劉艷琴 張 璇 彭瑩瑩 劉圓圓 趙少志 張欣文

(西安市人民醫(yī)院(西安市第四醫(yī)院)，西安 710000)

1 前言

維生素D是人體一種重要的脂溶性維生素，多項研究表明，充足的維生素D含量不僅對維持人體骨骼發(fā)育、調(diào)節(jié)鈣磷水平有重要作用，同時，對加強免疫反應(yīng)、抑制抗炎反應(yīng)，提升肝臟抗氧化能力、調(diào)控血糖水平及抑制癌癥發(fā)生等均有積極作用[1,2]。維生素D在體內(nèi)主要有維生素D2、維生素D3兩種存在形式，其中維生素D2主要通過植物性食物攝取得到補充，維生素D3主要通過動物性食物攝取和紫外照射合成，此兩種維生素體內(nèi)沒有生理活性，經(jīng)循環(huán)、轉(zhuǎn)化后形成活化狀態(tài)的1，25-二羥維生素D3/D2(1,25(OH)-D3/D2)、24，25-二羥維生素D3(24,25(OH)-D3/D2)、25-羥基維生素D2/D2(25(OH)-D2/D2)和25-羥基維生素D3/D2(25(OH)-D3/D2)等形式，而由于25(OH)-D3/D2在體內(nèi)含量高、半衰期長、不易分解，因而成為檢測體內(nèi)維生素D含量的最佳指標(biāo)[3,4]。

維生素D缺乏或過量均會引發(fā)多種疾病，維生素D缺乏時，會引發(fā)兒童成長緩慢、免疫學(xué)疾病、代謝性疾病，成人細菌性感染、心腦血管疾病等，孕婦妊娠糖尿病、產(chǎn)后骨質(zhì)疏松等，而過量維生素D的攝入會引發(fā)肌無力、骨痛、高鈣血癥等疾病，嚴重影響人類的身體健康[5,6]。

據(jù)統(tǒng)計分析，全球約一半人口存在維生素D缺乏情況，且各國人口中維生素D缺乏率各不相同，而造成這一統(tǒng)計差異的一個重要原因是各國檢測維生素D含量方法的差異，因此，建立一種高效、精準(zhǔn)的檢測方法對評估人體內(nèi)維生素D含量存在重要意義[7]。目前，體內(nèi)維生素D的檢測方法有電化學(xué)發(fā)光免疫檢測法(ECLI)[8]、放射免疫法[9]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[10]、液相色譜(HPLC)法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法[11,12]，而免疫法具有無法同時檢測樣本中25(OH)-D3/D2含量、存在抗體反應(yīng)交叉反應(yīng)，易影響實驗精準(zhǔn)度等缺點[13]。隨著科研的發(fā)展，HPLC-MS/MS法已經(jīng)被認為是檢測人體25(OH)-D2和25(OH)-D3的金標(biāo)準(zhǔn)，而由于各實驗室采用HPLC-MS/MS法檢測人體25(OH)-D2和25(OH)-D3方法不盡相同，如鄭仁錦等人通過乙腈、飽和硫酸鋅、正己烷提取、沉淀、萃取等步驟處理樣本后質(zhì)譜檢測，進樣量為15μL，檢測時間10min，于偉越等人通過甲醇、正己烷、硫酸鋅提取、萃取、沉淀等步驟處理樣本后質(zhì)譜檢測，進樣量為25μL，檢測時間10min[14-16]。同時，為了方便處理樣本，多數(shù)機構(gòu)因血斑不受地域限制、運輸便捷、利于存儲等優(yōu)勢以血斑為樣本檢測，但血斑樣本制作過程繁瑣、前處理步驟較多，人工操作過程中易出現(xiàn)誤差，影響實驗結(jié)果[17,18]?；谝陨显颍痉椒ㄍㄟ^直接處理血清樣本進行試驗，優(yōu)化實驗條件，簡化實驗流程，縮短檢測時間，添加了衍生劑，增強信號強度，建立了一種操作簡單、快速高效、精準(zhǔn)、高靈敏度的檢測血清樣本中25(OH)-D2和25(OH)-D3的HPLC-MS/MS方法。

