王鑫鑫 ， 陳梓璐 ， 尹 星 ， 劉 璐 ， 崔博凡 ， 張 鵬,2

(1. 沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院 ， 遼寧 撫順 113122 ; 2. 俄羅斯濱海國立農(nóng)學(xué)院 ， 俄羅斯 烏蘇里斯克市 692500)

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是胰酶激活后引起胰腺組織自身消化所致的急性炎癥介質(zhì)反應(yīng)，可誘發(fā)全身炎性介質(zhì)反應(yīng)，并惡化為多器官衰竭甚至死亡[1]。在AP中，通過測定血清淀粉酶活性進(jìn)行臨床診斷[2]，原因是血清淀粉酶主要來源是胰腺，當(dāng)胰腺出現(xiàn)炎性反應(yīng)時(shí)，胰蛋白酶分泌過度旺盛，引起血清淀粉酶含量升高。目前，AP在犬、貓中發(fā)病率非常高[3]，但臨床對于其發(fā)病原因及其發(fā)病機(jī)制知之甚少，迫切需要建立一種理想的AP動物模型供其相關(guān)研究。近年來，AP造模方法有許多種，普遍采用腹腔注射L-精氨酸的方法進(jìn)行誘導(dǎo)，但國內(nèi)外對L-精氨酸的注射劑量、給藥次數(shù)以及造模時(shí)間略有差別。因此，本試驗(yàn)在前人基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，全面系統(tǒng)地比較不同時(shí)間、不同劑量L-精氨酸最佳的造模條件，以期為臨床研究和治療AP提供穩(wěn)定的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性昆明小鼠54只，體重18～22 g，SPF級，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號為SCXK(遼)2015—0001。

1.2 試驗(yàn)分組與設(shè)計(jì) 試驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。將小鼠隨機(jī)分成9組，每組6只，分別為對照組、不同時(shí)間組和不同劑量組。不同劑量組每組注射劑量分別為2、4、6 g/(kg·bw)和8 g/(kg·bw) 的20%L-精氨酸，分3次注射，每次間隔20 min，同時(shí)對照組注射等體積0.9%NaCl。不同時(shí)間組分別于注射后6、12、24 h和48 h進(jìn)行取樣。收集血液，一部分用于血常規(guī)檢查；剩余部分離心制備血清用于血清淀粉酶活性的測定；分離各組小鼠的胰腺組織，用于制備病理組織切片。

1.3 試驗(yàn)材料 L-精氨酸，購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，使用時(shí)用0.9%生理鹽水配制成20% L-精 氨酸溶液，pH為7；血清淀粉酶檢測試劑盒和蘇木精-伊紅染色劑等其他試劑，均購自南京建成生物科技有限公司。

1.4 血清樣本制備 將采集到的全血置于1.5 mL離心管中，低溫4 ℃ 1 000 r/min離心10 min，移出上層血清置于-20 ℃冰箱中保存。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 白細(xì)胞數(shù)量的測定 采用干式血細(xì)胞分析儀進(jìn)行測定，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.5.2 組織病理學(xué)檢查 取胰腺組織樣本后放置在10%甲醛溶液中浸泡48 h，用來制成石蠟切片，置于光鏡下觀察其病理變化。

1.5.3 血清淀粉酶活性測定 采取碘-淀粉比色法測定血清淀粉酶活性，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 所有數(shù)據(jù)需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用SPSS Statistics 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行一維方差分析，經(jīng)過分析之后的各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均列入三線表中。

2 結(jié)果

2.1 小鼠狀態(tài)觀察 本試驗(yàn)不同時(shí)間組和不同劑量組小鼠均出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，其中造模6 h、12 h、2 g/(kg·bw)、4 g/(kg·bw)組和6 g/(kg·bw)組小鼠均出現(xiàn)精神沉郁、聚集成堆，個(gè)別小鼠呼吸加深、加快等臨床癥狀。8 g/(kg·bw)組小鼠表現(xiàn)為體溫下降，團(tuán)縮一起，飲食廢絕，且該組小鼠注射2 h內(nèi)均死亡，死亡率為100%。

2.2 白細(xì)胞數(shù)量測定 與對照組進(jìn)行對比，時(shí)間組和劑量組小鼠的白細(xì)胞數(shù)量都有明顯的上升，其中6 h、12 h組和24 h組小鼠的白細(xì)胞數(shù)量極顯著上升(P<0.01)，48 h組小鼠白細(xì)胞數(shù)量顯著上升(P<0.05)， 見表1；劑量組小鼠的白細(xì)胞數(shù)量均極顯著升高(P<0.01)，見表2。

表1 小鼠急性胰腺炎造模時(shí)間篩選的白細(xì)胞數(shù)量檢測結(jié)果Table 1 Detection results of WBC count in mice with acute pancreatitis by modeling time screening

表2 小鼠急性胰腺炎造模劑量篩選的白細(xì)胞數(shù)量檢測結(jié)果Table 2 Detection results of WBC count in mice with acute pancreatitis by modeling dose screening

