李貞卓，姜銳，劉建增，徐曉浩，趙大慶※

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130021；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林長春130021）

皮膚是人體自身的天然屏障系統(tǒng)，皮膚的最外層表皮層可保護(hù)機(jī)體內(nèi)部免受紫外線輻射、化學(xué)物質(zhì)威脅和微生物病原體感染等侵害，防止水分從體內(nèi)流失，維持體內(nèi)代謝平衡。當(dāng)皮膚受到外界紫外線輻射等刺激時，其表皮屏障保護(hù)功能會下降,從而導(dǎo)致嚴(yán)重的亞健康狀態(tài)或皮膚疾病，如干性皮膚、特應(yīng)性皮炎和魚鱗病等[1,2]，因此，尋找安全、高效的天然表皮損傷修復(fù)劑對于修復(fù)表皮結(jié)構(gòu)功能障礙具有重要的臨床意義，是治療皮膚疾病及亞健康皮膚的重中之重。

紫外線是導(dǎo)致皮膚損傷的主要外在因素。紫外線照射后，參與表皮角化包膜形成的主要蛋白絲聚蛋白（Filaggrin,FLG）的表達(dá)顯著降低導(dǎo)致表皮結(jié)構(gòu)受損，進(jìn)一步破壞負(fù)責(zé)表皮水分及溶質(zhì)運(yùn)輸?shù)乃ǖ赖鞍?（Aquaporin-3,AQP3）的表達(dá)，加劇了表皮損傷引起的皮膚干燥脫水、紅腫及過敏等癥狀[3]。已有研究表明，中藥可用于保護(hù)皮膚的表皮結(jié)構(gòu)功能，并且會提高補(bǔ)水鎖水因子的表達(dá)[4,5]。本研究選用傳統(tǒng)名貴中藥人參（Panax ginseng C.A.Meyer），其為五加科植物，常用入藥部位為其干燥的植物根和根莖。眾所周知，人參被認(rèn)為是一種潛在的治療劑，可促進(jìn)傷口愈合，減少皮膚炎癥，抑制黑色素生成[6,7]。但對人參中具有表皮損傷修復(fù)作用的功效成分的研究鮮有報(bào)道。本研究以FLG和AQP3蛋白表達(dá)為檢測指標(biāo)，建立了UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞損傷模型，利用此模型篩選出了具有表皮損傷修復(fù)功效的人參組分，并采用UVB誘導(dǎo)的無毛小鼠動物皮膚損傷模型進(jìn)一步明確其改善UVB誘導(dǎo)表皮損傷作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）購自上海富衡生物科技有限公司；用于蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)的FLG抗體和增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；用于組織免疫熒光實(shí)驗(yàn)的FLG抗體購自上海愛必信生物科技有限公司；AQP3抗體購自美國Abcam公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；FITC標(biāo)記的山羊抗兔抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；DAPI購自美國Sigma公司；酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；FluorChem HD2化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Protein Simple公司；UV交聯(lián)系統(tǒng)購自美國Hoefer Scientific Instruments公司；Cutometer?dual MPA 580測試儀購自德國Courage&Khazaka公司；Cytation 5細(xì)胞成像多模式檢測儀購自美國BioTek公司。

1.2 人參不同極性組分的制備

人參提取分離流程如圖1所示，將人參根洗凈切片粉碎，加入蒸餾水浸沒藥材，浸泡2～3h后，在100℃加熱條件下回流提取3次，每次1 h，過濾去除殘?jiān)螅喜V液干燥得到人參水提物。采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次對人參水提物進(jìn)行萃取，得到組分1（0.55% W/W）、組分2（0.98% W/W）、組分3（0.30% W/W）和組分4（2.65% W/W），最后所得水層萃取液為組分5（15.28%W/W）。

圖1 人參不同極性組分制備流程圖Fig.1 Flow chart of preparation of different polar components from ginseng

1.3 建立UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞損傷模型

將HaCaT細(xì)胞接種到6孔板中，置于含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞生長密度達(dá)到80%進(jìn)行不同劑量的UVB照射（20 mJ/cm2、40 mJ/cm2和80 mJ/cm2），照射后收取不同作用時間的細(xì)胞（12 h、24 h和48h），通過蛋白免疫印跡法檢測其表皮結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白表達(dá)情況，以確立造模條件。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測

用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液置于冰上裂解30 min后，使用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。蛋白質(zhì)樣品（50g）用12%的SDS-PAGE凝膠分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，轉(zhuǎn)膜后，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，并用TBST沖洗膜，將膜在4℃條件下與FLG和AQP3的一抗（1:500，1:1 000）孵育過夜，然后用TBST洗滌3次，并與相應(yīng)的二抗（1:5 000）在室溫下孵育1 h，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像并分析轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)條帶。

