甄 琦 強(qiáng)鵬俠 秦 翔 馮 瀟 傅元欣 馮德杰
(蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司質(zhì)量檢定室 甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心,蘭州 730046)
對(duì)生物制品生產(chǎn)用原材料和輔料進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制可以降低制品中有毒雜質(zhì)以及外源因子的污染風(fēng)險(xiǎn),是保證生物制品安全有效的必要措施[1]。根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2020版(以下稱為《中國(guó)藥典》)三部《凡例》描述,檢查項(xiàng)下的“干燥失重”結(jié)果影響原材料和輔料樣品的物理常數(shù)檢測(cè)結(jié)果如比旋度等,同時(shí)也影響原材料和輔料樣品的最終含量檢測(cè)結(jié)果[2]。醋酸鈉是收錄于《中國(guó)藥典》2020版四部的藥用輔料,在生物制品的生產(chǎn)中廣泛作為pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑等[3],也可用于多糖疫苗的提純工藝[4,5]?!案稍锸е亍笔谴姿徕c的必須檢定項(xiàng)目之一,規(guī)定的范圍是38.0%~41.0%。干燥失重對(duì)于無機(jī)鹽來說,高溫失去的主要是水分,根據(jù)《中國(guó)藥典》2020版通則0831,烘箱法主要運(yùn)用精密電子天平和鼓風(fēng)烘箱[6],優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度高,但過程較繁瑣,耗時(shí)較長(zhǎng),因此找到一個(gè)能夠高效快速且準(zhǔn)確度高的代替方法尤為重要。鹵素水分儀是一種新型、快速測(cè)試待測(cè)樣揮發(fā)性成分(主要是水分)含量的儀器,同干燥失重法原理,通過鹵素?zé)艨焖偌訜針悠?,使待測(cè)樣中水分能夠在短時(shí)間之內(nèi)完全蒸發(fā),從而快速檢測(cè)出待測(cè)樣的含水值。其集稱重和烘烤為一體,在碳酸鈣水分[7]、橡膠揮發(fā)分[8]、污泥含水率[9]等的測(cè)定中表現(xiàn)突出,因此也可用于對(duì)輔料醋酸鈉水分的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)以烘箱法作為仲裁法,通過使用鹵素水分儀成功地對(duì)醋酸鈉中的水分進(jìn)行了快速檢定,并討論了影響測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度的因素,以達(dá)到快速準(zhǔn)確地得出水分檢定結(jié)果的目的。
鹵素水分儀(HX204型);電子天平(AG204型);鼓風(fēng)烘箱(PHG-9076型);醋酸鈉(三水,批號(hào)為20150708、20200305、20201019);稱量盤;變色硅膠。
1.2.1烘箱法
在120℃的烘箱中將扁形稱量瓶干燥若干小時(shí)后,將扁形稱量瓶放入干燥器中冷卻至室溫,用電子天平精密稱定扁形稱量瓶;在120℃的烘箱中再將扁形稱量瓶干燥至少1小時(shí)后,將扁形稱量瓶放入硅膠干燥器中冷卻至室溫,用電子天平精密稱定扁形稱量瓶。兩次稱重質(zhì)量以小于0.0003g視為恒重。
用電子天平精密稱定約1g樣品,置于干燥至恒重的扁形稱量瓶中在120℃的烘箱中干燥若干小時(shí)后,放入硅膠干燥器中冷卻至室溫,用電子天平精密稱定裝有樣品的扁形稱量瓶;再將裝有樣品的扁形稱量瓶在120℃的烘箱中干燥至少1小時(shí)后,放入硅膠干燥器中冷卻至室溫,用電子天平精密稱定裝有樣品的扁形稱量瓶。兩次稱重質(zhì)量以小于0.0003g視為恒重。結(jié)果計(jì)算:干燥失重=(M1+M2-M3)×100%÷M2,其中M1為扁形稱量瓶質(zhì)量?jī)纱纹骄?,M2為樣品質(zhì)量,M3為(裝有樣品的扁形稱量瓶)質(zhì)量的兩次平均值。