2.3 血清淀粉酶活性測定 與對照組進(jìn)行對比，時(shí)間組和劑量組小鼠的血清淀粉酶活性均極顯著上升(P<0.01)，見表3、4。試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)小鼠已經(jīng)發(fā)病，需要進(jìn)一步觀察胰腺組織的病理變化，綜合判斷小鼠的急性胰腺炎的病情狀況。

表3 小鼠急性胰腺炎造模時(shí)間篩選的血清淀粉酶活性的檢測結(jié)果Table 3 Detection results of serum amylase activity in mouse with acute pancreatitis by modelling time screening

表4 小鼠急性胰腺炎造模劑量篩選的血清淀粉酶活性的檢測結(jié)果Table 4 Detection results of serum amylase activity in mouse with acute pancreatitis by modeling dose screening

2.4 胰腺組織病理形態(tài)學(xué)檢查 病理切片結(jié)果圖1，按炎癥分級情況進(jìn)行病理學(xué)評定：對照組小鼠的胰腺組織紋理清楚，腺泡細(xì)胞形態(tài)正常，未見炎性細(xì)胞浸潤、水腫、充血和組織壞死(圖1A)；劑量組和時(shí)間組小鼠胰腺組織都出現(xiàn)不同程度的組織崩解，腺泡細(xì)胞壞死，胰腺導(dǎo)管增生及擴(kuò)張，局部有充血并伴有大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(圖1B～1H)，尤其以6 h組和12 h組最為嚴(yán)重(圖1B、圖1C)，24 h組胰腺組織病變程度降低(圖1D)；2 g/(kg·bw)劑量組胰腺實(shí)質(zhì)改變，可見少量的點(diǎn)狀出血點(diǎn)和水腫(圖1F)；4 g/(kg·bw)和6 g/(kg·bw)劑量組胰腺組織炎癥較明顯(圖1G、1H)。

圖1 小鼠胰腺組織病理形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果 (200×)Fig.1 Results of histopathological examination of mouse pancreas (200 ×)A：對照組; B：造模時(shí)間6 h組; C：造模時(shí)間12 h組; D：造模時(shí)間24 h組; E：造模時(shí)間48 h組; F：造模劑量2 g/(kg·bw)組; G：造模劑量4 g/(kg·bw)組; H：造模劑量6 g/(kg·bw)組A：Control group; B：Modeling time 6 h group; C：Modeling time 12 h group; D：Modeling time 24 h group; E：Modeling time 48 h group; F：Modeling dose 2 g/(kg·bw) group; G：Modeling dose 4 g/(kg·bw) group; H：Modeling dose 6 g/(kg·bw) group

3 討論

急性胰腺炎是臨床常見疾病，據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，臨床犬貓胰腺炎發(fā)病率逐年升高，且具有較高死亡率。因此，為了更好的了解AP發(fā)病機(jī)制，建立穩(wěn)定的動物模型至關(guān)重要，而且可以為相關(guān)藥物的研發(fā)提供前期保障。小鼠急性胰腺炎模型建立方法有很多，20%L-精氨酸溶液為常見誘導(dǎo)藥物之一，其具有操作簡單、重復(fù)性高、對模型動物應(yīng)激較小等優(yōu)點(diǎn)，并且有學(xué)者通過比較牛黃膽酸鈉、雨蛙肽、L-精氨酸誘導(dǎo)AP效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，L-精氨酸誘導(dǎo)AP動物模型更具有重復(fù)性[4-5]。通過前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，配成pH=7、濃度為20%L-精氨酸溶液誘導(dǎo)急性胰腺炎小鼠的存活率較高，因此本試驗(yàn)采用20%L-精氨酸溶液作為誘導(dǎo)藥物。據(jù)國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，大部分學(xué)者就給藥劑量或時(shí)間進(jìn)行單方面考查AP模型[6-9]，本試驗(yàn)不僅對誘導(dǎo)藥物進(jìn)行比較，而且從給藥時(shí)間和給藥劑量兩方面同時(shí)衡量模型穩(wěn)定性，更加符合AP模型建立的實(shí)際情況。除此以外，本試驗(yàn)還改良了給藥次數(shù)，大部分報(bào)道為20%L-精氨酸分2次注射到小鼠腹腔中，注射間隔為1 h[10-11]，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)同樣劑量下分3次給藥，每次間隔20 min，試驗(yàn)小鼠不僅存活率較高，而且模型更加穩(wěn)定。據(jù)此通過本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，6 h、12 h、24 h、2 g/(kg·bw)、4 g/(kg·bw) 和6 g/(kg·bw)各組小鼠的檢測指標(biāo)雖與對照組對比均極顯著上升(P<0.01)，但造模時(shí)間為6 h、給藥劑量為4 g/(kg·bw)時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到峰值且穩(wěn)定，小鼠存活率也較高。因此，當(dāng)20%L-精氨酸劑量為4 g/(kg·bw)、造模時(shí)間為6 h時(shí)， 視為最佳造模條件。