張瑞雪，何 媛

0引言

眼部疾病復(fù)雜多樣，隨著對其發(fā)病機制的不斷深入探究，基因預(yù)防和基因治療逐漸成為研究熱點之一。瞬時受體電位(TRP)通道蛋白是細胞膜上的一類非選擇性陽離子通道蛋白家族，TRPM3是TRP家族M亞家族中的一員，對鈣離子和鎂離子具有一定通透性。微小RNA(miRNA)是長約22個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，廣泛存在于從病毒到人類的各種生物中，通過對翻譯水平的抑制或斷裂靶mRNAs來調(diào)節(jié)基因的表達。目前發(fā)現(xiàn)上百種miRNA在眼組織中呈不同程度表達，并與多種眼部疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如血清中miR-23a和miR-34a表達上調(diào)通過促進炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)從而參與年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)的發(fā)生及發(fā)展；糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)患者血清miR-146a明顯降低，可能通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和血管增生參與DR的發(fā)病[1-2]。越來越多的研究表明，TRPM3/miR-204復(fù)合位點在眼組織的發(fā)育和眼部疾病的表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本文就TRPM3/miR-204分子通路的生物學(xué)功能、在眼部的表達與調(diào)控及其與眼部疾病的相關(guān)性研究進展進行綜述。

1 TRPM3/miR-204

TRP陽離子通道超家族在細胞的感應(yīng)、黏附、增殖、分化和凋亡等多種細胞過程中起重要作用。TRPM3是TRP家族M亞家族中成員之一，編碼質(zhì)膜上的陽離子通道蛋白。TRPM3基因是位于人類9號染色體(9q21.11-q21.12)長臂上最大的基因之一，其長度超過0.9Mb[3]。有研究證實TRPM3的兩種錯義突變可導(dǎo)致人類遺傳性白內(nèi)障[4]，Bennett等[5]初步研究發(fā)現(xiàn)TRPM3內(nèi)含子2的基因突變與年齡相關(guān)性白內(nèi)障相關(guān)。TRPM3的非編碼區(qū)突變與長壽、低密度脂蛋白及甘油三酯升高、系統(tǒng)性硬化癥、阿司匹林加重性呼吸系統(tǒng)疾病和甲狀腺結(jié)節(jié)有關(guān)[6-10]。而TRPM3編碼區(qū)變異可能導(dǎo)致智力障礙和癲癇[11]。TRPM3通道對溫度敏感，研究顯示其在傳感有害溫度、調(diào)節(jié)胰島素釋放和分泌炎性因子方面發(fā)揮一定作用[12-13]。

TRPM3含有非編碼miRNA基因，與宿主基因同方向共轉(zhuǎn)錄，通過對靶mRNAs的切割或抑制mRNAs翻譯參與轉(zhuǎn)錄后水平基因表達的調(diào)控。miR-204位于TRPM3內(nèi)含子6上[14]，通過調(diào)控多種基因的表達增加TRPM3位點的功能復(fù)雜性。因此，miR-204的表達受TRPM3啟動子調(diào)控，也受表觀遺傳機制的調(diào)控[15]。miR-204與TRPM3轉(zhuǎn)錄方向相同[16]，有研究表明miR-204的表達模式也與TRPM3大致相同。如在眼部晶狀體、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜神經(jīng)元、睫狀體和視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞中可同時檢測到miR-204和TRPM3[16-21]。TRPM3和miR-204也在胰島素瘤細胞中共表達，miR-204可以調(diào)節(jié)胰島素的生成[22]。TRPM3在伴有VHL基因丟失的人腎透明細胞癌(ccRCC)的發(fā)生發(fā)展過程中也起重要作用，miR-204的直接靶點TRPM3在缺失VHL基因的腎透明細胞癌中表達增加[23]。Butrym等[24]發(fā)現(xiàn)位于miR-204上游側(cè)翼的基因突變可造成急性髓系白血病惡化。因此，了解不同特定的TRP通道/miRNA分子通路可能為疾病的靶向治療提供臨床依據(jù)。

