董建國(guó) ， 饒 丹 ， 劉 濤 ， 胡 靜 ， 何書(shū)海 ， 焦鳳超 ， 陳 斌 ， 黃 立 ， 趙攀登

(1. 信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院 ， 河南 信陽(yáng) 464000 ； 2. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一種對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重的傳染病，該病的病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)。PRRSV的基因型分為兩類(lèi)(I型、II型),在歐洲流行的以Lelystad virus (LV)為代表的毒株歸為I型 ； 在北美流行的以VR-2332為代表的毒株歸為II型，這2種毒株之間全基因組同源性僅為60%，抗原性也有很大差異[1-2]。我國(guó)首先分離到的PRRSV毒株為CH-1a[3]，2006年高致病性毒株在我國(guó)暴發(fā)，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。近年來(lái)又流行了NADC30-like毒株。由于PRRSV的毒株較多、變異性強(qiáng)等特性，給該病的防控帶來(lái)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，因此掌握PRRSV的遺傳演化規(guī)律對(duì)防控PRRS十分關(guān)鍵。為了進(jìn)一步了解廣東地區(qū)PRRSV流行毒株的遺傳特性，本試驗(yàn)在該地區(qū)分離到了PRRSV毒株，并對(duì)其全基因組進(jìn)行了測(cè)序分析，掌握了該毒株的遺傳演化特性，為廣東地區(qū)PRRSV的防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 病料與主要試劑 樣品采自廣東省某疑似暴發(fā)PRRS的豬場(chǎng)，采集發(fā)病豬的肺部病變組織，置于-80 ℃ 備用。Marc-145 細(xì)胞為本試驗(yàn)室保存；病毒DNA/RNA 提取試劑盒、Trans-5α感受態(tài)細(xì)胞、RT-PCR 相關(guān)試劑盒、膠回收試劑盒和DL2 000 DNA marker，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中收錄的PRRSV代表毒株全基因組序列，設(shè)計(jì)出1對(duì)擴(kuò)增GP5基因的鑒定引物(GP5F：5′-GTGTCAGGCATTGTGGCTGTG-3′;GP5R:5′-CATTATTGGCATGTAGGTGATAGAAAA-3′)和13對(duì)特異性引物用于擴(kuò)增全基因組序列，引物由金維智有限公司合成。引物信息見(jiàn)表1。

表1 PRRSV全基因組擴(kuò)增引物Table 1 Amplification primers of PRRSV whole genome

1.3 病料處理 將采集的病變組織剪碎，混合1 mL 的PBS在4 ℃環(huán)境下充分研磨，組織研磨液，10 000 r/min 離心10 min，收集上清液，用0.22 μm微孔濾器過(guò)濾除菌，得到的濾液置于-20 ℃保存。

1.4 病毒分離及間接免疫熒光試驗(yàn) Marc-145傳至6孔板培養(yǎng)，每個(gè)樣品1個(gè)重復(fù)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，隨后接種100 μL含病毒的濾液，加入100 μL 不含血清含2%雙抗的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)1 h，棄去上清，加入含5%血清的DMEM維持液2 mL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，如果有80%細(xì)胞出現(xiàn)CPE，就將該細(xì)胞液收集置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。為了進(jìn)一步鑒定出現(xiàn)CPE的細(xì)胞感染了PRRSV，同時(shí)將做的重復(fù)孔細(xì)胞用無(wú)水乙醇固定20 min，PBS洗滌3次，每次3 min； 加入抗PRRSV N蛋白單克隆抗體，室溫孵育1 h；PBS洗滌3次，每次3 min；加入FITC標(biāo)記的二抗，避光，室溫孵育1 h；PBS洗滌3次，每次3 min；加入熒光猝滅劑，制作片子并在熒光顯微鏡下觀察。

1.5 全基因組擴(kuò)增及測(cè)序 收取培養(yǎng)至第3代的病毒，根據(jù)核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取病毒核酸，然后運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄試劑對(duì)病毒核酸進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板進(jìn)行基因擴(kuò)增，反應(yīng)條件:94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min， 擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。取5 μL 的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，選取目的片段按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行回收，得到的樣品連接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector 上，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，挑菌鑒定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 基因組序列對(duì)比分析 利用Lasergene 及Mega 5.0 軟件對(duì)分離的GDhd毒株進(jìn)行全基因組序列拼接，將得到的GDhd全基因組與國(guó)內(nèi)外分離毒株進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，同時(shí)構(gòu)建Nsp2基因和GP5基因的進(jìn)化樹(shù)，PRRSV代表毒株的基因序列均下載自GenBank。

