劉家齊 ， 于 新 ， 田 爽 ， 董長安 ， 黃紅蘭

(1. 吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 ， 吉林 長春 130021 ； 2. 吉林百合口腔醫(yī)院 ， 吉林 長春 130022)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是重要的條件致病菌之一，其導(dǎo)致的疾病在克雷伯菌中占比超過95%[1-2]，包括肺炎、腦膜炎和敗血癥等。近年來，由于大量使用氨基糖苷類等抗生素，導(dǎo)致耐藥菌的數(shù)量越來越多，耐藥率越來越高[3-5]。噬菌體是感染細(xì)菌、真菌等病毒的總稱，同時也是地球上數(shù)量最大的生物群體，是細(xì)菌數(shù)量的10倍。噬菌體進(jìn)入宿主菌進(jìn)行復(fù)制，使得宿主菌發(fā)生裂解，同時釋放大量子代噬菌體，可以考慮應(yīng)用于細(xì)菌感染的治療。噬菌體自1896年被發(fā)現(xiàn)以來，探索過程并不是一帆風(fēng)順，抗生素的廣泛使用使噬菌體慢慢淡出了人們的視野，近年來，抗生素耐藥情況越來越多，加之超級細(xì)菌的產(chǎn)生，使得人們越來越關(guān)注噬菌體。本試驗對肺炎克雷伯菌噬菌體進(jìn)行分離，觀察其生物學(xué)特點，分析其遺傳信息，為今后應(yīng)用噬菌體治療肺炎克雷伯菌感染提供數(shù)據(jù)支持，也為臨床治療起到積極作用。

1 材料與方法

1.1 材料來源 肺炎克雷伯菌臨床分離株，來自吉林大學(xué)第二醫(yī)院，作為分離噬菌體的宿主菌，經(jīng)質(zhì)譜儀(型號為VITEK MS)鑒定，將其命名為8329。應(yīng)用吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院檢驗科法國梅里埃藥敏鑒定儀器測定宿主菌8329對19種抗菌藥的敏感性，結(jié)果顯示該菌株對頭孢呋辛鈉、頭孢他啶、頭孢替坦、頭孢吡肟、亞胺培南、頭孢呋辛酯、哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西林8種抗菌藥全部不敏感，故為多重耐藥菌。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體Kp-8329的分離 采集吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院污水中心未經(jīng)處理的污水，離心取上清，加入1 mL肺炎克雷伯菌對數(shù)期菌液，50 mL 營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基，160 r/min 37 ℃培養(yǎng)7 h，4 ℃ 8 000 g離心30 min，用0.22 μm濾器過濾上清液。于試管中加入0.1 mL對數(shù)期菌液和0.1 mL上述濾液，混勻后室溫孵育10 min，采用雙層平板法[6]觀察是否有噬斑出現(xiàn)。

1.2.2 噬菌體Kp-8329的電鏡觀察 取20 μL純化后的噬菌體液滴至銅網(wǎng)，室溫下靜置15 min，滴加2%磷鎢酸染色15 min，透射電鏡觀察形態(tài)[7]。

1.2.3 噬菌體Kp-8329的生物學(xué)特性分析 雙層平板法[8]對噬菌體的一步生長曲線、最佳感染復(fù)數(shù)、溫度和pH穩(wěn)定性進(jìn)行測定。

1.2.4 噬菌體Kp-8329的DNA提取及測序 按噬菌體DNA抽提試劑盒說明書(北京艾德萊生物科技有限公司)提取噬菌體DNA，送生物公司測序。用Newbler 2.9軟件組裝基因組序列，使用RAST 2.0預(yù)測基因及功能注釋，用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體Kp-8329的分離 以肺炎克雷伯菌8329為宿主菌，噬菌體來自吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院廢水，其噬斑形態(tài)均為圓形，如圖1所示，噬菌體Kp-8329可在菌苔上形成直徑3～5 mm，邊緣清晰，大小均一的圓形噬斑，在噬斑周圍有1個半透明的暈環(huán)，寬度約5 mm。

圖1 噬菌體Kp-8329的噬斑Fig.1 Plaque of phage Kp-8329

2.2 噬菌體Kp-8329的電鏡觀察 使用透射電鏡觀測噬菌體形態(tài)，如圖2所示，該噬菌體由對稱的多面體立體頭部和尾部組成，頭部直徑為45～50 nm，有1條 尾，長為130～140 nm。按照國際病毒分類委員會(ICTV)的分類規(guī)則，噬菌體Kp-8329屬于有尾噬菌體目、長尾病毒科噬菌體。

圖2 噬菌體Kp-8329的電鏡觀察Fig.2 Electron microscopy observation of phage Kp-8329

2.3 噬菌體Kp-8329的生物學(xué)特性

2.3.1 噬菌體Kp-8329的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI) 通過雙層平板法對噬菌體MOI進(jìn)行測定,MOI為0.01，如表1所示，即在噬菌體滴度和宿主菌濃度比值是0.01的情況下，能夠獲得最大量的噬菌體產(chǎn)物。

表1 噬菌體Kp-8329最佳感染復(fù)數(shù)測定Table 1 Determination of the optimal multiplicity of infection of phage Kp-8329

2.3.2 噬菌體Kp-8329的一步生長曲線 如圖3所示，Kp-8329感染宿主菌的潛伏時間大約為15 min；裂解期持續(xù)15 min；爆發(fā)量為147 PFU/cell。

圖3 噬菌體Kp-8329的一步生長曲線Fig.3 One-step growth curve of phage Kp-8329

2.3.3 噬菌體Kp-8329的溫度穩(wěn)定性 如圖4所示，噬菌體Kp-8329的熱穩(wěn)定性較強；40 ℃培養(yǎng)60 min后，滴度未出現(xiàn)明顯的改變；在60 ℃作用60 min后，噬菌體滴度略下降；當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時，噬菌體幾乎完全失活。