1.2.2鹵素水分儀法
1.2.2.1測(cè)定初始參數(shù)設(shè)定
顯示模式:g;初始質(zhì)量:關(guān)閉;控制極限值:關(guān)閉;分辨率:高;啟動(dòng)模式:手動(dòng);預(yù)熱:關(guān)閉;烘干模式:標(biāo)準(zhǔn);烘干溫度:120℃;關(guān)機(jī)判定:4(1mg/90s)。
1.2.2.2測(cè)定準(zhǔn)備
開始測(cè)試時(shí),接好電源,開機(jī)預(yù)熱至少半小時(shí)待儀器穩(wěn)定,調(diào)水平,進(jìn)行內(nèi)部溫度校準(zhǔn)及內(nèi)部天平校準(zhǔn),設(shè)定好參數(shù)方法后,調(diào)用該方法。根據(jù)界面提示將稱量盤放入儀器進(jìn)行去皮,然后將約1g樣品放入稱量盤,開始按參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)。
考察用鹵素水分儀在優(yōu)化參數(shù)下平行檢測(cè)6次的結(jié)果,以烘箱法結(jié)果為仲裁值,并計(jì)算結(jié)果的回收率?;厥章?=實(shí)測(cè)值÷仲裁值×100%,以此評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度。計(jì)算6次結(jié)果的RSD,以此評(píng)價(jià)精密度。在不同的日期由同一操作人員使用同一儀器重復(fù)測(cè)定3次,計(jì)算3次結(jié)果的RSD,以此考察日間精密度。
批號(hào)為20150708、20200305、20201019樣品烘箱法的干燥失重結(jié)果分別為39.3%、39.4%、40.1%。
2.2.1參數(shù)優(yōu)化
2.2.1.1關(guān)機(jī)判定試驗(yàn)
鹵素水分儀關(guān)機(jī)判定模式是指水分干燥的速度(1mg/Ns),即干燥1mg的水分需要多少秒時(shí)間。試驗(yàn)使用的鹵素水分儀的關(guān)機(jī)判定方法共有5種模式,分別是1mg/10s(1)、1mg/20s(2)、1mg/50s(3)、1mg/90s(4)以及為1mg/140s(5),關(guān)機(jī)判定能夠影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。表1為批號(hào)為20201019的醋酸鈉在不同關(guān)機(jī)判定下的干燥失重測(cè)定結(jié)果,其中烘干模式為標(biāo)準(zhǔn),取樣量約為1g。
表1 不同關(guān)機(jī)判定模式測(cè)定結(jié)果
由表1數(shù)據(jù)可知,模式4(1mg/90s)以及5(1mg/140s)的測(cè)定結(jié)果與烘箱法值基本一致,但模式5的耗時(shí)相對(duì)更小。因此從該模式干燥失重結(jié)果的準(zhǔn)確性及耗時(shí)考慮,關(guān)機(jī)判定5(1mg/140s)為方法最佳選擇。
2.2.1.2烘干模式試驗(yàn)
試驗(yàn)使用的HX204型鹵素水分儀根據(jù)不同的烘干溫度及升溫速率,提供了4種模式,分別是溫和、快速、標(biāo)準(zhǔn)及階梯。選擇不同的烘干模式對(duì)待測(cè)樣的測(cè)定結(jié)果及耗時(shí)有不同程度的影響。表2考察了在關(guān)機(jī)判定5的條件下,在烘干模式為標(biāo)準(zhǔn)、快速及溫和的條件下,批號(hào)為20201019的醋酸鈉的測(cè)定結(jié)果及耗時(shí)。
表2 不同烘干模式測(cè)定結(jié)果
由表2數(shù)據(jù)可知,標(biāo)準(zhǔn)、快速及溫和3種烘干模式的測(cè)定結(jié)果均接近仲裁法結(jié)果,但標(biāo)準(zhǔn)模式與仲裁結(jié)果基本一致,相對(duì)誤差最小。根據(jù)3種烘干模式的特點(diǎn),標(biāo)準(zhǔn)模式亦適合大多數(shù)樣品。綜合試驗(yàn)結(jié)果,因此選取標(biāo)準(zhǔn)模式為最優(yōu)烘干模式。