2 TRPM3/miR-204在眼部的表達及調(diào)控

在人眼部，多個TRPM3轉(zhuǎn)錄變體存在于晶狀體中[5]，且成人RPE細胞系(ARPE-19)的TRPM3轉(zhuǎn)錄水平更接近原代RPE細胞[25]。RNA測序證實，TRPM3在人RPE組織、細胞系和晶狀體干細胞系中比視網(wǎng)膜或角膜源性細胞中更豐富[26-27]。許多學(xué)者在人睫狀體、小梁網(wǎng)(HTM)細胞、晶狀體上皮中檢測到miR-204轉(zhuǎn)錄[28-29]，miR-204可調(diào)節(jié)HTM細胞中多個基因的表達，蛋白質(zhì)印跡分析顯示miR-204的直接靶點蛋白Bcl2l2、BIRC2、EZR、M6PR、SERP1表達水平均下調(diào)[29]。miR-204是睫狀體中表達含量最多的miRNA，也在角膜、小梁網(wǎng)等與青光眼和圓錐角膜相關(guān)的眼組織中表達[30]。TRPM3免疫定位于人胎兒RPE(hf-RPE)細胞的頂漿膜亞區(qū)，并富集于頂漿細胞緊密連接處和初級纖毛基底處[31]。小眼球畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)參與TRPM3/miR-204分子通路的調(diào)控，在去分化的hf-RPE細胞中MITF和TRPM3/miR-204顯著下調(diào)，將前體miR-204轉(zhuǎn)染到hf-RPE細胞中，可促進細胞分化；而加入miR-204抑制劑則會導(dǎo)致細胞去分化。在hf-RPE細胞中，敲除MITF會降低TRPM3/miR-204及其他RPE分化基因(如TYR、TYRP1) 的表達，導(dǎo)致hf-RPE細胞去分化；相反，MITF和前體miR-204共轉(zhuǎn)染促進了hf-RPE細胞分化，這說明MITF介導(dǎo)的miR-204上調(diào)在促進hf-RPE細胞分化中起關(guān)鍵作用[32]。TRPM3/miR-204復(fù)合位點在眼組織中呈不同程度表達，且在多種眼部疾病的調(diào)控中也扮演重要角色。

3 TRPM3/miR-204與眼部疾病

3.1 TRPM3與白內(nèi)障TRPM3是晶狀體發(fā)育和白內(nèi)障形成的相關(guān)基因之一。Bennett等[5]首次證明TRPM3與人類遺傳性眼病有關(guān)，并定位于染色體9q上，進一步證明該陽離子通道在正常眼組織發(fā)育中的重要作用。人類9q染色體上的TRPM3是引起常染色體顯性遺傳性白內(nèi)障和高眼壓性青光眼的發(fā)病基因。全外顯子測序和下一代測序技術(shù)檢測出TRPM3的外顯子3中存在與疾病共分離的A/G雜合轉(zhuǎn)變[5]；作為選擇性剪接的結(jié)果，這種錯義突變可能會導(dǎo)致TRPM3轉(zhuǎn)錄變體9上密碼子65的蛋氨酸被異亮氨酸替代，以及導(dǎo)致密碼子8在人晶狀體中表達一種新的TRPM3轉(zhuǎn)錄變體。對重組TRPM3-GFP熒光蛋白基因產(chǎn)物的瞬時表達研究顯示，I/M的替代引入了1個可變的翻譯起始位點，該位點位于其他8個TRPM3轉(zhuǎn)錄變體的蛋氨酸上游密碼子89上[5]。另外，在23例中國兒童散發(fā)白內(nèi)障患者中也檢測到位于TRPM3外顯子29的錯義突變[33]。

3.2 miR-204與白內(nèi)障研究表明，miR-204的異常表達可能導(dǎo)致晶狀體上皮細胞凋亡、晶狀體纖維細胞紊亂和晶狀體透明度降低，從而形成白內(nèi)障[34]。miR-204的差異調(diào)控與年齡相關(guān)性白內(nèi)障、先天性白內(nèi)障、糖尿病性白內(nèi)障和后發(fā)性白內(nèi)障/后囊膜混濁(PCO)的形成相關(guān)[35-38]。在年齡相關(guān)性白內(nèi)障手術(shù)患者中，miR-204-5p和miR-204-3p在晶狀體上皮中央表達下調(diào)超過2倍[37]。在PCO組織和晶狀體上皮細胞(LECs)中，miR-204-5p和miR-204-3p也顯著下調(diào)。原代LECs中miR-204-5p過表達導(dǎo)致鈣黏蛋白表達增加；而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標志物、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和波形蛋白表達減少。miR-204過表達直接作用于DNA結(jié)合蛋白SMAD4來加強抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β2(TGF-β2)介導(dǎo)的EMT[38]。miR-204通過靶向TGF-β/SMAD信號通路而直接抑制EMT，可能成為治療PCO的新靶點。miR-204也與白內(nèi)障氧化應(yīng)激相關(guān)基因的調(diào)控相關(guān)。miR-204不僅抑制促氧化基因如硫氧還蛋白相互作用蛋白(TXNIP) 3’-UTR的轉(zhuǎn)錄，還激活了抗氧化基因如乙醛脫氫酶1A3(ADH1A3)的5’-TATA-box啟動子序列轉(zhuǎn)錄[37]。因此，miR-204的下調(diào)抑制抗氧化基因并激活促氧化基因，揭示了一種新的參與白內(nèi)障發(fā)病機制的miR204-TATA box/3’-UTR基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。秦宇等[39]研究發(fā)現(xiàn)miR-204在年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜中呈高表達，且miR-204通過靶向調(diào)控Bcl-2家族成員bcl-2、mcl-1使其表達降低，從而在年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

