郭亮亮 吳萌萌 郭 鵬 鄭丹艷 趙衛(wèi)國

(江蘇科技大學蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江 212018)

隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展和測序成本的降低，越來越多的植物葉綠體基因組得到解析，使人們對葉綠體基因組的了解更加深入。高等植物的葉綠體基因組屬于母系遺傳，基因順序和結(jié)構(gòu)具有高度保守的特性，在進化中變異緩慢[1]，是植物系統(tǒng)發(fā)育進化研究的重要標記[2]。近年來，已有大量的葉綠體基因組序列被廣泛研究。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism SNP)，是指在基因組水平上由單個核苷酸變異所引起的多態(tài)性，具有密度較大、遺傳穩(wěn)定、雙等位分型、自動化分型等特性，也經(jīng)常被廣泛應(yīng)用于遺傳育種、品種鑒定等領(lǐng)域。

在核糖體基因轉(zhuǎn)錄內(nèi)間隔區(qū)ITS序列研究上，史全良等[3]以蒙桑為材料采用PCR產(chǎn)物直接測序法，測定了核糖體基因轉(zhuǎn)錄內(nèi)間隔區(qū)ITS序列，基于此序列為桑屬植物進化研究提供了一定的理論依據(jù)。2004年，趙衛(wèi)國等[4]以構(gòu)樹為外源種用同樣的方法對桑屬植物9個種3個變種進行了核糖體基因轉(zhuǎn)錄內(nèi)間隔區(qū)ITS序列的測定，試驗結(jié)果表明：桑屬植物是單系；蒙桑單獨聚為一類親緣關(guān)系最遠，鬼桑、雞桑(雅周桑)聚為一類，其它桑種聚為一類，白桑最進化。PsbA基因是存在于葉綠體中的保守基因，其功能與光合作用有關(guān)，在植物生命活動中起著至關(guān)重要的作用。本研究通過對比魯桑和廣東桑葉綠體全基因組序列，發(fā)現(xiàn)PsbA基因序列有SNP，可能存在進化序列，并用基因克隆的方法來做進化分析，以期為桑屬植物系統(tǒng)分類提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試桑屬植物材料及無花果 桑屬植物8個桑種15個品系(品種)及外源種無花果共計16份材料(表1)，均采自國家種質(zhì)鎮(zhèn)江桑樹圃。

1.1.2 主要試劑 氯仿(分析純)、異丙醇(分析純，-20 ℃預(yù)冷)、75%冰乙醇(分析純，4 ℃預(yù)冷)、Taq酶、19-Tvector、SolutionⅠ，均購自Takara公司；植物基因組快速抽提試劑盒、DiaSpin柱式DNA膠回收試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 供試桑屬植物材料及無花果

品系(品種)中文名稱拉丁學名魯牛耳桑白桑Morus alba泰國桑白桑Morus alba雅安7號華桑Morus cathayana蘇湖16號魯桑Morus multicaulis節(jié)曲魯桑Morus multicaulis湖桑32號魯桑Morus multicaulis倫教40號廣東桑Morus atropurpurea雞桑雞桑Morus australis特早魯桑Morus multicaulis黑桑黑桑Morus nigra垂枝桑垂枝桑Morus alba插桑雞桑Morus australis保靖5號華桑Morus cathayana火桑瑞惠桑Morus mizuho育71-1魯桑Morus multicaulis無花果無花果Ficus carica

表中供試材料均采自國家種質(zhì)鎮(zhèn)江桑樹圃。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 JY300電泳儀、F3紫外凝膠成像儀，均為Gene Company Limited(基因有限公司)產(chǎn)品；Mastercycler nexus GX2 PCR儀、5424r臺式高速冷凍離心機、-80 ℃超低溫冰箱，均為德國艾本德股份公司產(chǎn)品；NanoDrop One微量核酸蛋白濃度檢測儀，為賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；HHS-21-4恒溫水浴鍋，為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取 供試的16份材料總DNA的提取使用植物基因組快速抽提試劑盒提取。

1.2.2 目的基因的確定 通過利用軟件DNAMAN對魯桑和廣東桑葉綠體全基因組序列(全基因組序列委托武漢貝納科技服務(wù)有限公司完成)對比發(fā)現(xiàn)，PsbA基因序列存在SNP，該基因具有AT偏好特性，其功能與光合作用有關(guān)，可能存在進化序列，因此將PsbA基因確定為本試驗的目的基因。

1.2.3 目的基因的克隆測序 根據(jù)目的基因設(shè)計上游引物(5′-ATGACTGCAATTTTAGAGAGACGC-3′)和下游引物(5′-TTATCCATTTGTAGATGGAACTTC-3′)，然后采用PCR產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化、過夜培養(yǎng)進行藍白斑篩選，挑選白色菌落，進行菌液培養(yǎng)，并送浙江尚亞生物技術(shù)有限公司測序獲得16份供試材料PsbA基因的基因序列。

1.2.4 桑屬植物的聚類分析 利用Clone Manager 8.0和MEGA 6.0軟件對16份材料的PsbA基因序列進行對比，做進化樹進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PsbA基因序列的擴增、純化與測序

目的基因PsbA序列長度1 062 bp。對其設(shè)計引物，經(jīng)過PCR產(chǎn)物純化、連接載體、轉(zhuǎn)化、過夜培養(yǎng)之后，挑選白色單菌落培養(yǎng)，然后進行菌液PCR驗證篩選出陽性克隆，陽性菌液送浙江尚亞生物技術(shù)有限公司進行測序獲得16份材料的PsbA基因序列，結(jié)果得出16份材料PsbA基因序列長度均在1 062 bp左右，確定為目的基因序列。

