王玉，趙宏宇，劉新宇，邸琳

（吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林長春130012）

女性絕經(jīng)期后，由于卵巢功能減退，內(nèi)源性雌激素分泌減少，導(dǎo)致骨重建失衡，骨吸收大于骨形成，從而導(dǎo)致絕經(jīng)期女性骨質(zhì)疏松[1]。中藥防治骨質(zhì)疏松癥是臨床醫(yī)學(xué)中的一個(gè)治療手段，在治療骨質(zhì)疏松方面有獨(dú)特的療效，中藥增加了鈣吸收率，改變骨組織結(jié)構(gòu)等機(jī)理防治骨質(zhì)疏松[2-4]。

在中醫(yī)理論中，淫羊藿中有效成分是淫羊藿苷，通過補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨而達(dá)到治療目的，以其補(bǔ)腎陽，益腎精之功而為君藥[5]。骨碎補(bǔ)有增加骨密度和骨強(qiáng)度作用，能促進(jìn)骨細(xì)胞骨形態(tài)形成[6]。鹿骨主治虛勞骨弱、風(fēng)濕痹痛等，具有補(bǔ)虛羸，強(qiáng)筋骨等功效[7,8]。本研究以去卵巢所致骨質(zhì)疏松大鼠為研究對象，鹿羊顆粒為受試物，研究受試物對去勢大鼠的骨重量、骨密度和骨病理的影響，并檢測Ⅰ型膠原蛋白C末端肽（CTX-1）、Ⅰ型原膠原N端前肽（PINP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、骨堿性磷酸酶（BALP）和骨鈣素（BGP;OCN）等骨吸收和破骨細(xì)胞活性的標(biāo)志物[9,10]。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

72只SPF級(jí)SD雌性大鼠，體重（200±20）g，長春億斯，動(dòng)物許可證：SCXK（吉）-2018-0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.2 藥物

鹿羊顆粒，主要成分為淫羊藿和骨碎補(bǔ)水提取物及鹿骨粉，吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院自制；注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司；補(bǔ)佳樂（戊酸雌二醇），DELPHARMLille S.A.S；戊巴比妥鈉，上?；瘜W(xué)試劑分裝廠，批號(hào)：84-06-12；CTX-1、PINP、TRAP、BALP、BGP;OCNELISA試劑盒，武漢華美生物工程有限公司。

1.3 儀器

HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市凱航儀器有限公司；Direct-Pure System超純水系統(tǒng)，購自Rephile Bioscierce，Ltd；DNM-9602型酶標(biāo)儀，北京普朗新技術(shù)有限公司；Pl403型天平，METTLERTOLEDO；LQ-C5001精密天平，上?，幮码娮涌萍加邢薰?；SX2-2.5-10型馬弗爐，上海喆鈦機(jī)械；雙能X射線骨密度儀，Ultra-Focus，VIS-10 15，美國Faxitron。

2 試驗(yàn)方法

2.1 制備大鼠去卵巢模型及分組給藥

雌性大鼠72只，選取60只大鼠作為手術(shù)組。禁食12～16 h，大鼠稱重，用戊巴比妥鈉麻醉后，俯臥，沿脊柱兩側(cè)2 cm處周圍剃毛備皮，消毒后在距肋骨下方和脊柱兩側(cè)2 cm處分別切開1 cm大小切口，切口視野直達(dá)腹腔，露出卵巢脂肪團(tuán)，拉出脂肪團(tuán)與部分子宮，扎緊卵巢與子宮連接處，摘除雙側(cè)卵巢后放回腹腔，切口分層縫合后消毒。假手術(shù)組的12只大鼠采用相同手術(shù)步驟，拉出卵巢脂肪團(tuán)，僅去掉部分脂肪后將卵巢與子宮放回腹腔，縫合。所有大鼠連續(xù)3 d肌注青霉素（4 104U/kg），以防感染。

術(shù)后7 d，手術(shù)組大鼠隨機(jī)分為5組，分別為模型組、陽性藥組（戊酸雌二醇）、鹿羊顆粒高劑量組、鹿羊顆粒中劑量組和鹿羊顆粒低劑量組。鹿羊顆粒高、中和低劑量組大鼠分別按4.5 g/（kg bw）、3 g/（kg bw）和1.5 g/（kg bw）灌胃鹿羊顆粒的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，陽性藥組灌胃1.0 mg/（kg bw）補(bǔ)佳樂的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，假手術(shù)組和對照組大鼠灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，所有大鼠每日灌胃1次，灌胃溶液的體積均為10 mL/（kg bw），連續(xù)12周。每周稱體重1次，根據(jù)體重調(diào)整給予受試物體積。

