莊爾俊 ， 王琪琪,2 ， 趙俊杰 ， 岳鳳嬌 ， 李海龍,3

(1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 ， 云南 大理 671000 ； 2.山西醫(yī)科大學(xué)晉祠學(xué)院 ， 山西 太原 030000 ； 3.云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 云南 大理 671000)

微孢子蟲(chóng)(Microsporidia)是一種專(zhuān)性胞內(nèi)寄生的人獸共患寄生蟲(chóng)，呈世界性分布[1]。其中畢氏腸微孢子蟲(chóng)(Enterocytozoonbiebeusi，E.biebeusi)是最常見(jiàn)的微孢子蟲(chóng)，感染的宿主種類(lèi)多，包括人、家畜及野生動(dòng)物，通常導(dǎo)致腹瀉、腹痛等癥狀，對(duì)免疫功能障礙者則會(huì)導(dǎo)致慢性腹瀉[2-3]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)人及動(dòng)物的微孢子蟲(chóng)流行病學(xué)調(diào)查和基因型鑒定日益增多，在我國(guó)已見(jiàn)于黑龍江、西藏、廣東、陜西等地的人、豬、牛以及野生動(dòng)物感染[3-7]。野鼠是人獸共患病重要的傳播媒介之一，因其生存于人類(lèi)生活區(qū)且活動(dòng)范圍較大，易污染食物及水源，增加人類(lèi)及其他動(dòng)物的感染風(fēng)險(xiǎn)。關(guān)于大理地區(qū)野鼠畢氏腸微孢子蟲(chóng)的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)以大理地區(qū)的野鼠為調(diào)查對(duì)象，進(jìn)行畢氏腸微孢子蟲(chóng)的分子流行病學(xué)研究，旨在為當(dāng)?shù)禺吺夏c微孢子蟲(chóng)的防控和研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 于2016年4月—2017年7月在大理地區(qū)居民區(qū)放置捕鼠籠，記錄所捕獲野鼠鼠種、體長(zhǎng)等基本信息。共采集到新鮮糞便樣本287份，其中褐家鼠樣本270份，黃胸鼠樣本17份。畢氏腸微孢子蟲(chóng)陽(yáng)性DNA樣本由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。

1.2 主要試劑 糞便DNA提取試劑盒，購(gòu)自甘肅眾慶生物科技有限公司；MgCl2、dNTPs Mixture、10×PCR Buffer、DNA marker DL500、TaqDNA聚合酶，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Loading Buffer，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA的提取與引物設(shè)計(jì) 根據(jù)糞便DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取野鼠糞便樣本DNA，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。擴(kuò)增畢氏腸微孢子蟲(chóng)SSU rRNA基因中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)，引物序列及擴(kuò)增方法參考Zhang等[8]發(fā)表的研究報(bào)道。

1.3.2 產(chǎn)物檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果分析 將結(jié)果中與目的條帶大小相近的產(chǎn)物送至金斯瑞生物科技(南京)有限公司進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果在NCBI上的GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)，根據(jù)同源性是否100%確定其基因型或新基因型。用Clustal X 1.83進(jìn)行序列比對(duì)，然后用MEGA 6.0進(jìn)行進(jìn)化分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算感染率和P值，P<0.05則差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 巢式PCR擴(kuò)增 基于ITS基因的巢式PCR檢測(cè)，287份鼠糞便樣品中，共有12份擴(kuò)增出大小約為390 bp的條帶(圖1)。

圖1 野鼠糞便樣本畢氏腸微孢子蟲(chóng)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of E.bieneusi in faecal samples from wild ratsM: DNA marker DL500； 1～8:陽(yáng)性樣品； 9～12:陰性樣本；13：陽(yáng)性對(duì)照； 14：陰性對(duì)照M：DNA marker DL500； 1-8：Positive samples； 9-12：Negative samples； 13：Positive control； 14：Negative control

2.2 畢氏腸微孢子蟲(chóng)基因型鑒定 對(duì)本試驗(yàn)獲得的12個(gè)陽(yáng)性樣品的測(cè)序結(jié)果分析，鑒定出3種基因型，上傳至GenBank，序列號(hào)為MG999509～MG999511。根據(jù)其序列進(jìn)行種系發(fā)育比對(duì),其中包括:EbpC(n=3)和D(n=2)基因型；1種新基因型，命名為YNM1(n=7)。在這3種基因型中，共觀察到5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(表1)，分別為序列號(hào)150、170、174、198、201。通過(guò)構(gòu)建系譜樹(shù)(圖2)，本試驗(yàn)的基因型EbpC、D、YNM1均屬于人獸共患病組(Group1)，基因型D和YNM1屬于Group 1a，基因型EbpC屬于Group 1d。

圖2 畢氏腸微孢子蟲(chóng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of E.bieneusi○: 已知基因型; ●: 新基因型○: Known genotypes; ●: New genotypes