2.2 不同桑種與外源種PsbA基因序列分析

用Clone Manager 8.0軟件對獲得的16份材料的PsbA基因序列進行對比，發(fā)現(xiàn)同源性在89%～99%之間。通過對比發(fā)現(xiàn)，桑種各品系間的同源性都大于98%，說明供試材料即使桑種不同桑屬植物內(nèi)部各品種的親源關(guān)系仍然較近。但是外源種無花果與供試桑種材料同源性較低，僅為89%。

2.3 供試材料PsbA基因序列密碼子分析

我們對16份供試材料的PsbA基因序列A和T含量進行了測定，15份桑屬植物A+T含量平均約為57.67%，最高的倫教40號高達58.47%，最低的插桑為57.43%，含量非常接近。但是外源種無花果A+T含量僅為49.55%，差異很大。這更加證明了桑屬植物葉綠體基因組的保守性強。15份桑屬植物材料平均核苷酸組成為A占27.48%、T占30.10%、C占20.83%、G占21.59%，由此可以看出該基因序列在桑屬植物中具有A和T偏好特性。

2.4 桑屬植物基于PsbA基因序列聚類分析

采用MEGA 6.0軟件以無花果為外源種對8個桑屬植物材料在內(nèi)的16份材料通過最大簡約法(ML)做進化樹進行聚類分析，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，桑科的無花果和桑屬植物分別單獨聚為一類。在圖1中顯示，供試桑材料中首先倫教40號、雞桑、特早、黑桑聚為一類，自檢支持率高達62%。育71-1先與火桑、保靖5號聚為一類然后再和插桑聚為一類，自檢支持率為100%。魯牛耳桑單獨聚為一類。泰國桑先和雅安7號聚為一類然后再和蘇湖16號聚為一類，說明有一定的親緣關(guān)系。

圖1 桑屬植物的葉綠體基組序列通過最大似然法進行的聚類情況

3 小結(jié)與討論

本次試驗對桑屬植物的PsbA基因序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)了供試桑屬植物材料的PsbA基因同源性較高(>98%)。聚類結(jié)果也進一步證明了桑屬植物為單系，這和前人的研究結(jié)果[5-9]一致。采用葉綠體PsbA基因序列來進行桑屬植物的聚類分析，該方法得出的結(jié)論和汪偉等[10]采用trnL內(nèi)含子序列對桑屬植物系統(tǒng)學研究有一定的相似之處，但是也有差異。試驗材料中倫教40號、雞桑、特早、黑桑聚為一類，自檢支持率高達62%，說明桑屬植物品種黑桑(黑桑)、魯桑(特早)、雞桑(雞桑)和廣東桑的親緣關(guān)系較近，這個結(jié)果和陳仁芳等[11]基于ITS分析桑屬植物親緣關(guān)系研究結(jié)果有相似之處，他也認為廣東桑和雞桑的親緣關(guān)系較近；廣東桑和雞桑分在一起和劉玲等[12]采用ITS、trnL-F和rps16序列研究桑親緣關(guān)系得出的結(jié)果有相似之處。但陳仁芳等[11]通過ITS堿基序列分析認為廣東桑、鬼桑、瑞惠桑、白桑之間存在某種關(guān)系，這與我們的研究結(jié)果略有出入，我們沒有得出廣東桑、白桑和瑞惠桑有特別近的親緣關(guān)系。白桑和雞桑親緣關(guān)系較遠，在傳統(tǒng)分類中，白桑、蒙桑、雞桑的形態(tài)完全不同，認為親緣關(guān)系距離較遠，這也與我們本次的研究結(jié)果一致。本試驗中雖然將黑桑和魯桑(特早)聚為一類，但是自檢支持率并不高僅為20%，這個結(jié)果與陳仁芳等[13]將黑桑單獨聚為一類(自檢支持率89%)，認為黑桑最為原始的研究結(jié)果相似。魯牛耳桑單獨聚為一類，說明本次試驗選取的白桑(魯牛耳桑)與其他品種親緣關(guān)系較遠，這個結(jié)果與汪偉等[10]基于trnL內(nèi)含子對桑屬植物進化研究結(jié)果相似。在我們的研究結(jié)果中，雞桑(插桑)、華桑(保靖5號)、瑞惠桑(火桑)和魯桑(育71-1)聚為一類，自檢支持率為100%，說明親緣關(guān)系較近，但是與陳仁芳等[11]的研究結(jié)果有差異，她的結(jié)果顯示華桑、川桑、奶桑和長穗桑聚為一類。我們的研究和前人相比在研究的方法上有所不同，本次試驗以葉綠體基因序列為依據(jù)，在研究桑屬植物系統(tǒng)進化方面做了一個新的嘗試。我們得出的結(jié)論并不能代表最終桑屬植物分類系統(tǒng)，因為桑屬植物葉綠體基因組并沒有被完全測序，還有很多未知的基因需要進一步探討，關(guān)于桑屬植物系統(tǒng)學我們的研究還只是冰山一角，桑屬植物系統(tǒng)進化還需進一步研究才能得出準確的結(jié)論，本試驗研究為接下來的遺傳關(guān)系研究提供了重要的試驗數(shù)據(jù)。