葉梓茵 ， 歐慧慧 ， 丁月霞

(廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系 ， 廣東 湛江 524088)

早在1957年，魚類鏈球菌病在日本被發(fā)現(xiàn)，隨后世界各地陸續(xù)出現(xiàn)魚類感染鏈球菌的情況[1]。我國的羅非魚養(yǎng)殖主要集中在南方地區(qū)，引起我國南方羅非魚鏈球菌病的致病菌主要是無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)，羅非魚對鏈球菌高度敏感，全年可發(fā)病[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì),近幾年我國南方大部分羅非魚養(yǎng)殖魚塘，由鏈球菌病引起羅非魚死亡的死亡率普遍在30%～50%[3]。同時(shí)，無乳鏈球菌也是人、牛和魚等多種生物的重要致病菌之一[4]，因此，羅非魚感染無乳鏈球菌除了會(huì)給羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失外，還有引起食用者一同感染無乳鏈球菌的風(fēng)險(xiǎn)。羅非魚感染無乳鏈球菌后魚類腸道優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)會(huì)被改變,導(dǎo)致腸道內(nèi)潛在致病菌數(shù)量增加[5]，進(jìn)而增加了羅非魚無乳鏈球菌與其他魚類致病菌混合感染的風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)主要通過檢測從廣東省肇慶市某羅非魚養(yǎng)殖場中分離出的羅非魚無乳鏈球菌(ZQ0910)的致病力強(qiáng)弱、部分抗菌藥對其的作用效果以及所攜帶的致病基因3個(gè) 方面，為該羅非魚養(yǎng)殖場提供有參考價(jià)值的防治措施。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株 試驗(yàn)所用菌株為尼羅羅非魚無乳鏈球菌野生菌株(ZQ0910)，分離自廣東省肇慶市某羅非魚養(yǎng)殖場，由廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級昆明小鼠，體重18～22 g， 雌雄各半，購自廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號SYXK(粵)2015—0104。

1.3 主要藥品與試劑 試驗(yàn)所用12種抗菌藥由廣東海洋大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院提供；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(BHI)，購自英國OXOID公司；LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，購自廣東環(huán)凱生物有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；rTaq酶，購自TaKaRa公司。

1.4 菌株半數(shù)致死量(LD50)測定 將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，無異常情況開始試驗(yàn)。將30只小鼠隨機(jī)分為5個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)空白對照組。用0.5麥?zhǔn)媳葷峁軐⒕簼舛刃Ｕ?×108CFU/mL，稀釋成5個(gè) 適合的濃度，試驗(yàn)組小鼠進(jìn)行0.5 mL/只腹腔注射，對照組腹腔注射等量無菌肉湯。攻毒后觀察14 d。測定LD0和LD100的菌液濃度。將試驗(yàn)小鼠數(shù)量擴(kuò)大到10只∕組，驗(yàn)證LD0和LD100值。

將30只小鼠隨機(jī)分為5個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)空白對照組。根據(jù)LD0和LD100的濃度，設(shè)計(jì)5個(gè)不同劑量濃度。試驗(yàn)組分別每只腹腔注射0.5 mL不同濃度的菌液，空白對照組腹腔注射等量無菌肉湯，試驗(yàn)組劑量設(shè)計(jì)見表1。攻毒后連續(xù)觀察14 d，記錄中毒小鼠的中毒表現(xiàn)、死亡時(shí)間。及時(shí)無菌剖檢死亡小鼠，觀察死亡小鼠的病理變化，從肝、脾、腎、心、腦采樣，樣本用革蘭染液染色進(jìn)行鏡檢。記錄并整理數(shù)據(jù)，采用Bliss法[5]計(jì)算菌株的LD50。