2.2 動(dòng)物處理及測定指標(biāo)

2.2.1 動(dòng)物處理試驗(yàn)結(jié)束前大鼠禁食12 h，戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，采用腹主動(dòng)脈取血，剝離肌肉韌帶等組織后，左側(cè)股骨用于骨密度測定和骨鈣測定，右側(cè)股骨用于骨組織病理學(xué)檢查。離心取血清，ELISA法測定血清中TRAP、BALP、BGP;OCN、CTX-1和PINP含量。

2.2.2 骨密度測定用雙能X射線小動(dòng)物骨密度儀直接掃描測定骨密度。

2.2.3 股骨指數(shù)和鈣含量測定大鼠處死后，取左側(cè)股骨放入烘箱中105℃烘至恒重后，稱量重量。再置于電爐上碳化至無煙后，置于馬弗爐中，550℃灰化至恒重，用股骨灰分加硝酸（1+1）消化，消化完全后加水定容，根據(jù)需要稀釋后用EDTA溶液滴定（EDTA溶液使用前需測滴定度），分別計(jì)算骨鈣含量。

2.2.4 抗酒石酸酸性磷酸酶、骨堿性磷酸酶、骨鈣素、I型膠原蛋白C末端肽和I型原膠原N端前肽取血后離心，血清用ELISA試劑盒測定抗酒石酸酸性磷酸酶、骨堿性磷酸酶、骨鈣素、I型膠原蛋白C末端肽和I型原膠原N端前肽。

2.2.5 骨組織病理學(xué)檢查取大鼠右側(cè)股骨，放入甲醛溶液浸泡后，進(jìn)行HE染色，茜素紅S染色。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組藥物對大鼠體重的影響

由表1可見，模型組體重與假手術(shù)組相比，增重明顯，具有顯著性（P＜0.01），有研究報(bào)道雌激素對脂肪的合成代謝有抑制作用，雌性大鼠切除卵巢后，雌激素水平紊亂，所以大鼠脂肪沉積，造成了體重的增長[11-13]。與模型組相比，陽性藥組為雌激素，所以大鼠體內(nèi)雌激素減少量較小，體重均顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，高、中、低劑量組體重增重均無顯著變化，但有增加趨勢，分析原因可能是中藥中滋補(bǔ)成分起的作用，增加了肌肉和骨的重量（P＞0.05）。

表1 實(shí)驗(yàn)藥物對大鼠體重的影響Table 1 Effects of drugs on the body weight of rats

3.2 實(shí)驗(yàn)藥物對大鼠股骨指數(shù)、骨密度及骨鈣百分比的影響

由表2可見，模型組與假手術(shù)組比較，股骨指數(shù)、骨密度及骨鈣百分比差異性顯著（P＜0.01），并且數(shù)值顯著低于假手術(shù)組；陽性藥組和高劑量組與模型組比較，骨鈣百分比和骨密度值顯著增加（P＜0.05），中劑量組和低劑量組中骨鈣百分比和骨密度值無顯著性差異（P＞0.05）；陽性藥組與模型組比較，股骨指數(shù)顯著增加（P＜0.05），其他組的股骨指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。

表2 藥物對大鼠股骨指數(shù)、骨密度及骨鈣百分比的影響Table 2 Effects of drugs on the weight ratio,bone calcium percentage,and bone density of the rat femur

圖1為大鼠左側(cè)股骨雙能X射線掃描骨密度圖， 每5只一張圖片。

圖1 骨密度掃描圖片F(xiàn)ig.1 The scan image of the bone mineral density

3.3 藥物對大鼠的TRAP、BALP、BGP;OCN、CTX-1和PINP的影響

血清檢測指標(biāo)結(jié)果見表3，與假手術(shù)組相比，模型組的各項(xiàng)指標(biāo)均升高，證明大鼠骨密度低下的模型造模成功。與模型組相比，陽性藥組與高劑量組的TRAP、BALP和PINP具有顯著性差異，顯著降低；CTX-1、BGP;OCN雖與模型組比較有所降低，但未見顯著性差異。中劑量組的BALP、PINP與模型組比較具有顯著性差異（P＜0.05）。低劑量組的所有指標(biāo)與模型組比較均未見明顯差異（P＞0.05）。

表3 藥物對大鼠TRAP、BALP、BGP;OCN、CTX-1、PINP的影響Table 3 Effects of drugs on the TRAP、BALP、BGP;OCN、CTX-1 and PINP of rats