2 實驗和方法

2.1 儀器和試劑

2.1.1儀器

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Waters Xevo TQD三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀)；C18色譜柱(Kinetex，30×2.1mm，粒徑1.3μm)；DC150-1A 96孔氮吹儀；微孔板恒溫振蕩器(型號：MB100-4A)，96孔深孔樣品板(2ML/孔)；檢驗分析用純水設(shè)備(型號：TCHS-05 RO/2OF)。

25-羥基維生素 D2標(biāo)準(zhǔn)品(純度95%)；25-羥基維生素 D3標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)；25-羥基維生素D2-氘代同位素內(nèi)標(biāo)(25(OH)-D2-IS)、25-羥基維生素D3-氘代同位素內(nèi)標(biāo)(25(OH)-D3-IS)(純度>98%)；4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)、甲醇、甲酸、乙酸乙酯(HPLC級試劑)。

2.1.2試劑的配制

將干燥后的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶于1100μL甲醇，配置成內(nèi)標(biāo)儲備液，分裝后-20℃保存，使用時按照實驗配置所需濃度的提取液。將PTAD溶于乙酸乙酯，配置后PTAD濃度為0.2μg/μL。

2.1.3液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

ESI離子源溫度為150℃，脫溶劑氣溫度為500℃，脫溶劑氣流量為800L/hr，流動相：A相(甲酸∶乙酸銨水，v/v/v=1/1/1000)，B相(甲酸∶甲醇，v/v=1/1000)，以0.4mL/min流速，進樣器溫度10 ℃，柱溫40℃，上樣量10μL，0～1.1min、1.1～1.7min、1.8～3.5min以40%B、98%B、98%B流動相梯度洗脫樣本，以40%B沖洗管路。各分析物質(zhì)譜掃描參數(shù)見表1。

表1 各分析物MS掃描參數(shù)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的制備

抽取靜脈血3mL于采血管中，以3500r/min轉(zhuǎn)速離心5min血樣，取上清備用(如當(dāng)天實驗，樣本存于4℃，如隔天實驗，凍存于-20℃，實驗前及時拿出解凍)，分別各取100μL上清樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、25(OH)-D2和25(OH)-D3的低質(zhì)控品(濃度分別為3ng/mL和15ng/mL)，25(OH)-D2和25(OH)-D3的高質(zhì)控品(濃度分別為15ng/mL和75ng/mL)于1mL96孔板中，加400μL提取液震蕩均勻后，各吸取300μL混合液于96孔板，氮氣吹干儀吹干；每個孔中加100μLPTAD衍生化溶液，300rpm、30℃孵育30min；各孔板加50μL純水作為淬滅劑終止反應(yīng)，300rpm、30℃孵育5min；靜置5min后置于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中檢測。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量檢出限實驗

根據(jù)試劑盒提供的系列濃度工作溶液，即分別將25(OH)-D2和25(OH)-D3標(biāo)準(zhǔn)品加400μL內(nèi)標(biāo)提取液稀釋，25(OH)-D2標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度為0.4ng/mL、0.8ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，25(OH)-D3標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度為2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，采用血清加標(biāo)方式配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，校準(zhǔn)標(biāo)樣和質(zhì)控樣品中的分析物濃度將以分析物與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(W=1/X2)最小二乘法以分析物的濃度(X)與峰面積比(Y)進行線性回歸分析。

2.4 精密度、準(zhǔn)確度和回收率

25(OH)-D2和25(OH)-D3的低質(zhì)控濃度分別為3ng/mL和15ng/mL，高質(zhì)控濃度分別為15ng/mL和75ng/mL，將25(OH)-D2和25(OH)-D3的低質(zhì)控和高質(zhì)控血清平行制備6份，每份樣本按照2.2制備過程制備、2.1.3 LC-MS/MS儀器條件下，每天測定6次，連續(xù)測定3天，測定精密度與準(zhǔn)確度。

