胡培森, 崔洪泉, 趙俊峰, 吳志洲, 王交托

（河南省中醫(yī)院泌尿外科，河南 鄭州 450002）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）指發(fā)生于前列腺的上皮性惡性腫瘤，發(fā)病率在男性惡性腫瘤中居第6 位，年齡低于55歲的男性群體發(fā)病率較低，55歲后發(fā)病率逐漸升高，且隨年齡增長而升高，70～80歲年齡段PCa發(fā)病率最高［1-2］。PCa 患者早期癥狀不明顯，隨著腫瘤的發(fā)展，患者表現(xiàn)出排尿困難、尿潴留和血尿等臨床癥狀［3-4］。目前臨床主要通過放療、內(nèi)分泌治療和手術等方式治療PCa，但無法根治且存在泌尿系統(tǒng)梗阻和癌轉移等并發(fā)癥，因此，尋找有效治療方式對于改善預后和延長患者生存時間尤其重要。臨床研究［5］顯示：PCa患者免疫功能低下，并與病理分化程度和臨床分期有關。體外細胞實驗［6］證實：PCa 細胞可通過免疫逃逸來逃避NK 細胞殺傷。程序性死亡受體1（programmed cell death receptor-1，PD-1）/程序性死亡配體1（programmed cell death-ligand 1 ，PD-L1）是與T 淋巴細胞免疫反應協(xié)同的刺激信號通路，可抑制T 淋巴細胞活化，通過抑制PD-1/PD-L1 信號通路，可有效抑制非小細胞肺癌患者腫瘤的惡化并改善預后［7］。當歸六黃湯由當歸、黃芪、生地黃、黃連、黃柏、黃芩和熟地黃組成，是中醫(yī)治療盜汗的經(jīng)典名方，對治療甲狀腺炎、恢復患者免疫平衡狀態(tài)和緩解病情等效果顯著［8-9］。本研究建立PCa 荷瘤小鼠模型，明確當歸六黃湯對其免疫功能的影響，為臨床PCa 的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株、動物、主要試劑和儀器小鼠PCa 細胞株RM-1購自上海通蔚實業(yè)有限公司。5周齡SPF級SD小鼠50只，均為雄性，體質量（28±3）g，購自吉林省長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）2016-0004。

當歸六黃湯顆粒［黃芪120 g，黃岑、當歸、黃連、熟地、生地和黃柏各60 g。制備顆粒時取藥材，加8 倍量水，煎煮1 h，濾渣；加6 倍量水，煎煮1 h，過濾。2次濾液合并，濃縮，減壓，干燥，粉碎。貴州宏宇藥業(yè)制備，批號：200526，規(guī)格：15 g/袋（相當于生藥25 g）］，注射用順鉑［齊魯制藥（海南）有限公司，批號：120724，規(guī)格：每支10 mg］，APC 抗小鼠CD4 抗體（北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司），PerCP/Cyanine 5.5 抗小鼠CD8a 抗體（上?？道噬锟萍加邢薰荆?，兔抗小鼠PD-1 抗體一抗（北京百奧來波科技有限公司），兔抗小鼠PD-L1 抗體一抗（北京義翹神州科技股份有限公司），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（上海碧云天生物技術有限公司）。E0244 電子天平（上海碧云天生物技術有限公司），CX43 顯微鏡（日本Olympus 公司），F(xiàn)ACScan 型流式細胞儀（美國BECTON DICK-INSON 公司）。

1.2 實驗動物分組和建模［10］將50只小鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、低劑量當歸六黃湯組、高劑量當歸六黃湯組和順鉑組（每組10只）。取對數(shù)生長期的RM-1 細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞濃度為1×107·mL－1，取0.1 mL RM-1 細胞，分別接種于模型組、低劑量當歸六黃湯組、高劑量當歸六黃湯組和順鉑組小鼠右前肢腋下1 點鐘方向，10 d 后手指觸摸到前肢腋下有皮下結節(jié)且直徑≥5 mm，表明建模成功，本實驗中所有小鼠均建模成功。

1.3 給藥方式將當歸六黃湯顆粒用生理鹽水按一定比例加熱至80℃，沖調(diào)配制成含生藥量為0.13 g·mL－1的母液，并攪拌至完全溶解；于4℃保存?zhèn)溆?。建模結束后次日開始給藥，當歸六黃湯顆粒成人每日用量為2.8 g，按照成人與大鼠劑量換算公式：大鼠劑量=成人劑量/70 kg×6.3。低劑量當歸六黃湯組小鼠給予成人等效量灌胃，即0.25 g·kg－1·d－1，高劑量當歸六黃湯組以成人等效劑量的2 倍灌胃，即0.50 g·kg－1·d－1，順鉑組小鼠給予2 mg·kg－1注射用順鉑0.2 mL 腹腔注射，每日1次，連續(xù)用藥15 d，對照組和模型組小鼠給予等量生理鹽水。給藥結束后，進行后續(xù)實驗。

