石曉英，王 榮，姬新梅，王健強(qiáng)，徐繼忠，張學(xué)英，周莎莎

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北 保定 071001)

干旱是限制果樹(shù)生長(zhǎng)的主要非生物因素，對(duì)果樹(shù)的產(chǎn)量及品質(zhì)有重要影響。我國(guó)蘋(píng)果栽培面積和產(chǎn)量均處于世界首位，大多優(yōu)質(zhì)蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)分布在降水偏少、水資源匱乏的淺山丘陵地區(qū)，加之水資源在時(shí)間和空間上的分布極不平衡，果園旱災(zāi)頻發(fā)[1]。近年來(lái)，矮砧密植栽培已成為蘋(píng)果生產(chǎn)的主流栽培模式[2]。我國(guó)應(yīng)用的蘋(píng)果矮化砧木主要有SH系、M系、G系等，主要利用方式為矮化中間砧[3]。因此研究矮化砧木特別是矮化中間砧對(duì)嫁接品種抗旱性的影響對(duì)于提高果樹(shù)生產(chǎn)水平具有重要意義。

關(guān)于蘋(píng)果矮化砧木的抗旱性研究報(bào)道較多[4-9]。干旱脅迫抑制了蘋(píng)果砧木的光合作用，導(dǎo)致葉片的葉綠體超微結(jié)構(gòu)受到破壞[5]。隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，植株旱害指數(shù)升高，葉片相對(duì)含水量降低，超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶活性先上升后下降，根系生長(zhǎng)情況發(fā)生改變，根系活力降低[6]。植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)不僅表現(xiàn)在外部形態(tài)特征、生理生化變化等方面，其對(duì)逆境的耐受性也受多種基因表達(dá)調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)膜水通道蛋白基因PIPs可參與植株體內(nèi)的水分跨膜運(yùn)動(dòng)，植物組織內(nèi)PIPs的表達(dá)在干旱脅迫條件下發(fā)生改變[11]。目前多數(shù)研究是對(duì)矮化砧木的抗旱性進(jìn)行探究[7-9]，而關(guān)于不同中間砧對(duì)嫁接品種抗旱性影響的研究較少。本試驗(yàn)以‘平邑甜茶’為基砧，河北省中南部廣泛應(yīng)用的SH40、北部常用的GM256、河北農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的矮化砧木優(yōu)系黃6為中間砧，嫁接‘天紅2號(hào)’紅富士蘋(píng)果苗為試材，進(jìn)行干旱處理，研究不同中間砧對(duì)蘋(píng)果苗生理特性和MdPIP1-1基因表達(dá)的影響，以期為蘋(píng)果抗旱砧木的選擇與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新試驗(yàn)園抗旱棚進(jìn)行。試驗(yàn)材料為盆栽蘋(píng)果苗，基砧為‘平邑甜茶’，矮化中間砧分別是GM256、SH40、黃6，于2019年4月1日嫁接‘天紅2號(hào)’紅富士。2019年6月27日選擇生長(zhǎng)一致的試材，統(tǒng)一澆透水。試驗(yàn)共設(shè)2個(gè)處理，干旱脅迫處理(T)：澆透水后至7月6日不再澆水；對(duì)照(CK)：維持土壤相對(duì)含水量在70%～85%。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。每天調(diào)查植株生長(zhǎng)情況，出現(xiàn)1級(jí)旱害開(kāi)始取樣，每隔1 d取樣1次，7月6日大部分植株達(dá)到4級(jí)旱害，取樣后復(fù)水，復(fù)水3 d后最后1次取樣。取中部功能葉片用于生理指標(biāo)測(cè)定，上部幼嫩葉片用于基因表達(dá)量測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤含水量測(cè)定 采用環(huán)刀法進(jìn)行取土，取土深度為10 cm，烘干法測(cè)定土壤含水量。

土壤絕對(duì)含水量(%)=[(原土重 - 烘干土重)/烘干土重]×100%

土壤相對(duì)含水量(%)=(土壤絕對(duì)含水量/田間最大持水量)×100%

1.2.2 旱害指數(shù)測(cè)定 試驗(yàn)期間每天調(diào)查植株旱害情況。按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行旱害分級(jí)：1級(jí)—葉片輕度萎蔫；2級(jí)—葉片中度萎蔫，且基部有3～5片葉發(fā)黃；3級(jí)—葉片重度萎蔫，且有1/4～1/3葉片焦枯；4級(jí)—葉片重度萎蔫，且有1/2及以上葉片焦枯[11]。