圖4 噬菌體Kp-8329的溫度穩(wěn)定性Fig.4 Temperature stability of phage Kp-8329

2.3.4 噬菌體Kp-8329的pH穩(wěn)定性 如圖5所示，當(dāng)pH為5～12時，噬菌體Kp-8329有較高的活力；pH為4時，存活率有所下降；而pH在1～3和13～14 變化時，噬菌體均失活。

圖5 噬菌體Kp-8329的pH穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of phage Kp-8329

2.4 噬菌體Kp-8329全基因組概述 如圖6所示，Kp-8329基因組全長46 907 bp，G+C含量為46.90%，未檢出 tRNA 和 rRNA。根據(jù)美國國家生物信息中心(NCBI)的BLAST程序，針對開放閱讀框(ORF)來實施功能注釋，116個ORFs中有32個ORFs與數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公開的功能蛋白有較高相似度，余下84個ORFs注釋為功能未知的假定蛋白，在噬菌體Kp-8329中未查出毒力因子和抗生素的耐藥基因，證明噬菌體Kp-8329在日后的臨床應(yīng)用中存在一定的安全性。

圖6 噬菌體Kp-8329全基因組結(jié)構(gòu)示意圖Fig.6 Schematic diagram of the whole genome structure of phage Kp-8329

2.5 噬菌體Kp-8329與同屬噬菌體的進(jìn)化關(guān)系分析 如圖7所示，噬菌體Kp-8329的基因組的進(jìn)化關(guān)系中，沒有查出和其進(jìn)化關(guān)系相似的肺炎克雷伯菌噬菌體。

圖7 Kp-8329與同屬噬菌體的進(jìn)化關(guān)系鄰接樹Fig.7 Neighbor-joining tree of evolutionary relationship between Kp-8329 and the same phage箭頭：噬菌體Kp-8329所在進(jìn)化樹分枝；下圖同Arrow: The branch of the evolutionary tree where the phage Kp-8329 is located.The same as beolw

2.6 噬菌體Kp-8329 DNA聚合酶基因的進(jìn)化關(guān)系分析 如圖8所示，基于DNA聚合酶基因的進(jìn)化關(guān)系表示，該噬菌體和大腸埃希菌屬噬菌體之間的進(jìn)化關(guān)系十分相似。

圖8 Kp-8329 DNA聚合酶基因的進(jìn)化關(guān)系鄰接樹Fig.8 Neighbor-joining tree of evolutionary relationship of Kp-8329 DNA polymerase gene

3 討論

近年來耐藥細(xì)菌的治療越來越困難，世界衛(wèi)生組織(WHO)更是認(rèn)為細(xì)菌耐藥是21世紀(jì)以后的最大難題之一[9]。噬菌體療法是有效解決抗生素耐藥性的候選者之一。但有些噬菌體攜帶耐藥基因或毒力基因，在臨床上不適用，所以，需要對其全基因組測序，了解其基因組結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系，為其今后應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持[10]。

本試驗自醫(yī)院未經(jīng)處理的污水中分離出噬菌體Kp-8329，該噬菌體是典型的有尾目噬菌體，潛伏期短，爆發(fā)量大，具有較高的酸堿穩(wěn)定性，pH在5～12變化范圍內(nèi)有較高的活力；對溫度的耐受性也較好。對這些生物學(xué)特性的分析表明，噬菌體Kp-8329 作為一種有效、可靠和特異的生物制劑，在治療臨床眾多感染，尤其是耐藥性肺炎克雷伯菌感染方面有著較為廣闊的發(fā)展前景和研究方向。

噬菌體Kp-8329基因組為線性雙鏈DNA，大小為46 907 bp，G+C含量為46.90%，未檢出 tRNA 和 rRNA，基因組中包含116個ORFs，32個ORFs可預(yù)測功能。按照功能不同可被劃分成3個部分：結(jié)構(gòu)蛋白模塊，這些結(jié)構(gòu)蛋白會在翻譯后期包裝組成完整的噬菌體結(jié)構(gòu)，包括ORF18、ORF21、ORF29、ORF39、ORF42、ORF51、ORF63、ORF66、ORF74和ORF84；DNA 復(fù)制及組裝模塊，當(dāng)噬菌體的遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)后，噬菌體會利用細(xì)菌進(jìn)行自身的復(fù)制及組裝，這個模塊主要是DNA代謝所需的相關(guān)蛋白，包括ORF8、ORF9、ORF10、ORF15、ORF22、ORF34、ORF54、ORF56、ORF58、ORF59、ORF77、ORF79、ORF80、ORF85、ORF96、ORF105、ORF110、ORF111和ORF114；裂解宿主模塊，包括ORF17、ORF62和ORF72；其余為假定蛋白。深入分析上述ORFs的基因功能，可為噬菌體治療多重耐藥菌感染的研究提供科學(xué)依據(jù)。

通過已報道耐藥基因庫和毒力基因庫比對可以得出，噬菌體Kp-8329沒有耐藥基因和毒力基因，這表明噬菌體Kp-8329在基因組水平方面具有安全性。分析進(jìn)化關(guān)系時，沒有發(fā)現(xiàn)和其進(jìn)化關(guān)系十分相似的其他肺炎克雷伯菌噬菌體，而是與大腸埃希菌屬噬菌體有較為相近的進(jìn)化關(guān)系。本試驗為今后的噬菌體基因組學(xué)、流行病學(xué)和噬菌體治療等研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。