1.4 各組小鼠脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)檢測各組小鼠眼眶取血1 mL 置于冷凝管中，于－80℃存放待用。采用2% 戊巴比妥將各組小鼠麻醉后脫頸處死并稱質量，取出脾臟和胸腺采用濾紙吸干后分別稱質量，計算脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)。脾臟系數(shù)=脾臟質量/體質量，胸腺系數(shù)=胸腺質量/體質量。

1.5 各組小鼠腫瘤體積和抑瘤率檢測于小鼠右前肢腋下取出腫瘤結節(jié)，測量腫瘤最長直徑a（mm）及與a 垂直的最短直徑b（mm），計算各實驗組腫瘤體積，并計算抑瘤率。腫瘤體積=ab2/2（mm3），抑瘤率=（模型組小鼠平均瘤質量－實驗組小鼠平均瘤質量）/模型組小鼠平均瘤質量×100%。

1.6 HE 染色觀察各組小鼠腫瘤組織病理形態(tài)表現(xiàn)采用4% 多聚甲醛固定腫瘤組織，石蠟包埋后切片，切片厚度為4 μm。采用二甲苯Ⅰ和Ⅱ分別脫蠟5 min 后，于由低到高濃度酒精中吸取水分，后采用蘇木素染色5 min，經(jīng)自來水沖洗后，將切片浸入返藍液中60 s，后采用自來水進行洗滌。浸入95% 酒精中，滴加伊紅溶液染色2 min，并采用自來水洗滌。采用不同濃度酒精脫水后，采用二甲苯透明，中性樹脂封片，并于顯微鏡下觀察腫瘤組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.7 流式細胞術檢測各組小鼠外周血中CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞百分率從冷凝管中取300 μL 小鼠外周血置于離心管中，分別加入2 μL APC抗小鼠CD4抗體，5 μL PerCP/Cyanine 5.5 抗小鼠CD8a 抗體，4℃避光孵育30 min。于離心管中加入2 mL 紅細胞裂解液裂解紅細胞，10 min 后，1 000 r·min－1、半徑8cm離心5min，棄去上清，將細胞沉淀采用2mLPBS重懸并洗滌，1000r·min－1、半徑8cm離心5min，棄 去上清，將沉淀分裝至流式管中，加入含1%多聚甲醛的PBS 緩沖液500 μL，采用流式細胞術進行檢測。

1.8 Western blotting 法檢測各組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達水平取各組小鼠脾臟組織100 mg，經(jīng)RIPA裂解液裂解后，提取總蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分離后，將蛋白轉印于PVDF 膜上，50 g·L－1脫脂奶粉封閉2h后，分別加入兔抗小鼠PD-1 抗體一抗（1∶1000）、兔抗小鼠PD-L1 抗體一抗（1∶1 000），4℃培養(yǎng)箱孵育過夜；洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶4 000），室溫封閉2 h，經(jīng)ECL 顯色后，曝光膠片，采用Image J蛋白分析軟件進行定量分析。以GAPDH 為內(nèi)參，PD-1 和PD-L1 蛋白表達 水平=PD-1 和PD-L1 蛋白積分吸光度（integral absorbance，IA）值/內(nèi)參IA。

1.9 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。采用Shapiro-Wilk 檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，各組小鼠脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)、腫瘤體積、抑瘤率、CD4+和CD8+T淋巴細胞百分率、脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，采用±s 表示，多組樣本均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)與對照組比較，模型組小鼠脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量當歸六黃湯組、高劑量當歸六黃湯組和順鉑組小鼠脾臟系數(shù)及胸腺系數(shù)降低（P＜0.05）；與低劑量當歸六黃湯組比較，高劑量當歸六黃湯組和順鉑組小鼠脾臟系數(shù)及胸腺系數(shù)降低（P＜0.05）；與高劑量當歸六黃湯組比較，順鉑組小鼠脾臟系數(shù)及胸腺系數(shù)降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)Tab.1 Spleen coefficients and thymus coefficients of mice in various groups [n=10,±s,wB/(mg·g－1)]

表1 各組小鼠脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)Tab.1 Spleen coefficients and thymus coefficients of mice in various groups [n=10,±s,wB/(mg·g－1)]

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of Danggui Liuhuang Decoction group；○P＜0.05 compared with high dose of Danggui Liuhuang Decoction group.