1.5 動物分組造模及給藥

SPF級雌性BALB/c無毛小鼠（6周齡），體重18～20g，購買于長春億斯動物飼養(yǎng)中心，動物許可證號：SCXK（遼）2015-0001。在實(shí)驗(yàn)開始前，所有小鼠在溫度（22±1）℃、相對濕度55%±5%的環(huán)境中適應(yīng)培養(yǎng)1周。隨時供應(yīng)充足的水和食物。所有動物實(shí)驗(yàn)程序和方案均經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審核通過。小鼠適應(yīng)培養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組、UVB模型組、UVB+組分4組和UVB+組分5組，共4組（每組5只）。除空白組外，其余各組均連續(xù)2周每天接受發(fā)射波長為312 nm的UV交聯(lián)儀照射小鼠背部皮膚每天1次，并用UVB測量計(jì)監(jiān)測UVB（280～320 nm）的輸出能量。小鼠在第1天和第2天以100 mJ/cm2的UVB劑量進(jìn)行照射，第3天和第4天以150 mJ/cm2的劑量進(jìn)行照射，隨后將劑量增加到200 mJ/cm2進(jìn)行照射直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。根據(jù)化妝品功效評價指南測試樣品常規(guī)涂抹劑量（2.0±0.1）mg/cm2，在每天UVB的照射后，分別將組分4和組分5以2 mg/cm2的劑量涂抹于UVB+組分4和UVB+組分5組小鼠背部受試皮膚區(qū)域，每天涂抹1次。

1.6 小鼠皮膚表面生理指標(biāo)檢測

實(shí)驗(yàn)過程中，采用Cutometer?dual MPA 580測試儀Tewameter?TM 300、Corneometer?CM 825和Mexameter?MX18測試探頭分別測試分析皮膚經(jīng)表皮水分流失（transepidermal water loss,TEWL）、角質(zhì)層含水量、皮膚紅斑和黑色素沉著。這些測量均在21～22℃和50%～55%濕度的特定條件下進(jìn)行，并分別在人參功效組分4和組分5治療0d和14 d后對各組進(jìn)行測量。

1.7 免疫熒光檢測

小鼠皮膚組織在4%多聚甲醛中固定24 h后，包埋并切成3m厚的切片，脫蠟，水化，與一抗（1:200）在4℃孵育過夜，然后與FITC標(biāo)記的山羊抗兔抗體（1:100）在室溫下孵育1 h。細(xì)胞核用DAPI染色。利用細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)Cytation 5對皮膚組織中的靶蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和Tukey檢驗(yàn)的多重比較，在所有實(shí)驗(yàn)中，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞損傷模型的建立

我們使用不同UVB劑量（20 mJ/cm2、40 mJ/cm2和80 mJ/cm2）照射HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞，分別照射12 h、24 h和48 h，通過免疫印跡法時間-劑量檢測結(jié)果顯示，UVB照射劑量為40 mJ/cm2和80 mJ/cm2，照射24 h后HaCaT細(xì)胞中FLG和AQP3蛋白表達(dá)水平顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而照射12 h和48 h后HaCaT細(xì)胞中FLG和AQP3蛋白表達(dá)水平均無顯著性變化。因此，本實(shí)驗(yàn)采用UVB照射劑量為40 mJ/cm2，照射24 h后建立細(xì)胞損傷模型（圖2）。

圖2 UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞損傷模型條件篩選Fig.2 Screening of UVB induced HaCaT cell damage model

2.2 人參功效組分的篩選

利用建立的細(xì)胞模型檢測人參不同極性組分對FLG和AQP3蛋白表達(dá)影響。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UVB模型組的表皮結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白FLG和AQP3的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），而用人參組分4和組分5（10g/mL）分別處理后均可使這兩種蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）（圖3）。因此，本研究利用已建立的細(xì)胞損傷模型篩選得到人參正丁醇層和水層組分具有表皮損傷修復(fù)作用。

圖3 人參功效組分4和組分5對UVB作用的HaCaT細(xì)胞中FLG和AQP3蛋白表達(dá)影響Fig.3 Effects of ginseng active component 4 and component 5 on FLG and AQP3 protein expression in UVB treated HaCaT cells

2.3 人參功效組分4和組分5對UVB誘導(dǎo)的BALB/c無毛小鼠皮膚表面生理指標(biāo)的影響

皮膚測試結(jié)果顯示，與空白組比較，UVB模型組小鼠皮膚的TEWL、紅斑值和黑色素值有所升高（P＜0.05），而角質(zhì)層含水量下降；而人參功效組分4和組分5治療組小鼠皮膚的TEWL、紅斑值和黑色素值顯著降低（P＜0.05），皮膚的角質(zhì)層含水量顯著升高，接近空白組（P＜0.05）（圖4）。動物水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明人參正丁醇層和水層組分可有效恢復(fù)小鼠皮膚表面的生理狀態(tài)，增強(qiáng)對UVB誘導(dǎo)的小鼠皮膚損傷的保護(hù)作用。

圖4 人參功效組分4和組分5對UVB作用的BALB/c無毛小鼠皮膚TEWL、角質(zhì)層含水量、紅斑值和黑色素值的影響Fig.4 Effects of ginseng active component 4 and component 5 on TEWL,stratum corneum water content,erythema value,and melanin value in UVB treated BALB/c hairless mice