2 結(jié)果

2.1 病料樣品的RT-PCR檢測(cè) 將病料提取的核酸作為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小符合預(yù)期結(jié)果(833 bp)，同時(shí)陰性對(duì)照的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示為陰性(圖1)。

圖1 PRRSV GDhd ORF5片段擴(kuò)增Fig.1 Amplification of PRRSV GDhd ORF5 geneM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DL2 000； 1：樣品； 2：陰性對(duì)照M:DNA marker DL2 000; 1：Sample; 2:Negative control

2.2 病毒分離培養(yǎng)及鑒定 病料處理液接種Marc-145細(xì)胞后連續(xù)培養(yǎng)觀察3～5 d，待細(xì)胞出現(xiàn)聚集、皺縮并脫落等明顯CPE時(shí)，進(jìn)行間接免疫熒光鑒定，結(jié)果顯示，接種病料組出現(xiàn)特異性的綠色熒光，證明病毒分離成功(圖2)。

圖2 PRRSV GDhd在Marc-145細(xì)胞上的病變結(jié)果(100×)Fig.2 Cytopathic effect of PRRSV GDhd on Marc-145 cell (100×)A：正常細(xì)胞(熒光)； B：正常細(xì)胞(白光)； C:病變細(xì)胞(熒光)； D：病變細(xì)胞(白光)A:Normal cells (Fluorescence); B:Normal cells (White light); C:Pathological cells (Fluorescence); D:Pathological cells (White light)

2.3 全基因組擴(kuò)增及測(cè)定 運(yùn)用設(shè)計(jì)的特異性引物，對(duì)GDhd基因組不同片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，然后用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示，成功擴(kuò)增出13個(gè)片段，片段大小符合預(yù)期。將擴(kuò)增出的片段膠回收連接載體測(cè)序，結(jié)果顯示，每個(gè)片段均測(cè)通，且均是PRRSV序列。對(duì)13個(gè)序列進(jìn)行拼接得到全長(zhǎng)為15 377 bp 的PRRSV全基因組序列，毒株命名為GDhd(圖3)。

圖3 PRRSV GDhd 13個(gè)基因片段的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 RT-PCR amplification result of 13 gene fragments from PRRSV GDhd M：DNA marker DL2 000； 1～13：PRRSV GDhd 13個(gè)片段的擴(kuò)增M:DNA marker DL2 000; 1-13:13 fragments amplified from PRRSV GDhd

2.4 GDhd全基因組遺傳演化分析 用Mega 5.0 軟件將GDhd毒株與GenBank上收錄的其他具有代表性的PRRSV毒株構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示，PRRSV主要分為2個(gè)大分支，即以Lelystad virus 為代表的歐洲型和以VR2332 為代表的美洲型，美洲型毒株又可細(xì)分出以美國(guó)NADC30毒株為代表的分支、以CH-1a為代表的我國(guó)低致病毒株分支以及以JXA1、HN4為代表的高致病毒株分支(圖4)。結(jié)果表明，GDhd株與我國(guó)高致病毒株同屬一個(gè)分支，與JXA1、HuN4、JXwn06等同源性較高。

圖4 PRRSV GDhd全基因組的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of PRRSV GDhd whole genome●：本試驗(yàn)分離的毒株●:The strains isolated in this test

2.5 GDhd全基因組同源性分析 用DNASTAR軟件將GDhd與其參考毒株的序列對(duì)比，結(jié)果顯示，GDhd與HuN4同源性最高，為95.6%，與其高致病毒株JXA1、JXwn06同源性為95.4%和95.5%，與NADC30 和NADC30-like毒株 JL580、CHsx1401 同源性分別為86.5%、88.9% 和85.4%，與美洲型代表株VR-2332 同源性為88.2%，與歐洲型代表株Lelystad virus 同源性僅為60.1%(圖5)。

圖5 PRRSV GDhd全基因序列比對(duì)Fig.5 Sequence alignment of PRRSV GDhd whole genome

2.6 編碼Nsp2和GP5蛋白的基因序列的進(jìn)化分析 分別用GDhd編碼Nsp2和GP5蛋白的基因序列與參考毒株的對(duì)應(yīng)基因序列對(duì)比分析構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果如圖6顯示，GDhd和JL580在Nsp2編碼區(qū)同屬一個(gè)分支，GDhd和JXA1在GP5編碼區(qū)處于同一分支。結(jié)果表明，GDhd毒株可能是1株重組毒株。