表1 大理野鼠畢氏腸微孢子蟲(chóng)基因型多態(tài)位點(diǎn)Table 1 Genotype polymorphic sites of E.bieneusi in wild rats from Dali

2.3 野鼠畢氏腸微孢子蟲(chóng)感染情況統(tǒng)計(jì) 287份鼠糞便樣品包括黃胸鼠(n=17)和褐家鼠(n=270)兩種，感染率分別為4.44%和0，總感染率為4.18%。根據(jù)Yan等[9]研究，分為幼年組(體長(zhǎng)≤110 mm)、亞成年組(體長(zhǎng)110～150 mm)和成年組(體長(zhǎng)151～175 mm)。鼠陽(yáng)性樣本中，有8只為雌性(4.57%)，4只為雄性(3.57%)；幼年組有2只為感染陽(yáng)性(12.50%)，亞成年組有1只被感染(1.37%)，成年組有9只被感染(4.55%)。性別和年齡組感染率差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同性別及年齡組畢氏腸微孢子蟲(chóng)感染情況Table 2 The infection of E.bieneusi in different gender and age group

3 討論

通過(guò)調(diào)查大理野鼠畢氏腸微孢子蟲(chóng)的感染情況，結(jié)果顯示，其感染陽(yáng)性率為4.18%(12/287)，其中黃胸鼠、褐家鼠感染率分別為0(0/17)和4.44%(12/270)。在流行相關(guān)因素中，性別和年齡組差異不顯著(P>0.05)。鼠為嚙齒類(lèi)動(dòng)物，且種類(lèi)繁多，國(guó)內(nèi)有關(guān)于畢氏腸微孢子蟲(chóng)感染嚙齒類(lèi)動(dòng)物的報(bào)道。本試驗(yàn)捕獲的野鼠分為黃胸鼠和褐家鼠，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)黃胸鼠感染畢氏腸微孢子蟲(chóng)的相關(guān)報(bào)道，Zhao等[10]在黑龍江首次檢測(cè)出褐家鼠中有畢氏腸微孢子蟲(chóng)感染，感染率為7.9%(19/242)。本試驗(yàn)結(jié)果與Zhao等[10]的結(jié)果和Wang等[11]發(fā)現(xiàn)的畢氏腸微孢子蟲(chóng)感染竹鼠的感染率(5.1%)相近。在Gui等[12]的研究中發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)青毛鼠和小泡巨鼠感染畢氏腸微孢子蟲(chóng)的陽(yáng)性率分別為31.6%(37/117)和35.1%(39/111)，高于本次調(diào)查的感染率。國(guó)外的報(bào)道中，黑線姬鼠感染畢氏腸微孢子蟲(chóng)的感染率為42.9%(79/184)，黃頸鼠的感染率為30.0%(18/60)[13]，均高于本次調(diào)查。在不同的調(diào)查中，鼠被畢氏腸微孢子蟲(chóng)感染可能與嚙齒動(dòng)物的種類(lèi)、研究地點(diǎn)及其地理?xiàng)l件、收集樣品的總數(shù)、檢測(cè)方法等因素有關(guān)。

通過(guò)分析野鼠的畢氏腸微孢子蟲(chóng)ITS核苷酸序列，鑒定出3種基因型：EbpC(3/12，25%)、D(2/12，17%)、YNM1(7/12，58%)，在這12份陽(yáng)性樣本中，YNM1鑒定出有7份是本試驗(yàn)鑒定出的新型，考慮是大理地區(qū)褐家鼠感染畢氏腸微孢子蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)基因型。而在國(guó)內(nèi)黑龍江地區(qū)褐家鼠的報(bào)道中，鑒定出基因型D和Peru6[10]，在海南地區(qū)的鼠類(lèi)動(dòng)物中鑒定出的畢氏腸微孢子蟲(chóng)基因型多達(dá)16種，主要為基因型D(44.2%)[14]。在國(guó)外的研究中，也有鼠感染畢氏腸微孢子蟲(chóng)基因型D的報(bào)道[13,15]。Matos等[16]的研究表明，基因型D已在40多個(gè)國(guó)家和地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，是造成多數(shù)人感染的原因，同時(shí)也從多種動(dòng)物和廢水中檢測(cè)出[17-20]，故更應(yīng)關(guān)注水源傳播和安全用水?；蛐虴bpC不僅感染人，也出現(xiàn)在許多動(dòng)物中[21-22]。

畢氏腸微孢子蟲(chóng)基因型的分布可能與地理位置和條件有一定的關(guān)系，大理地區(qū)野鼠畢氏腸微孢子蟲(chóng)的基因型具有一定的多樣性，存在較高人獸共患的風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)結(jié)果豐富了大理地區(qū)畢氏腸微孢子蟲(chóng)分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)，為該病的防控和研究提供了參考數(shù)據(jù)。