2.5 樣品穩(wěn)定性

血清樣品室溫穩(wěn)定性實驗：取1份混合血清分別置于室溫(10～30℃)0h、2h、4h、8 h，按照2.3制備過程制備、2.2 LC-MS/MS儀器條件下,以0h檢測數(shù)據(jù)為參照，計算其他樣本指標(biāo)成分的相對偏差(RE)，以評價血清樣品室溫穩(wěn)定性；血清樣品凍融穩(wěn)定性實驗：取一份混合血清分別置于<-65℃冰箱，進行0、1、3、6次凍融，按照2.2制備過程制備、2.1.3 LC-MS/MS儀器條件下,以第0 次凍融(未凍融的血清樣本)檢測數(shù)據(jù)為參照，計算其他樣本指標(biāo)成分的相對偏差，以評價血清樣品凍融穩(wěn)定性。

2.6 空白加標(biāo)回收率

空白樣本基質(zhì)中25(OH)-D2和25(OH)-D3檢測值分別為0.15±0.13ng/mL和6.96±0.41ng/mL，以低質(zhì)控和高質(zhì)控品作為樣本加入基質(zhì)中，操作過程同2.2，每個濃度平行制備6份，平行3組，計算加標(biāo)回收率。

2.7 殘留評價

分別檢測25(OH)-D2、25(OH)-D3標(biāo)準(zhǔn)品的最高濃度20ng/mL和100ng/mL后，測試兩個空白基質(zhì)樣品，通過測定空白基質(zhì)樣品中的分析物和內(nèi)標(biāo)的峰面積，并與最低濃度點校正標(biāo)樣比較，以確認殘留對分析物準(zhǔn)確定量的影響。

2.8 基質(zhì)效應(yīng)評價

以1∶1的體積比在血清中加入低質(zhì)控品、高質(zhì)控品溶液，通過比較血清/質(zhì)控品溶液中分析物峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積比值與1/2血清中分析物峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積比值和質(zhì)控品溶液中分析物峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積比值評估內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子，以達到評估基質(zhì)效應(yīng)的目的。

3 結(jié)果與討論

3.1 條件優(yōu)化

離子對條件優(yōu)化：為提高靈敏度，本實驗在樣本提取時加入了PTAD進行衍生化，通過引入氮原子基團，增加ESI離子源離子化分析物時形成加[M+H]+峰，而由于衍生時，25(OH)-D易發(fā)生解離，形成[M-H2O+H]峰，因此，在LC-MS/MS定量分析時，選擇[M-H2O+H]+作為母離子。流動相條件優(yōu)化：PTAD與25(OH)-D2和25(OH)-D3衍生化反應(yīng)時，會產(chǎn)生兩種手性碳原子的化合物，即6R和6S光學(xué)異構(gòu)體構(gòu)型，為方便定量，定量時選擇6S構(gòu)型為定量分析物，且為增加保留時間，獲得良好峰形，本實驗在流動相中加入甲酸和乙酸銨，并調(diào)節(jié)流速和不同時間的流動相比例進行檢測。

3.2 方法學(xué)驗證[19]

3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量檢出限

回歸方程(Y=bX+a)即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。25(OH)-D2和25(OH)-D3的線性相關(guān)系數(shù)均為R2>0.999，表明線性關(guān)系良好；以檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線線性最低點作為定量檢出限考察，即連續(xù)進樣檢測6次，結(jié)果顯示25(OH)-D2和25(OH)-D3線性最低點的CV和RE均小于20%，表明定量檢出限滿足方法學(xué)評價，見表2。

表2 25(OH)-D2和25(OH)-D3的線性范圍

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖與色譜圖注：a、c、和b、d分別表示25(OH)-D2和25(OH)-D3的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖與色譜圖

3.2.2精密度、準(zhǔn)確度和回收率

測定結(jié)果的RSD(%)和RE(%)分別作為考察精密度與準(zhǔn)確度的指標(biāo)，結(jié)果如表3所示。25(OH)-D2精密度RSD≤3.55%，準(zhǔn)確度-4.67%≤RE≤3.33%，回收率為93.83±8.38%～101.83±5.15%；25(OH)-D3精密度RSD≤6.73%，準(zhǔn)確度RE≤2.56%，回收率為97.33±7.28%～100.33±9.09%，各指標(biāo)精密度、準(zhǔn)確度和回收率均良好，滿足方法學(xué)要求。

