彭維祺 孫衛(wèi)平 葉丹 榮光

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 海南?？?571101)

豬藍(lán)耳病是豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS）的俗稱，該病是由PRRS 病毒（PRRSV）引起的一種高度接觸性傳染病，以母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙以及各種年齡豬特別是仔豬呼吸道疾病為主要特征［1-2］。1987 年，美國(guó)首次報(bào)道PRRS，現(xiàn)已遍布世界各地。1996 年，中國(guó)首次報(bào)道由PRRSV 美洲經(jīng)典株所致的PRRS［1］；2006年，由PRRSV 美洲型變異株所致的高致病性PRRS（HP-PRRS）在中國(guó)爆發(fā)［3］，并迅速蔓延全國(guó)，成為危害中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的的疫病，控制該病對(duì)于保障養(yǎng)豬生產(chǎn)穩(wěn)定發(fā)展意義重大［4］。經(jīng)過(guò)多年努力，豬藍(lán)耳病呈平穩(wěn)態(tài)勢(shì)，以散發(fā)性臨床疫情為主，無(wú)嚴(yán)重疫情發(fā)生［3］。近年來(lái)，由于毒株變異，豬藍(lán)耳病毒減毒活疫苗使用效果不夠理想，存在散毒風(fēng)險(xiǎn)等，有不少養(yǎng)殖企業(yè)停止了減毒活疫苗使用，特別是種豬養(yǎng)殖企業(yè)，通過(guò)實(shí)施閉群飼養(yǎng)和自繁自養(yǎng)、檢測(cè)淘汰陽(yáng)性個(gè)體等策略，病毒感染率呈下降態(tài)勢(shì)，取得了比較理想的防控效果［5］。通過(guò)抗體監(jiān)測(cè)可正確評(píng)估豬場(chǎng)PRRSV的免疫效果和野毒感染情況［6］。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）具有操作簡(jiǎn)單、高通量、快速高效等優(yōu)點(diǎn)，是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的抗體檢測(cè)方法［7］。本研究在海南省18 個(gè)不同類型豬場(chǎng)采集血液樣品333份，采用ELISA 對(duì)血清PRRSV 抗體進(jìn)行了檢測(cè)和分析，并提出合理化建議，為海南省豬藍(lán)耳病有效防控提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)海南省無(wú)規(guī)定疫病示范區(qū)和自由貿(mào)易港建設(shè)均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

豬繁殖與呼吸綜合征抗體試劑盒（間接ELISA），批號(hào)為2020101402，購(gòu)自深圳真瑞生物科技有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀、微量移液器、恒溫培養(yǎng)箱、微量振蕩器。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及制備

1.2.1.1 樣品采集

于2020 年12 月在海南省18 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶），采集豬前腔靜脈血10 mL 置于真空采血管中，采集血樣共計(jì)333 份。其中規(guī)模免疫場(chǎng)3 個(gè)，采集血樣50 份；未免疫規(guī)模場(chǎng)11 個(gè)，采集血樣210 份；未免疫散養(yǎng)戶4個(gè)，采集血樣73份。

1.2.1.2 血清制備

室溫靜置15 min，待血清析出后，以4℃、2 500 r/min 離心15 min，將上層血清轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5 mL離心管中，-20℃保存，備用［8］。

1.2.2 樣品檢測(cè)

（1）取包被板，吸取稀釋好待檢血清100 μL加入到檢測(cè)板中；同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照1孔、陽(yáng)性對(duì)照2孔，取陰性及陽(yáng)性對(duì)照各100μL分別加入反應(yīng)孔中，輕輕振勻孔中樣品（勿溢出）。（2）蓋上封板膜，置37℃溫育30 min。（3）小心揭開封板膜，甩掉板孔中的溶液，每孔加250 μL 工作濃度洗滌液后甩去孔內(nèi)液體，重復(fù)4～6 次，最后在干凈吸水紙上拍干。（4）每孔加酶結(jié)合物100 μL，蓋上封板膜，置于37℃溫育30 min。（5）小心揭開封板膜，甩掉板孔中的溶液，洗滌4～6 次，方法同（3）。切記最后在干凈吸水紙上拍干。（6）每孔各加入顯色液100 μL，輕微震蕩混勻、蓋上封板膜于37℃閉光顯色10 min。（7）每孔加入50μL 終止液，使反應(yīng)終止，10 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀于450 nm（630 nm作參比波長(zhǎng)）讀取吸光度OD值。

結(jié)果判定：試驗(yàn)OD陰性對(duì)照＜0.2，同時(shí)OD陽(yáng)性對(duì)照＞0.5， 試 驗(yàn) 成 立 。 判 定 標(biāo) 準(zhǔn) ：（OD樣品－OD陰性對(duì)照） ÷ （OD陽(yáng)性對(duì)照－OD陰性對(duì)照） ＝IRPC。IRPC≥0.4則判為陽(yáng)性，否則判為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 總體血清抗體檢測(cè)結(jié)果