2.4 人參功效組分4和組分5對UVB誘導(dǎo)的BALB/c無毛小鼠皮膚中FLG蛋白表達(dá)的影響

小鼠皮膚組織免疫熒光結(jié)果顯示，UVB模型組小鼠皮膚組織中FLG蛋白表達(dá)的綠色熒光強(qiáng)度明顯降低，經(jīng)人參組分4和組分5治療后，表皮中FLG蛋白的熒光染色強(qiáng)度明顯高于UVB模型組（圖5）。結(jié)果表明，人參正丁醇層和水層組分能顯著恢復(fù)小鼠皮膚中表皮結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白FLG的表達(dá)，有效改善UVB誘導(dǎo)的表皮結(jié)構(gòu)損傷。

圖5 人參功效組分4和組分5對UVB作用的BALB/c無毛小鼠皮膚中FLG蛋白表達(dá)的影響（20）。Fig.5 Effects of ginseng active component 4 and component 5 on FLG protein expression in UVB treated BALB/c hairless mice skin(20).

3 討論

當(dāng)機(jī)體受到紫外線輻射后，角質(zhì)層屏障結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致FLG蛋白表達(dá)下降造成表皮損傷[8,9]。FLG是角質(zhì)層屏障功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[10,11]，通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-1的交叉連接作用參與角化包膜的形成并調(diào)節(jié)表皮的水分平衡[12-14]。由于紫外線輻射后，角質(zhì)層屏障結(jié)構(gòu)受損，皮膚的補(bǔ)水、鎖水能力下降，導(dǎo)致控制皮膚水分運(yùn)輸?shù)耐ǖ朗茏?，研究發(fā)現(xiàn)AQP3是皮膚中含量最豐富的水通道蛋白[15]。有研究表明，紫外線輻射可顯著下調(diào)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中AQP3蛋白的表達(dá)，造成皮膚缺水，從而進(jìn)一步破壞表皮結(jié)構(gòu)的完整性[16,17]。由此可見，AQP3是修復(fù)表皮損傷和維持表皮水化功能中的重要因子[18,19]。因此，本實(shí)驗(yàn)以FLG和AQP3蛋白表達(dá)水平為檢測指標(biāo)，通過對UVB造模劑量和時間的篩選和優(yōu)化，建立了細(xì)胞損傷模型。

人參是最有價值的草本植物之一，自古以來就被中國、日本及韓國等亞洲國家用作治療藥物和保健品。根據(jù)以往的研究報(bào)道，人參中含有人參皂苷、多糖、寡糖、多肽、脂肪酸和氨基酸等多種活性成分。本研究采用不同極性的有機(jī)溶劑對人參水提液進(jìn)行分步萃取，利用UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型進(jìn)行活性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正丁醇層萃取液（組分4）和水層萃取液（組分5）具有顯著的表皮損傷修復(fù)功效。根據(jù)其萃取液極性大小，我們推測組分4可能主要含有人參皂苷成分，組分5可能主要含有極性較大的糖類成分。已有研究表明，人參皂苷Rb2可以通過降低活性氧（ROS）的產(chǎn)生和基質(zhì)金屬蛋白酶的活性延緩皮膚衰老[20]；人參皂苷Rb1可以通過降低皮膚黑色素含量提亮膚色[21]；人參寡糖能通過抑制ROS介導(dǎo)的MAPK和NF-B信號通路發(fā)揮抗光老化功效[22]。但人參活性成分對表皮損傷修復(fù)的研究鮮有報(bào)道。從本研究結(jié)果看，人參中可能存在兩種不同極性的具有表皮損傷修復(fù)作用的組分，即正丁醇層和水層組分。

本研究通過BALB/c無毛小鼠動物模型做了進(jìn)一步驗(yàn)證，明確了人參正丁醇層和水層組分具有表皮損傷修復(fù)功效，能有效恢復(fù)紫外線UVB對表皮結(jié)構(gòu)造成的損傷，并且可能改善因表皮損傷后引起的干燥失水、粗糙、脫屑、紅腫發(fā)炎和色素沉著等癥狀?；诒疚膶?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)這兩種人參功效組分可顯著性地恢復(fù)皮膚的TEWL、角質(zhì)層含水量、紅斑值和黑色素沉著。為了更直觀地表達(dá)其對表皮損傷的修復(fù)作用，文中采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外用涂抹人參正丁醇層和水層組分可有效抑制小鼠因UVB照射后下調(diào)的表皮結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白FLG的表達(dá)，這與細(xì)胞水平結(jié)果相符。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從人參中篩選出的正丁醇層和水層組分具有顯著的表皮損傷修復(fù)功效，其可通過增強(qiáng)表皮結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白及補(bǔ)水、鎖水因子的表達(dá)，恢復(fù)受損的表皮結(jié)構(gòu)，這將為其作為皮膚損傷修復(fù)成分的研制提供有效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和參考價值，為中醫(yī)藥更為廣泛的應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的科學(xué)依據(jù)。