3.4 股骨病理學(xué)檢查

圖2為股骨病理學(xué)檢查結(jié)果，顯示假手術(shù)組骨組織結(jié)構(gòu)連續(xù)、完整、粗壯，呈網(wǎng)狀分布，占比面積較大，連接間隔內(nèi)造血組織成分分布較多，脂肪成分分布較少。與假手術(shù)組比較，模型組骨小梁富集在股骨干骺段，骨量低，骨組織結(jié)構(gòu)不完整，骨脆性增加，表明骨質(zhì)疏松造模成功。與模型組比較，陽性藥組骨組織成分增加，鹿羊顆粒高劑量組、中劑量組和低劑量組骨小梁稀疏，變細(xì)、斷裂的程度有所減輕。證明鹿羊顆粒可以有效減輕骨質(zhì)疏松的程度，但是骨質(zhì)疏松減輕的程度不同，高劑量組減輕骨質(zhì)疏松的程度高于中劑量組和低劑量組。

HE染色與茜素紅S染色結(jié)果見表4，根據(jù)評(píng)分 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分[14]。

表4 HE染色與茜素紅S染色積分統(tǒng)計(jì)Table 4 The HE staining and alizarin red S staining integral statistics

4 討論與結(jié)論

中藥防治骨質(zhì)疏松癥機(jī)理的研究已成為近年來研究的一個(gè)熱點(diǎn)[15]，從骨組織水平的研究認(rèn)為，中藥可以通過調(diào)節(jié)下丘腦、垂體和多個(gè)靶腺軸的功能促進(jìn)腸鈣吸收，調(diào)節(jié)體內(nèi)微量元素的平衡和改善骨的內(nèi)部結(jié)構(gòu)等機(jī)理防治骨質(zhì)疏松[16,17]。

在骨形成標(biāo)志物測定結(jié)果中，BALP是骨特異性堿性磷酸酶，是成骨細(xì)胞的一種細(xì)胞外酶，當(dāng)骨骼礦化受阻時(shí)，成骨細(xì)胞合成大量堿性磷酸酶，使血清中BALP明顯升高[18]。PINP是I型原膠原N端前肽，是監(jiān)測骨代謝微小變化最敏感的指標(biāo)[19]。本實(shí)驗(yàn)中去卵巢所致骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度顯著降低，骨代謝標(biāo)志物PINP水平顯著升高，證明骨質(zhì)疏松癥較為嚴(yán)重。BGP;OCN是骨鈣素，是骨骼礦化的必需物質(zhì)，是骨質(zhì)中最豐富的非膠原蛋白[20]。模型組大鼠血清BGP;OCN水平雖然升高但是沒有達(dá)到顯著水平，可能是因?yàn)檠逯蠦GP;OCN顯著升高發(fā)生在骨質(zhì)疏松合并發(fā)生骨折后[21]，BGP;OCN越高提示骨轉(zhuǎn)換能力越強(qiáng)，將消耗成骨細(xì)胞的再生能力[22]，加速成骨細(xì)胞的凋亡，成骨細(xì)胞越少，骨量丟失越嚴(yán)重，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松也越嚴(yán)重[23]。

在骨吸收標(biāo)志物血清測定指標(biāo)中，TRAP是抗酒石酸酸性磷酸酶[24]，模型組血清中TRAP顯著增高，是由于去卵巢的大鼠破骨細(xì)胞活性增加，骨重建失衡，骨吸收大于骨形成，并且TRAP與骨密度呈顯著負(fù)相關(guān)[25]。CTX-1是Ⅰ型膠原蛋白C末端肽，其水平反映了破骨細(xì)胞骨吸收活性，是骨吸收的重要生化標(biāo)志物[26]。血清中CTX-1指標(biāo)數(shù)值在本實(shí)驗(yàn)中未見顯著變化，可能是除受骨吸收影響外，還與自身運(yùn)動(dòng)和高鈉飲食等因素相關(guān)[27,28]，雖然大鼠已造成骨質(zhì)疏松模型，但情況已趨于穩(wěn)定，所以血清中CTX-1并未有顯著性差異[29]。

綜上考慮，鹿羊顆粒高劑量與陽性藥和模型組相比，具有增加去卵巢大鼠骨礦成分和骨基質(zhì)的作用，可以減緩骨量流失和減輕骨質(zhì)疏松的程度，并且在血清測定結(jié)果中，鹿羊顆粒具有降低血清中TRAP、BALP和PINP含量的作用。本研究中的鹿羊顆粒為中藥復(fù)方提取物，未來可以對其增加骨密度的機(jī)制進(jìn)一步研究以及對產(chǎn)品進(jìn)行多方向研發(fā)。