圖6 PRRSV GDhd Nsp2和GP5基因遺傳進(jìn)化樹(shù)分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of PRRSV GDhd Nsp2 and GP5 genesA：PRRSV Nsp2基因進(jìn)化樹(shù)分析； B：PRRSV GP5基因進(jìn)化樹(shù)分析A:Phylogenetic tree analysis of PRRSV Nsp2 gene; B:Phylogenetic tree analysis of PRRSV GP5 gene●：本試驗(yàn)分離的毒株●:The strains isolated in this test

2.7 GDhd的重組分析 利用生物信息學(xué)軟件對(duì)GDhd毒株進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示，GDhd存在重組現(xiàn)象，重組位點(diǎn)位于全基因組第1 310位點(diǎn)和第3 672位點(diǎn)，2個(gè)位點(diǎn)將GDhd分為3個(gè)區(qū)域，1區(qū)和3區(qū)與JXA1親緣關(guān)系較近，2區(qū)與NADC30親緣關(guān)系較近(圖7)。發(fā)生重組的2區(qū)主要位于PRRSVNsp2編碼區(qū)，GDhd毒株在Nsp2編碼區(qū)與NADC30株同源性較高，這些結(jié)果表明GDhd是JXA1與NADC30的重組毒株，重組區(qū)域發(fā)生在Nsp2編碼區(qū)。

圖7 PRRSV GDhd重組分析Fig.7 Recombinant analysis of PRRSV GDhd

3 討論

我國(guó)流行的PRRSV毒株主要是北美VR-2332的演化毒株，首次分離到的CH-1a毒株與VR-2332的全基因組序列差異較大，目前尚沒(méi)有充足的證據(jù)證明其來(lái)源，隨后分離到的BJ-4毒株與VR-2332同源性較高[5]，可能是通過(guò)引進(jìn)種豬傳入我國(guó)。2006年，高致病性PRRS在我國(guó)流行，引起豬高發(fā)病率、高死亡率以及妊娠母豬繁殖障礙等，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。分離到的毒株主要以JXA1、HuN4為代表，在Nsp2編碼區(qū)存在30個(gè)不連續(xù)的氨基酸缺失[6-7]。近年來(lái)，我國(guó)又流行與美國(guó)NADC30相似的毒株，被命名為NADC30-like毒株[8]，主要代表毒株有JL580和CHsx1401，與VR-2332毒株相比Nsp2在aa324～434、aa486和aa505～523存在131個(gè)不連續(xù)的氨基酸缺失。

為了解廣東地區(qū)PRRSV流行毒株的遺傳變異特性，本試驗(yàn)從廣東某疑似PRRS發(fā)病豬場(chǎng)采集病料，并成功分離到PRRSV毒株，命名為GDhd。隨后測(cè)定了該毒株的全基因組序列并與其他參考毒株進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，該毒株與HuN4同源性最高，為95.6%，屬于高致病性毒株；GDhdNsp2基因進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，GDhdNsp2和JL580Nsp2 在同一分支。重組分析顯示，GDhd毒株在Nsp2編碼區(qū)與NADC30株同源性較高，其他區(qū)域與JXA1同源性較高。這些結(jié)果表明，GDhd毒株是一種JXA1與NADC30重組的毒株，重組區(qū)域主要位于Nsp2編碼區(qū)。近些年來(lái)，重組的毒株也被越來(lái)越多的報(bào)道，不同類(lèi)型之間的毒株存在廣泛重組現(xiàn)象，如lineage 1,3，5和8毒株之間重組[9-10]，NADC30和疫苗毒株 JXA1-P80的重組[11]，并且研究顯示，重組產(chǎn)生的新毒株感染宿主后導(dǎo)致低中和抗體水平，致使豬更容易發(fā)病[12]。通過(guò)對(duì)2014—2018年的中國(guó)和美國(guó)毒株基因組分析顯示，PRRSV重組位點(diǎn)主要位于nsp9,GP2和GP3區(qū)域[13]，研究顯示，重組是PRRSV毒株變異的重要原因[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Nsp2在基因重組中具有重要作用，是否與毒株的致病性有關(guān)需要進(jìn)一步研究。

重組毒株可表現(xiàn)出不同的毒力及免疫原性，市場(chǎng)上的商品化疫苗對(duì)這類(lèi)毒株常常缺乏保護(hù)，這也加劇了PRRS的防控難度。重組毒株的出現(xiàn)增加了PRRSV的多樣性，對(duì)流行毒株遺傳特性的研究對(duì)于新疫苗的研發(fā)十分重要，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)廣東流行毒株GDhd進(jìn)行分離鑒定及遺傳特性分析，為研究重組毒株的重組特性及疫苗的研發(fā)提供了參考依據(jù)。