3.3 miR-204與青光眼miR-204是參與小梁網(wǎng)細胞調(diào)控通路的基因之一[40]，而小梁組織是房水的流出途徑，與青光眼的病理過程密切相關(guān)。G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白5(RGS5)是HTM細胞中表達的非管家基因之一，Banaei-Esfahani等[41]發(fā)現(xiàn)miR-204可能靶向調(diào)控RGS5蛋白而參與青光眼的發(fā)病。在晚期青光眼高眼壓視網(wǎng)膜損傷大鼠模型中，miR-204下調(diào)了約4倍，還有其他7個miRNAs也顯著下調(diào)。這些基因富集于細胞外基質(zhì)(ECM)，并且與EMT相關(guān)，這進一步驗證了miR-204對TGF-β信號通路的調(diào)節(jié)作用，即抑制miR-204表達可激活該通路的下游成分[42]。在視神經(jīng)損傷模型大鼠的視網(wǎng)膜血管中，miR-204表達水平顯著升高，生長相關(guān)蛋白-43(GAP-43)表達降低；在大鼠眼部注射miR-204模擬物后，GAP-43表達降低，而miR-204抑制劑處理后GAP-43的表達顯著增加；注射miR-204模擬物的大鼠和模型組大鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡率明顯升高，且miR-204抑制劑可有效逆轉(zhuǎn)模型組的凋亡率，說明miR-204通過抑制GAP-43促進視網(wǎng)膜細胞凋亡[43]。

3.4 miR-204與角膜損傷miRNA在角膜發(fā)育中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。An等[44]建立了一個影響創(chuàng)面愈合結(jié)局的miRNA基因網(wǎng)絡(luò)，并證實該網(wǎng)絡(luò)通過miR-204的差異表達來調(diào)控。在角膜傷口愈合過程中，miR-204的表達下調(diào)幅度最大。miR-204轉(zhuǎn)染的人角膜上皮細胞增殖明顯下降并誘導(dǎo)細胞周期G1停滯。Gao等[45]研究發(fā)現(xiàn)，miR-204-5p在糖尿病患者的角膜上皮中比非糖尿病患者的角膜上皮增加了近5倍，且SIRT1蛋白是miR-204-5p的直接靶點。在高糖條件下，通過調(diào)控Cyclin D1和p16可以下調(diào)miR-204-5p來增加小鼠角膜上皮細胞系(TKE2)生長，恢復(fù)細胞周期進程。下調(diào)miR-204-5p可使1型糖尿病模型Ins2(Akita)小鼠SIRT1表達上調(diào)，促進角膜上皮創(chuàng)傷愈合。miR-204-5p對SIRT1的調(diào)控可促進糖尿病性角膜病變上皮細胞周期循環(huán)。miRNA的下調(diào)還可促進人類角膜上皮細胞的增殖和遷移，說明其在角膜損傷愈合過程中具有重要作用。