表1 無乳鏈球菌LD50Table 1 LD50 of Streptococcus agalactiae

1.5 毒力基因檢測

1.5.1 引物合成 5種毒力基因包括cfb、cpsE、sip、hylB和ponA，引物序列、退火溫度及片段大小見表2。

表2 PCR擴(kuò)增引物Table 2 Primers for PCR amplification

1.5.2 PCR擴(kuò)增 采用細(xì)菌DNA試劑盒提取法提取菌株的DNA，反應(yīng)體系：DNA模板0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Taq酶0.125 μL，ddH2O 18.875 μL；反應(yīng)體系運(yùn)行參數(shù)：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性 94 ℃30 s、退火30 s、延伸72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；終延伸72 ℃10 min。產(chǎn)物4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓115 V，電泳25 min后于凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR產(chǎn)物條帶。

1.6 最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用微量肉湯2倍稀釋法。工作菌液濃度調(diào)整為105CFU/ mL，抗菌藥工作濃度為1 280 μg/mL。在96孔板A1孔中加入180 μL工作菌液，A2～A10分別加入100 μL。在A1孔加入20 μL相應(yīng)抗菌藥。充分吹打、混合后，均勻地吸入100 μL并添加到第2孔。以此類推依次稀釋到第11孔，棄去100 μL。第12孔為無菌肉湯空白對照。各孔藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL和0 μg/mL。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h后觀察結(jié)果，每種藥物3次平行試驗(yàn)。結(jié)果判斷：對肉眼可見孔內(nèi)肉湯明顯混濁的判為陽性，以肉湯清亮無菌生長最低濃度的一孔的濃度為最小抑菌濃度。

1.7 體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋棋盤法。以單藥MIC作為中心濃度，將每種抗菌藥的濃度稀釋到32MIC。在試管中設(shè)計(jì)7個(gè)菌藥濃度，分別為16 MIC、8 MIC、4 MIC、2 MIC、1 MIC、1/2 MIC和1/4 MIC。橫向加入甲藥：在96孔板A1～A8孔中依次加入甲藥的第1個(gè)濃度(16 MIC)，每孔各100 μL。96孔板的第B～G排依次加入甲藥剩余6個(gè)濃度?？v向加入乙藥：在96孔板1A～1H孔加入乙藥的第1個(gè)濃度，96孔板的第2～7列依次加入乙藥的剩余6個(gè)濃度。第8列為A藥的單藥對照，H排為B藥的單藥對照。試驗(yàn)中設(shè)計(jì)空白對照及陽性對照。

結(jié)果判斷：試驗(yàn)中以部分抑菌濃度(FIC指數(shù))的計(jì)算結(jié)果作為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的判斷依據(jù)。FIC指數(shù)=甲藥聯(lián)合時(shí)的MIC /甲藥單用時(shí)的MIC+乙藥聯(lián)合時(shí)的MIC/ 乙藥單用時(shí)的MIC。FIC≤0.5為協(xié)同作用；0.52為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 菌株LD50測定 試驗(yàn)組小鼠在攻毒24 h內(nèi)集中發(fā)病并出現(xiàn)死亡，結(jié)果見表1。試驗(yàn)測定無乳鏈球菌ZQ0910的LD0為15 CFU/mL，LD100為1.5×104CFU/mL，采用Bliss法算出無乳鏈球菌ZQ0910的LD50為402.35 CFU/mL。

試驗(yàn)組小鼠表現(xiàn)為精神沉郁、閉目縮頸、食欲下降、全身抖動(dòng)、蜷縮于角落、被毛凌亂、體形消瘦，病情加重后，發(fā)病小鼠呈抽搐狀，嘴鼻發(fā)紺。無菌剖檢小鼠，發(fā)現(xiàn)胸腔和腹腔有積液，肺臟和心臟有出血點(diǎn)，胸腔內(nèi)器官多表現(xiàn)為敗血癥狀。死亡小鼠的肝、脾、腎、心、腦組織革蘭染色后鏡檢，均檢測到鏈狀排列的革蘭陽性球菌。對照組小鼠精神正常，食欲良好，未發(fā)生死亡。