表3 25(OH)-D2和25(OH)-D3的精密度和準(zhǔn)確度

3.2.3樣品穩(wěn)定性

與0 h放置血清相比，于室溫(10～30℃)放置8 h后，血清中25(OH)-D2/D3的RSD≤10.49%，-9.42%≤RE≤0.52%；與無凍融血清相比，凍融6次血清中25-羥基維生素D2/D3的RSD≤7.456%，-3.99%≤RE≤-0.54%，表明血清中25-羥基維生素D2/D3樣本穩(wěn)定性良好(表4)。

表4 25(OH)-D2和25(OH)-D3的樣品穩(wěn)定性

3.2.4空白加標(biāo)回收率

如表5所示，25(OH)-D2加標(biāo)回收率為97.50±9.85%～98.67±9.48%，CV%≤10.1，25(OH)-D3加標(biāo)回收率為98.33±10.15%～98.5±10.82%，CV%≤10.98，滿足驗證要求。

表5 25(OH)-D2和25(OH)-D3的加標(biāo)回收率

3.2.5殘留評價

分析物25(OH)D2、25(OH)D3、內(nèi)標(biāo)均基本無殘留，滿足中國藥典規(guī)定在分析物保留時間處的干擾峰的響應(yīng)均不超過定量下限中分析物響應(yīng)的20%，內(nèi)標(biāo)保留時間處的干擾峰的響應(yīng)均低于低濃度樣品中內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%[19]，殘留實驗評價滿足方法學(xué)評價要求。

3.2.6基質(zhì)效應(yīng)評價

有血清或無血清基質(zhì)中不同加標(biāo)濃度25(OH)-D2和25(OH)-D3內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子在0.89～0.94之間；即內(nèi)標(biāo)與分析物的基質(zhì)效應(yīng)接近，可補償樣品中分析物可能出現(xiàn)的基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)不影響最終的準(zhǔn)確定量分析，具體結(jié)果如表6所示。

表6 25(OH)-D2和25(OH)-D3的基質(zhì)效應(yīng)評價

3.3 HPLC-MS/MS法與ELISA方法的比較

為考察HPLC-MS/MS方法與ELISA法測定血清中25(OH)-D2和25(OH)-D3含量的一致性，選取50例正常人群的樣本，按照3500r/min轉(zhuǎn)速離心5min后，提取上清，將上清樣平均分為兩份，一份按照2.3方法制備后，用HPLC-MS/MS方法檢測，另外一份按照ELISA試劑盒(歐蒙，批號：E200803AB)操作方法檢測；由于ELISA檢測無法將25(OH)-D2和25(OH)-D3區(qū)分開，因此，HPLC-MS/MS檢測結(jié)果中將25(OH)-D2和25(OH)-D3含量相加后與ELISA檢測值比較相關(guān)性。結(jié)果如圖2所示，x軸、y軸分別為ELISA和HPLC-MS/MS的檢測結(jié)果，所得線性關(guān)系為Y=1.3229X-2.87，相關(guān)性系數(shù)R2=0.8507，表明兩種方法一致性良好。

圖2 HPLC-MS/MS和ELISA檢測25(OH)-D濃度的線性關(guān)系

4 結(jié)論

本研究建立了一種通過HPLC-MS/MS法檢測25(OH)-D2和25(OH)-D3含量的方法，實驗經(jīng)PTDA衍生化樣本，提高了檢測的靈敏度，且只需3min即可完成樣本的檢測，實現(xiàn)了高效、快速、精準(zhǔn)檢測的目標(biāo)，同時，經(jīng)驗證，HPLC-MS/MS法與ELISA法檢測結(jié)果一致性良好，可為不同檢驗條件下選擇合適的檢驗25(OH)-D2和25(OH)-D3含量的方法，提供科學(xué)依據(jù)。