Group Control Model Danggui Liuhuang Decontion Low dose High dose Cisplatin FP Spleen coefficient 5.88±0.62 9.04±0.91*8.19±0.83△7.42±0.77△#6.63±0.69△#○26.142＜0.001 Thymus coefficient 0.43±0.06 0.97±0.11*0.85±0.10△0.69±0.08△#0.58±0.07△#○61.730＜0.001

2.2 各組小鼠腫瘤體積和抑瘤率與模型組比較，低劑量當歸六黃湯組、高劑量當歸六黃湯組和順鉑組小鼠腫瘤體積減?。≒＜0.05）；與低劑量當歸六黃湯組比較，高劑量當歸六黃湯組和順鉑組小鼠腫瘤體積減?。≒＜0.05），抑瘤率升高（P＜0.05）；與高劑量當歸六黃湯組比較，順鉑組小鼠腫瘤體積減小（P＜0.05），抑瘤率升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠腫瘤體積和抑瘤率Tab.2 Tumor volumes and inhibitory rates of tumor of mice in various groups (n=10，±s）

表2 各組小鼠腫瘤體積和抑瘤率Tab.2 Tumor volumes and inhibitory rates of tumor of mice in various groups (n=10，±s）

*P＜0.05 compared with model group；△P＜0.05 compared with low dose of Danggui Liuhuang Decoction group；#P＜0.05 compared with high dose of Danggui Liuhuang Decoction group.“－”：No data.

Group Model Danggui Liuhuang Decontion Low dose High dose Cisplatin FP Tumor volume（V/mm3）1 367.44±152.66 1 128.69±140.68*△873.42±92.54*△685.17±88.23*△#59.656＜0.001 Inhibitory rate of tumor（η/%）－17.45±3.22 36.12±3.46*#49.89±3.97*△#208.727＜0.001

2.3 各組小鼠腫瘤組織病理形態(tài)表現(xiàn)HE 染色結果顯示：模型組小鼠可見腫瘤細胞分布均勻而緊密，偶有空泡；低劑量當歸六黃湯組小鼠腫瘤細胞分布均勻且空泡增多；高劑量當歸六黃湯組小鼠腫瘤細胞排列疏松，空泡數(shù)明顯增多；順鉑組小鼠腫瘤細胞明顯減少，分布分散，腫瘤細胞與空泡間隔分布。見圖1。

圖1 各組小鼠腫瘤組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×400）Fig.1 Pathomorphology of tumor tissue of mice in various groups (HE,×400)

2.4 各組小鼠外周血中CD4+和CD8+ T 淋巴細胞百分率與對照組比較，模型組小鼠外周血中CD4+T淋巴細胞百分率降低（P＜0.05），CD8+T淋巴細胞百分率升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量當歸六黃湯組、高劑量當歸六黃湯組和順鉑組小鼠外周血中CD4+T淋巴細胞百分率升高（P＜0.05），CD8+T淋巴細胞百分率降低（P＜0.05）；與低劑量當歸六黃湯組比較，高劑量當歸六黃湯組和順鉑組小鼠外周血中CD4+T淋巴細胞百分率升高（P＜0.05），CD8+T淋巴細胞百分率降低（P＜0.05）；與高劑量當歸六黃湯組比較，順鉑組小鼠外周血中CD4+T淋巴細胞百分率升高（P＜0.05），CD8+T細胞細胞百分率降低（P＜0.05）。見圖2 和表3。

表3 各組小鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴細胞百分率Tab.3 Percentages of CD4+ and CD8+Tlymphocytes in peripheral blood of mice in various groups (n=10,±s,η/%)

表3 各組小鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴細胞百分率Tab.3 Percentages of CD4+ and CD8+Tlymphocytes in peripheral blood of mice in various groups (n=10,±s,η/%)

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of Danggui Liuhuang Decoction group；○P＜0.05 compared with high dose of Danggui Liuhuang Decoction group.