3.5 miR-204與角膜新生血管角膜新生血管(CNV)會導(dǎo)致視力喪失。Kather等[46]研究顯示，在KLEIP基因敲除的小鼠角膜營養(yǎng)不良模型中，血管生成素1(Ang-1)表達增加，而miR-204表達減少，致使CNV形成。體外實驗證實miR-204的表達缺失調(diào)控Ang-1使其表達上調(diào)，因此，miR-204是一種新的Ang-1的調(diào)節(jié)因子。Zhang等[47]研究發(fā)現(xiàn)，上皮細胞來源的miR-204可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體的表達來抑制縫線法誘導(dǎo)的小鼠角膜新生血管。miR-204主要在上皮細胞表達，而在有新生血管的角膜中表達下調(diào)。在小鼠結(jié)膜下注射miR-204激動劑可以抑制CNV，降低VEGF和VEGF受體2的表達。同樣，miR-204過表達減弱了VEGF在角膜緣上皮細胞(LECs)中的表達，抑制了人微血管內(nèi)皮細胞(HMECs)的增殖、遷移和CNV形成。Lu等[48]發(fā)現(xiàn)在堿燒傷小鼠CNV模型中，重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體轉(zhuǎn)染miR-204后，可使CNV的多種靶基因和通路的表達趨于正常，從而減輕CNV。miR-204作為CNV的內(nèi)源性抑制基因，是抑制CNV形成的潛在治療靶點。

3.6 TRPM3與視網(wǎng)膜疾病TRPM3通道存在于整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)，同時也是神經(jīng)甾體類藥物硫酸孕烯醇酮(PregS)的受體。Webster等[49]發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育中的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)中，PregS可導(dǎo)致TRPM3通道產(chǎn)生長時間的鈣瞬變，并增加RGCs自發(fā)性突觸電流的頻率；而在TRPM3基因敲除的小鼠視網(wǎng)膜中，未發(fā)現(xiàn)PregS介導(dǎo)的自發(fā)突觸電活動增加，證明TRPM3和內(nèi)源性神經(jīng)類固醇在視網(wǎng)膜發(fā)育過程中調(diào)節(jié)自發(fā)性突觸電活動。Brown等[50]提出，在視網(wǎng)膜中，TRP家族的兩種基因TRPM1和TRPM3呈高表達，而TRPM3在內(nèi)叢狀層(IPL)、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層(GCL)表達。應(yīng)用TRPM3激動劑PregS可激活小鼠RGCs中TRPM3依賴性鈣信號通路。促炎細胞因子可能導(dǎo)致與ARMD有關(guān)的RPE細胞發(fā)生功能障礙，Kutty等[51]發(fā)現(xiàn)在ARPE-19細胞中，MITF、TRPM1和TRPM3基因以及miR-204和miR-211的表達減少會導(dǎo)致促炎細胞因子、趨化因子和細胞因子的表達增加，認為這些基因可以調(diào)節(jié)RPE細胞特異性基因的表達。Hughes等[52]研究表明TRPM1和TRPM3在缺乏視桿細胞和視錐細胞的小鼠眼中都受到光的調(diào)控，無論是TRPM1缺失還是TRPM3缺失的小鼠，瞳孔光反應(yīng)都明顯減弱。TRPM3還在視網(wǎng)膜Müller細胞和睫狀體中表達，而在感光性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中無表達，因此TRPM3在瞳孔光反應(yīng)中起到間接作用。

3.7 TRPM3與視神經(jīng)疾病鈣離子信號通路的激活是神經(jīng)膠質(zhì)細胞對多種細胞外刺激的普遍反應(yīng)。Papanikolaou等[53]通過小鼠視神經(jīng)切片和培養(yǎng)物的免疫標記證實，TRPM3通過鈣庫操縱性鈣內(nèi)流(SOCE)來補充內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的存儲，并在小鼠星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞中表達，結(jié)果證明TRPM3是鈣通道的重要組成部分之一，支撐SOCE和ATP介導(dǎo)的鈣離子信號通道正常且持續(xù)發(fā)揮作用。

4小結(jié)

TRPM3/miR-204復(fù)合位點與年齡相關(guān)性白內(nèi)障、青光眼、ARMD等眼部疾病的發(fā)病存在顯著聯(lián)系，其在眼的發(fā)育、眼部疾病的發(fā)生發(fā)展及治療中更是發(fā)揮著重要作用。在許多已知TRPM3蛋白表達的組織中，有些通道目前還沒有明確其功能作用，未來對TRPM3通道的研究有望在新層面揭示其新功能。隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及對眼部疾病病變機制的不斷研究，進一步了解不同眼部疾病特定的TRP通道/miRNA分子通路調(diào)控靶基因、調(diào)節(jié)相關(guān)因子表達、影響信號通路的作用機制，從基因水平為預(yù)防和治療眼科疾病開辟新前景十分重要。