旱害指數(shù)(DI)=[∑(代表級(jí)值×本級(jí)株數(shù))/(最高級(jí)數(shù)值×處理總株數(shù))]×100%

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析MdPIP1-1基因表達(dá)量 蘋(píng)果葉片總RNA利用天根DP441RNA快速提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取，用NanoDrop One微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度和OD值。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司,北京，中國(guó))合成cDNA，使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測(cè)表達(dá)量，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。水通道蛋白基因MdPIP1-1引物序列如表1所示。

表1 MdPIP1-1基因引物序列

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel和SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下土壤相對(duì)含水量變化

由表2可知，3種矮化中間砧蘋(píng)果苗的土壤相對(duì)含水量均隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。干旱脅迫第3 d時(shí)，3種中間砧苗的土壤相對(duì)含水量均降至70%以下，達(dá)到輕度干旱水平。干旱脅迫第5 d時(shí)，土壤相對(duì)含水量低于40%，達(dá)到重度干旱水平。干旱脅迫第7 d、9 d，土壤相對(duì)含水量均降至30%以下；不同中間砧苗的土壤相對(duì)含水量沒(méi)有顯著差異。

表2 干旱脅迫下不同中間砧蘋(píng)果苗的土壤相對(duì)含水量變化

2.2 干旱脅迫下不同中間砧蘋(píng)果苗旱害指數(shù)比較

由表3可以看出，隨著干旱處理天數(shù)的增加，不同矮化中間砧蘋(píng)果苗的旱害指數(shù)均呈上升趨勢(shì)且存在顯著差異。干旱脅迫處理第5 d時(shí)，只有GM256中間砧蘋(píng)果苗出現(xiàn)旱害，旱害指數(shù)為13.67%。干旱脅迫處理第6～9 d時(shí)，3種中間砧蘋(píng)果苗均出現(xiàn)了一定程度的旱害，其中黃6中間砧苗的旱害指數(shù)最低。干旱脅迫處理第9 d時(shí)，黃6的旱害指數(shù)為29.67%，而GM256中間砧苗的旱害指數(shù)高達(dá)91.67%。從旱害指數(shù)來(lái)看，黃6中間砧苗的抗旱性較強(qiáng)，SH40次之，GM256最弱。

表3 干旱脅迫下不同中間砧蘋(píng)果苗的旱害指數(shù)

2.3 干旱脅迫下不同中間砧蘋(píng)果苗葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)

由圖1可知，在干旱處理第3 d時(shí)，GM256中間砧蘋(píng)果苗的Fv/Fm值顯著降低，SH40、黃6中間砧苗與其對(duì)照差異不顯著。干旱脅迫處理第9 d時(shí)，GM256中間砧苗的Fv/Fm值與對(duì)照相比顯著下降11.47%；黃6的Fv/Fm值下降幅度最小。復(fù)水3 d后，干旱處理的3種中間砧苗的Fv/Fm值均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與正常供水對(duì)照無(wú)顯著差異。

2.4 干旱脅迫下不同中間砧蘋(píng)果苗葉片的超氧陰離子產(chǎn)生速率

如表4所示，正常供水條件下，3種中間砧苗之間的超氧陰離子產(chǎn)生速率無(wú)顯著差異。干旱脅迫下3～9 d期間，3種中間砧苗的超氧陰離子產(chǎn)生速率均隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。干旱脅迫第3 d時(shí)，GM256中間砧苗的超氧陰離子產(chǎn)生速率顯著高于其他中間砧苗及其對(duì)照。干旱脅迫第9 d時(shí)，GM256的增加幅度最大，與對(duì)照相比增加了1.59倍；而黃6與其對(duì)照無(wú)顯著差異。復(fù)水3 d后，GM256中間砧苗的超氧陰離子產(chǎn)生速率分別是SH40和黃6的1.45、1.46倍。干旱脅迫期間和復(fù)水后3 d，GM256中間砧苗葉片的超氧陰離子產(chǎn)生速率均基本顯著高于其他處理。