2.2.1.3取樣量試驗(yàn)
直接影響檢測(cè)結(jié)果誤差的參數(shù)還有取樣量的多少。表3是條件在關(guān)機(jī)判定模式為5,烘干模式為標(biāo)準(zhǔn),批號(hào)為20201019的醋酸鈉在不同取樣量下干燥失重的測(cè)定結(jié)果,分別稱取的質(zhì)量為約0.2g、0.5g、1g、1.5g和2g。
表3 不同取樣量測(cè)定結(jié)果
隨著樣品取樣量的增加,與仲裁法的差值有逐漸減少的趨勢(shì)。因此必須在保證結(jié)果準(zhǔn)確的情況下,盡可能減少樣品的消耗,建議選取約1g作為最優(yōu)取樣量。
綜上,確定溫度設(shè)置為120℃,樣品取樣量設(shè)置為約1g,烘干模式設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn),關(guān)機(jī)判定模式設(shè)置為5(1mg/140s),顯示設(shè)置模式為g,初始質(zhì)量設(shè)置為關(guān)閉,控制極限值設(shè)置為關(guān)閉,分辨率設(shè)置為高,啟動(dòng)模式設(shè)置為手動(dòng),預(yù)熱設(shè)置為關(guān)閉是鹵素水分儀的優(yōu)化試驗(yàn)條件。
2.2.2工作曲線
鹵素水分儀測(cè)定藥用輔料醋酸鈉水分的工作曲線如圖1所示,其水分結(jié)果隨時(shí)間逐漸增大且數(shù)值逐漸趨于平穩(wěn),最終根據(jù)關(guān)機(jī)判定模式的參數(shù)結(jié)束實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。
圖1 醋酸鈉水分測(cè)定工作曲線
2.3.1準(zhǔn)確度與精密度
從表4可以看出,試驗(yàn)所用批號(hào)為20150708、20200305和20201019的樣品平行6次的回收率分別為100.3%、100.5%、99.8%,RSD分別為0.6%、0.8%、0.3%。在不同的日期由同一試驗(yàn)操作人員使用同一儀器重復(fù)測(cè)定3次,計(jì)算3次結(jié)果的日間精密度為分別為0.4%、0.6%和0.3%,同時(shí)對(duì)批號(hào)為20201019樣品的干燥失重用烘箱法進(jìn)行了6次重復(fù)性考察,RSD為0.3%。
表4 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)
2.3.2顯著性差異
對(duì)批號(hào)為20201019的醋酸鈉的兩種方法的各6組數(shù)據(jù)進(jìn)行了顯著性差異考察。結(jié)果表明在方差齊性檢驗(yàn)中p值均大于0.05,說明鹵素水分儀法與烘箱法檢測(cè)結(jié)果的方差不存在顯著性差異。在均值的t檢驗(yàn)中,均值檢驗(yàn)的p值均大于0.05,也說明鹵素水分儀法與烘箱法的檢測(cè)結(jié)果均值不存在顯著性差異,且差分的95%置信區(qū)間包含0,也證實(shí)了二者檢測(cè)結(jié)果不存在顯著性差異。
《中國(guó)藥典》2020版測(cè)干燥失重主要用的是烘箱法,鹵素水分儀法并未收錄。研究參照“干燥失重測(cè)定法”和藥用輔料醋酸鈉的溫度條件及規(guī)定的結(jié)果范圍,用鹵素水分儀法對(duì)藥用輔料醋酸鈉的水分進(jìn)行了檢測(cè),回收率及RSD均滿足《中國(guó)藥典》2020版“分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”。鹵素水分儀法作為一種高效快速地檢測(cè)物質(zhì)揮發(fā)性成分的方法,有望能夠代替烘箱法用于《中國(guó)藥典》2020版規(guī)定的具有“干燥失重”檢測(cè)項(xiàng)目的藥用原輔料的檢測(cè),以加快檢定周期,提升生物制品的生產(chǎn)效益。