18個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）333份豬血清抗體檢測(cè)結(jié)果見表1。其中免疫規(guī)模場(chǎng)、未免疫規(guī)模場(chǎng)、未免疫散養(yǎng)戶血清抗體陽(yáng)性率分別為68%、0、12%。

表1 血清抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2 免疫規(guī)模場(chǎng)血清抗體檢測(cè)結(jié)果

3 個(gè)免疫規(guī)模場(chǎng)血清抗體陽(yáng)性率分別為100%、45%、50%，除A 場(chǎng)達(dá)到理想保護(hù)以外，其余2 場(chǎng)均未達(dá)到理想保護(hù)（表2）。

表2 免疫規(guī)模場(chǎng)血清抗體檢測(cè)結(jié)果

2.3 未免疫養(yǎng)殖場(chǎng)血清抗體檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 未免疫規(guī)模場(chǎng)血清抗體

11個(gè)未免疫規(guī)模場(chǎng)血清抗體陽(yáng)性率均為0（表3），凈化效果均比較理想。

表3 未免疫規(guī)模場(chǎng)血清抗體檢測(cè)結(jié)果

2.3.2 未免疫散養(yǎng)戶血清抗體

4 個(gè)未免疫散養(yǎng)戶血清抗體陽(yáng)性率分別為10%、5%、31%、10%，抗體總陽(yáng)性率為12%（表4），存在一定的野毒感染風(fēng)險(xiǎn)。

表4 未免疫散養(yǎng)戶血清抗體檢測(cè)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

從檢測(cè)結(jié)果可以看出，3 個(gè)免疫規(guī)模場(chǎng)血清抗體陽(yáng)性率分別為100%、45%、50%，抗體總陽(yáng)性率為68%，按照藍(lán)耳病抗體水平陽(yáng)性率大于80%為全體免疫合格［9］，僅有1個(gè)場(chǎng)達(dá)到理想保護(hù)狀態(tài)，其余2場(chǎng)均未達(dá)到理想保護(hù)。可能是由于：（1）免疫接種不規(guī)范，比如免疫程序不合理、疫苗注射部位或注射方式不科學(xué)、注射劑量不準(zhǔn)等；（2）疫苗質(zhì)量存在問(wèn)題，例如疫苗存貯、運(yùn)輸條件不合理、操作不規(guī)范、疫苗污染等情況；（3）飼養(yǎng)管理不當(dāng)，豬生長(zhǎng)環(huán)境差、飼料和飲水不潔凈等；（4）其他免疫抑制病的存在，豬如果感染了豬瘟、豬圓環(huán)病毒病等免疫抑制類疾病，在注射疫苗后，豬體不產(chǎn)生免疫應(yīng)答，造成免疫失?。?0］。因本研究所用的抗體檢測(cè)試劑盒暫不能區(qū)分所檢測(cè)抗體為感染抗體還是免疫抗體，散養(yǎng)戶血清抗體陽(yáng)性可能為野毒感染，也可能是母源抗體、購(gòu)入已免疫仔豬等多種因素引起的［11］。未免疫規(guī)模場(chǎng)血清抗體陽(yáng)性率均為0，提示未免疫規(guī)模場(chǎng)通過(guò)生物安全防控和檢測(cè)凈化可以達(dá)到理想效果。

動(dòng)物疫病凈化是一項(xiàng)復(fù)雜的工作，需要合理制定區(qū)域凈化方案，構(gòu)建嚴(yán)密的檢測(cè)系統(tǒng)及嚴(yán)格的監(jiān)督系統(tǒng)［12］。目前PRRS 已經(jīng)退出了國(guó)家強(qiáng)制免疫計(jì)劃，但按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 《2020 年國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》要求，應(yīng)每半年開展一次病原學(xué)和血清學(xué)監(jiān)測(cè)，對(duì)疑似患PRRS 豬的肺和流產(chǎn)胎兒胎衣進(jìn)行病毒RNA 的提取，通過(guò)RTPCR 擴(kuò)增，選取陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物并進(jìn)行克隆、測(cè)序，與PRRSV代表毒株的序列進(jìn)行比較［13-14］，對(duì)未免疫豬場(chǎng)抗體陽(yáng)性豬和免疫豬場(chǎng)病原鑒定陽(yáng)性豬均應(yīng)進(jìn)行淘汰，同時(shí)制定科學(xué)、合理的監(jiān)測(cè)計(jì)劃，按照完善的疫病凈化方案，并不斷對(duì)陽(yáng)性豬只進(jìn)行排查、淘汰，以期達(dá)到有效控制和逐步凈化疫病的目的［15］。

3.2 結(jié)論

本研究采用間接ELISA 法對(duì)海南省18 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）豬藍(lán)耳病抗體進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，由于多方面原因，免疫規(guī)模場(chǎng)免疫效果不理想，未免疫規(guī)模場(chǎng)通過(guò)生物安全防控和檢測(cè)凈化免疫效果較好，未免疫散養(yǎng)戶存在野毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，為豬藍(lán)耳病疫病的科學(xué)防控提供了參考依據(jù)。