表4 干旱脅迫下不同中間砧蘋(píng)果苗葉片的超氧陰離子產(chǎn)生速率

2.5 干旱脅迫下不同中間砧蘋(píng)果苗葉片的POD、SOD活性

由圖2可以看出，正常供水條件下，3種中間砧苗之間的POD活性差異不顯著。干旱脅迫第3 d時(shí)，3種矮化中間砧苗的POD活性均顯著高于對(duì)照。干旱脅迫第3～5 d時(shí)，黃6與SH40中間砧苗的POD活性呈上升趨勢(shì)，而GM256呈下降趨勢(shì)。干旱脅迫第5～9 d時(shí)，SH40、GM256中間砧苗的POD活性呈持續(xù)下降趨勢(shì)，在干旱脅迫第9 d時(shí)，較對(duì)照分別降低了62.27%、69.72%。黃6中間砧苗在干旱脅迫第5～7 d下降，第7 d和第9 d時(shí)與對(duì)照差異不顯著。復(fù)水后3 d，黃6與SH40中間砧苗的POD活性恢復(fù)到正常水平，而GM256的POD活性仍顯著低于對(duì)照，僅為對(duì)照的46.91%。

由圖3可以看出，正常供水條件下，3種中間砧苗之間的SOD活性無(wú)明顯差異。干旱脅迫第3 d時(shí)，3種矮化中間砧苗的SOD活性均顯著高于對(duì)照。干旱脅迫第3～5 d時(shí)，黃6中間砧苗的SOD活性呈上升趨勢(shì)，在第5 d時(shí)達(dá)到峰值，干旱脅迫第5～9 d時(shí)呈下降趨勢(shì)；SH40和GM256中間砧苗的SOD活性在干旱脅迫第3～9 d時(shí)，呈持續(xù)下降趨勢(shì)，GM256降低幅度最大，與對(duì)照相比降低了85.78%。干旱脅迫第9 d時(shí)，SH40、黃6和GM256中間砧蘋(píng)果苗的SOD活性顯著低于對(duì)照，分別為對(duì)照的45.26%、63.27%和14.22%，且三者間差異顯著。復(fù)水后3 d，3種中間砧苗的SOD活性均顯著上升，黃6、SH40中間砧苗與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，而GM256中間砧苗僅達(dá)到對(duì)照的64.88%。

2.6 干旱脅迫下不同中間砧蘋(píng)果苗的水通道蛋白基因MdPIP1-1表達(dá)量分析

由圖4可知，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，3種矮化中間砧苗葉片中MdPIP1-1基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，正常供水條件下的3種中間砧苗的基因表達(dá)量在各時(shí)期無(wú)顯著差異。其中，SH40和GM256葉片中MdPIP1-1基因的表達(dá)量在干旱脅迫第5 d時(shí)達(dá)到最高，分別為對(duì)照的2.79、3.45倍；干旱脅迫第7 d、第9 d，相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照無(wú)顯著差異。黃6的基因表達(dá)量在干旱脅迫第7 d時(shí)達(dá)到最高，較對(duì)照升高了2.11倍；在干旱脅迫第9 d時(shí)，與對(duì)照無(wú)顯著差異。

3 討 論

優(yōu)良砧木的應(yīng)用需要從各方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。張靜等[20]以PEG-6000作脅迫劑模擬室外干旱，發(fā)現(xiàn)M26抗旱性優(yōu)于M9。但M26作中間砧，其幼齡蘋(píng)果樹(shù)在河北中北部易發(fā)生抽條現(xiàn)象，越冬能力差[21]。黃6是河北農(nóng)業(yè)大學(xué)蘋(píng)果課題組從八棱海棠中選出的矮化砧木優(yōu)系，在本試驗(yàn)中作中間砧嫁接紅富士表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗旱性，關(guān)于黃6的抗旱機(jī)理正在從基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究，作為蘋(píng)果矮化砧木在田間的綜合表現(xiàn)尚需進(jìn)一步的區(qū)域試驗(yàn)和生產(chǎn)試驗(yàn)以進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。

4 結(jié) 論

本文研究了干旱脅迫下‘天紅2號(hào)/黃6/平邑甜茶’、‘天紅2號(hào)/SH40/平邑甜茶’、 ‘天紅2號(hào)/GM256/平邑甜茶’盆栽蘋(píng)果苗的旱害指數(shù)和相關(guān)生理指標(biāo)，并分析了MdPIP1-1基因在3種砧穗組合中的表達(dá)情況，得出以下結(jié)論：(1)3種中間砧蘋(píng)果苗的抗旱性由強(qiáng)至弱依次為‘天紅2號(hào)/黃6/平邑甜茶’>‘天紅2號(hào)/SH40/平邑甜茶’>‘天紅2號(hào)/GM256/平邑甜茶’。(2)MdPIP1-1基因響應(yīng)植株干旱脅迫，其表達(dá)量峰值出現(xiàn)早晚與植株抗旱性強(qiáng)弱有關(guān)。