2.2 毒力基因檢測 結(jié)果如圖1所示。通過PCR檢測該無乳鏈球菌病可能存在的5個(gè)致病基因，結(jié)果顯示:sip、cpsE及空白對照組均為陰性，沒有擴(kuò)增出任何條帶;hylB、ponA和cfb分別擴(kuò)增出346、525 bp 和763 bp的特異性條帶，結(jié)果呈陽性，擴(kuò)增出的片段均與預(yù)期的目的片段大小相同。因此，所測的5個(gè)致病基因中無乳鏈球菌ZQ0910含有hylB、ponA和cfb，不含sip和cpsE。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplificationM： 5 000 bp marker； N：空白對照； 1、2： cfb； 3、4： sip； 5、6： ponA； 7、8： cpsE； 9、10: hylBM： 5 000 bp marker； N：Blank control； 1,2： cfb； 3,4： sip； 5,6： ponA； 7,8： cpsE； 9,10: hylB

2.3 單藥MIC測定 羅非魚無乳鏈球菌對抗菌藥MIC的測定結(jié)果如表3所示，阿莫西林對無乳鏈球菌的抑制效果最好，MIC為0.125 μg/mL；多西環(huán)素次之，MIC為0.5 μg/mL；其次是氟苯尼考、環(huán)丙沙星、恩諾沙星；無乳鏈球菌對青霉素、林可霉素耐藥性嚴(yán)重，MIC>128 μg /mL。

表3 抗生素單藥MICTable 3 MIC of single antibiotic drug

2.4 體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 聯(lián)合試驗(yàn)選擇藥物作用較好的阿莫西林、多西環(huán)素、替米考星、環(huán)丙沙星和氟苯尼考進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of combined drug sensitivity test in vitro

3 討論

在測試無乳鏈球菌ZQ0910對小鼠致病力的試驗(yàn)中，測得其LD0為15 CFU/mL，LD100為1.5×104CFU/mL， 采用Bliss法算出無乳鏈球菌ZQ0910的LD50為402.35 CFU/mL，并且試驗(yàn)組小鼠均在24 h 內(nèi)發(fā)病死亡。將本試驗(yàn)結(jié)果與以往文獻(xiàn)中的結(jié)果對比，推斷無乳鏈球菌ZQ0910為強(qiáng)毒株，致病力強(qiáng)，若大范圍發(fā)病將會(huì)給養(yǎng)殖場帶來難以估量的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)中利用PCR檢測本株無乳鏈球菌是否攜帶5個(gè)致病基因，分別為hylB、ponA、cfb、sip和cpsE，其中cpsE基因與人源、動(dòng)物源無乳鏈球菌相似性達(dá)100%[6]。在本試驗(yàn)所用的菌株ZQ0910中檢測出cfb、hylB、ponA，并未檢測出有攜帶由CPS編碼的cpsE基因以及sip基因，表明本菌株的致病基因中攜帶有hylB、cfb和ponA。有研究表明，hylB、

cfb與無乳鏈球菌的侵襲力相關(guān)[7]，其表達(dá)量隨培養(yǎng)溫度的升高表現(xiàn)出先升高后降低[8]。hylB能提高無乳鏈球菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力，使其逃避宿主的免疫機(jī)制[9]；由cfb編碼的膜外蛋白CAMP因子，在細(xì)菌入侵宿主細(xì)胞與抗吞噬作用等方面起重要作用[10]。

