針晶。1H-NMR（C5D5N，500 MHz）δ：0.67（3H，d，J=5.8 Hz，H-27），0.93（3H，s，H-18），1.08（3H，s，H-19），1.22（3H，d，J=7.2 Hz，H-21），5.26（1H，brd，J=5.0 Hz，H-6），1.76（3H，d，J=6.2 Hz，2'-ORha-H-6），4.98（1H，brd，Glc-H-1），6.37（1H，brd，2'-O-Rha-H-1）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：37.6（C-1），30.5（C-2），78.3（C-3），39.0（C-4），140.9（C-5），121.8（C-6），32.5（C-7），32.4（C-8），50.3（C-9），37.2（C-10），21.0（C-11），31.9（C-12），45.2（C-13），53.1（C-14），32.1（C-15），90.0（C-16），90.2（C-17），17.2（C-18），19.5（C-19），44.8（C-20），9.8（C-21），109.9（C-22），31.9（C-23），28.8（C-24），30.2（C-25），66.7（C-26），17.4（C-27）；3-O-Glc：100.3（C-1），79.7（C-2），78.3（C-3），71.8（C-4），78.3（C-5），62.7（C-6）；2'-O-Rha：102.1（C-1），72.9（C-2），72.6（C-3），74.2（C-4），69.5（C-5），18.7（C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，化合物1 鑒定為（25S）-偏諾皂苷元-3-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物2：白色針晶。1H-NMR（C5D5N，500 MHz）δ：0.68（3H，d，J=5.4 Hz，H-27），0.95（3H，s，H-18），1.07（3H，s，H-19），1.22（3H，d，J=7.2 Hz，H-21），5.29（1H，brd，J=3.8 Hz，H-6），1.58（3H，d，J=5.6 Hz，4''-ORha-H-6）1.75（3H，d，J=6.2 Hz，2'-O-Rha-H-6），1.61（3H，d，J=6.5 Hz，4'-O-Rha-H-6），4.84（1H，brd，Glc-H-1），5.82（1H，brd，2'-ORha-H-1），6.38（1H，brd，4'-O-Rha-H-1），7.05（1H，brd，4''-O-Rha-H-1）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：37.6（C-1），30.0（C-2），78.3（C-3），38.6（C-4），139.9（C-5），121.8（C-6），32.4（C-7），32.2（C-8），50.8（C-9），37.4（C-10），21.9（C-11），30.8（C-12），45.2（C-13），51.6（C-14），31.4（C-15），90.0（C-16），90.1（C-17），16.7（C-18），18.1（C-19），44.8（C-20），9.9（C-21），109.8（C-22），31.4（C-23），28.1（C-24），30.0（C-25），66.8（C-26），17.0（C-27）；3-O-Glc：100.6（C-1），80.8（C-2），77.2（C-3），78.1（C-4），78.1（C-5），61.6（C-6）；2'-O-Rha：102.7（C-1），73.2（C-2），73.3（C-3），74.4（C-4），70.6（C-5），18.9（C-6）；4'-O-Rha：103.7（C-1），73.8（C-2），73.3（C-3），74.1（C-4），69.0（C-5），19.3（C-6）；4''-O-Rha：102.7（C-1），73.2（C-2），73.3（C-3），74.4（C-4），70.5（C-5），18.9（C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12?13]報(bào)道基本一致，化合物2 鑒定為偏諾皂苷元-3-Oα-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）-O-α-L-吡喃鼠李糖基-[O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物3：白色針晶。1H-NMR（C5D5N，500 MHz）δ：0.67（3H，d，J=5.3 Hz，H-27），0.95（3H，s，H-18），1.07（3H，s，H-19），1.22（3H，d，J=7.2 Hz，H-21），5.28（1H，brd，J=4.2 Hz，H-6），1.75（3H，d，J=6.1 Hz，2'-ORha-H-6），1.62（3H，d，J=6.1 Hz，4'-O-Rha-H-6），4.82（1H，brd，Glc-H-1），5.85（1H，brd，2'-O-Rha-H-1），6.39（1H，brd，4'-O-Rha-H-1）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）δ：37.6（C-1），30.2（C-2），78.0（C-3），39.0（C-4），140.8（C-5），121.9（C-6），32.5（C-7），32.4（C-8），50.3（C-9），37.2（C-10），21.0（C-11），31.9（C-12），45.2（C-13），53.1（C-14），31.9（C-15），90.1（C-16），90.2（C-17），17.2（C-18），18.6（C-19），44.8（C-20），9.8（C-21），109.9（C-22），32.1（C-23），28.8（C-24），30.5（C-25），66.7（C-26），17.4（C-27）；3-O-Glc：100.3（C-1），78.6（C-2），78.1（C-3），78.0（C-4），77.8（C-5），61.3（C-6）；2'-ORha：102.1（C-1），72.9（C-2），72.8（C-3），74.0（C-4），69.6（C-5），18.7（C-6）；4'-O-Rha：102.9（C-1），72.9（C-2），72.8（C-3），74.2（C-4），70.4（C-5），19.5（C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，化合物3 鑒定為偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）-[O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-O-β-D-葡萄糖苷。

3 討論

重樓甾體皂苷為婦科常用藥宮血寧膠囊的主要成分。研究表明，重樓甾體皂苷具有縮宮止血的藥效，不僅能通過引起子宮收縮而止血，并且能有效防止子宮強(qiáng)烈收縮而引起的子宮破裂[14]，因此，本研究采用宮血寧膠囊作為陽性藥，在部分給藥劑量中顯示出作用活性，表明本實(shí)驗(yàn)體系可反映藥物對大鼠子宮平滑肌的作用。

有研究報(bào)道，表現(xiàn)出較強(qiáng)縮宮活性的甾體皂苷具有以下特點(diǎn)：F 環(huán)閉合（螺甾類化合物）；羥基僅一個(gè)，位于7 號位（符合偏諾皂苷類單體的特征）；糖鏈上2 號位連有鼠李糖，側(cè)鏈糖鏈越多縮宮作用越強(qiáng)[15]。但重樓甾體皂苷中偏諾皂苷含量并不高，同時(shí)，重樓因生長周期長，資源量小，使用成本高等問題嚴(yán)重制約了宮血寧膠囊市場應(yīng)用及推廣。

頭頂一顆珠具有鎮(zhèn)靜、止痛、活血、止血的功效，云南民族民間亦有用于產(chǎn)后出血治療，但未見現(xiàn)代研究報(bào)道。本研究采用大鼠離體子宮平滑肌試驗(yàn)方法，首次對頭頂一顆珠分離后的不同餾分進(jìn)行活性篩選。通過研究發(fā)現(xiàn)，其70%乙醇洗脫部位能顯著增強(qiáng)離體大鼠子宮平滑肌的收縮頻率、收縮強(qiáng)度和收縮活力。通過對該活性部位的主要化學(xué)成分分離鑒定，明確其主要物質(zhì)基礎(chǔ)為3 種偏諾皂苷，符合表現(xiàn)強(qiáng)縮宮活性的甾體皂苷化合物的結(jié)構(gòu)特征，為頭頂一顆珠進(jìn)一步的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

頭頂一顆珠富含具有縮宮作用的偏諾皂苷類成分，考慮到重樓資源的稀缺性和栽培的難度[16]，開發(fā)頭頂一顆珠用于縮宮止血藥更有效和經(jīng)濟(jì)，但其成藥性還需要進(jìn)一步研究和探索。