在生產(chǎn)應(yīng)用上，抗生素以及人工合成抗菌藥仍然是防治羅非魚鏈球菌病的主要藥物[11]，其中青霉素是治療無乳鏈球菌病的首選藥物[4]。本次試驗(yàn)所選用的抗生素除青霉素外均為廣譜抗生素，青霉素、頭孢噻呋和林可霉素對鏈霉素敏感，阿米卡星及鏈霉素對鏈球菌存在固有耐藥性。在本試驗(yàn)中通過微量肉湯2倍稀釋法測出的抗生素單藥抑菌效果提示阿莫西林對羅非魚無乳鏈球菌體外抑菌效果最好，多西環(huán)素次之；羅非魚無乳鏈球菌對阿米卡星、鏈霉素、青霉素、林可霉素的單藥體外抑菌試驗(yàn)表現(xiàn)出嚴(yán)重的耐藥性。阿莫西林及青霉素同β-內(nèi) 酰胺類抗生素，對細(xì)菌的作用體現(xiàn)在抑制其細(xì)胞壁合成，多西環(huán)素及林可霉素對細(xì)菌的作用體現(xiàn)在抑制其蛋白合成，上述4種抗生素存在作用機(jī)理相同但對本菌株的敏感性相差甚遠(yuǎn)的結(jié)果，青霉素及林可霉素的耐藥性產(chǎn)生提示可能在生產(chǎn)中這2種藥物存在濫用的情況，致使其對鏈球菌敏感性降低。無乳鏈球菌已明顯表現(xiàn)出對首選藥物青霉素存在嚴(yán)重的耐藥性，在生產(chǎn)中考慮是否需要更換其他尚未表現(xiàn)出明顯耐藥性的抗生素進(jìn)行治療無乳鏈球菌病。體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)選擇藥物作用較好的阿莫西林、多西環(huán)素、替米考星、環(huán)丙沙星和氟苯尼考進(jìn)行試驗(yàn)。抗生素體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果提示，環(huán)丙沙星分別聯(lián)合多西環(huán)素、替米考星以及氟苯尼考的體外藥敏測試結(jié)果為相加作用；阿莫西林分別聯(lián)合多西環(huán)素、替米考星和氟苯尼考的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果以及氟苯尼考聯(lián)合替米考星的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果為拮抗作用；環(huán)丙沙星聯(lián)合阿莫西林的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果為無關(guān)作用。阿莫西林、多西環(huán)素、替米考星以及氟苯尼考的抑菌機(jī)制相同，一般情況下相同作用機(jī)制的抗生素聯(lián)用并不能提高其療效，還有增加毒性的危險(xiǎn)，因此，在生產(chǎn)中并不建議使用抑菌作用機(jī)制相同的2種抗生素在治療時(shí)進(jìn)行聯(lián)合用藥。

結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，建議在羅非魚的養(yǎng)殖生產(chǎn)中若出現(xiàn)無乳鏈球菌或其他致病菌感染時(shí)，在治療過程中:(1)當(dāng)致病菌對治療藥物明顯表現(xiàn)出耐藥性時(shí)及時(shí)更換所使用的抗菌藥物；(2)加大同種藥物使用的間隔周期，避免讓魚群長期接觸同種抗生素；(3)確保每次用藥濃度已達(dá)到其抑菌濃度，對抗生素長時(shí)間低濃度接觸也可導(dǎo)致病原菌對其產(chǎn)生耐藥性；(4)選擇多種有效的抗生素交替使用，減緩病原菌對抗生素耐藥性的產(chǎn)生速度；(5)減少選擇藥物的聯(lián)合使用，決定需要聯(lián)合用藥時(shí)要謹(jǐn)慎選擇所聯(lián)用的抗生素。除此之外，抗生素在羅非魚以及在水體中的殘留對人類健康也有一定的威脅，可引起腸道疾病、過敏甚至食物中毒[12]，需要使用抗生素時(shí)應(yīng)科學(xué)合理使用，以降低其所帶來的不良影響。在防治時(shí)除了使用抗生素，也可以考慮其他方法，有研究表明，在日糧中添加白曲霉可提高羅非魚對無乳鏈球菌的抵抗力[13]，阿薩姆茶的提取物可降低羅非魚感染無乳鏈球菌后的死亡率[14]。在日常防治中可考慮:(1)利用相應(yīng)疫苗對羅非魚進(jìn)行免疫，多次免疫效果較單次免疫效果好[15]；(2)在日糧中加入適量白曲霉進(jìn)行預(yù)防，若出現(xiàn)無乳鏈球菌感染時(shí)可以考慮往日料中或魚塘中加入適量的阿薩姆茶提取物，以降低其死亡率，減少經(jīng)濟(jì)損失。