Group Control Model Danggui Liuhuang Decontion Low dose High dose Cisplatin FP Percentage of CD4+Tlymphocytes 33.35±4.34 16.12±2.25*20.48±2.31*△24.27±2.49*△#29.49±3.28*△#○51.244＜0.01 Percentage of CD8+ T lymphocytes 12.16±1.46 26.89±2.97*22.76±2.65*△18.46±2.16*△#15.75±1.88*△#○63.907＜0.01

圖2 流式細胞術檢測各組小鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴細胞百分率Fig.2 Percentages of CD4+ and CD8+ lymphocytes in peripheral blood of mice in various groups detected by flow cytometry

2.5 各組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達水平與對照組比較，模型組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量當歸六黃湯組、高劑量當歸六黃湯組和順鉑組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與低劑量當歸六黃湯組比較，高劑量當歸六黃湯組和順鉑組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與高劑量當歸六黃湯組比較，順鉑組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達水平降低（P＜0.05）。見圖3 和表4。

表4 各組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of PD-1 and PD-L1 proteins in spleen tissue of mice in various groups (n=10，±s）

表4 各組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of PD-1 and PD-L1 proteins in spleen tissue of mice in various groups (n=10，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of Danggui Liuhuang Decoction group；○P＜0.05 compared with high dose of Danggui Liuhuang Decoction group.

Group Control Model Danggui Liuhuang Decontion Low dose High dose Cisplatin FP PD-1 0.43±0.05 1.24±0.13*1.03±0.11*△0.88±0.09*△#0.62±0.07*△#○116.348＜0.001 PD-L1 0.45±0.06 1.26±0.14*1.07±0.13*△0.86±0.10*△#0.67±0.08*△#○90.327＜0.001

圖3 Western blotting 法檢測各組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of PD-1 and PD-L1 proteins in spleen tissue of mice in various groups

3 討 論

PCa 是人類特有的疾病，死亡率僅次于肺癌，嚴重威脅男性健康。引起PCa 的病因尚未完全查明，目前認為種族、遺傳、性活動和飲食習慣等均是該病的致病因素，歐美國家男性、有家族病史者、性活動頻繁者及高脂飲食者等患PCa 的風險及發(fā)病率偏高。當歸六黃湯是中醫(yī)方劑，在臨床上治療甲狀腺功能亢進和結核病等效果顯著，具有抗菌、抗炎、抗纖維化和免疫調(diào)節(jié)等功能［11］。本實驗比較PCa 荷瘤小鼠相關指標，探討當歸六黃湯對PCa 荷瘤小鼠免疫功能的影響及相關作用機制，為PCa 的臨床治療提供依據(jù)。

現(xiàn)代中醫(yī)認為PCa 病位在精室，與腎、肝和脾等關系密切，以精室虧虛、體虛為本，濕熱為標，濕熱蘊結下焦為主要病機。當歸六黃湯主要成分有當歸、黃芪、生地黃、黃連、黃柏、黃芩和熟地黃等，主治發(fā)熱、盜汗、面赤心煩和口干舌燥等，有滋陰清熱功效。當歸不僅可補血活血，還可潤腸通便［12］；生地黃清熱生津養(yǎng)陰涼血，治療陰虛內(nèi)熱；黃連清熱燥濕，瀉火解毒；黃柏清熱解毒，瀉火燥濕；黃芩濕熱瀉?。?3］；黃芪治療表虛盜汗，氣滯濕 阻［14］；地黃滋陰補血，治 療腰膝痿弱。研究［15］表明：當歸及其活性成分可以抑制腫瘤生長，誘導細胞凋亡。此外，當歸相關提取物可提高結直腸癌圍術期患者機體免疫功能，促進腫瘤細胞凋亡，發(fā)揮抗癌作用［16］。研究［17］顯示：黃芪的主要成分可提高機體免疫力，協(xié)同增強常規(guī)化療藥物順鉑的抗癌作用，作為替代免疫療法用于肺癌患者維持治療具有潛在可行性。黃芪多糖可以上調(diào)相關因子水平，促進腫瘤細胞凋亡，抑制癌細胞增殖，達到抗腫瘤的目的［18］。本研究結果顯示：當歸六黃湯可降低小鼠脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)，減小腫瘤體積，提高抑瘤率，改善T 淋巴細胞亞群百分率，改善腫瘤組織病理變化，提示當歸六黃湯可通過改善免疫器官功能、T 淋巴細胞亞群比例和腫瘤組織病理形態(tài)表現(xiàn)，達到抗腫瘤及改善免疫功能的目的。

PD-1/PD-L1 是與免疫功能相關的信號通路。正常情況下，T 淋巴細胞處于靜息狀態(tài)，PD-1 呈低表達，當T 淋巴細胞被激活可引起PD-1 表達上調(diào)。PD-L1 與PD-1 相互作用可抑制T 淋巴細胞活性，抑制其增殖并誘導細胞凋亡。研究［19］顯示：PD-1 和PD-L1 的表達可通過創(chuàng)建免疫抑制腫瘤微環(huán)境來促進小鼠PCa 的發(fā)展。研究［20］顯示：阻斷PD-1/PD-L1 信號通路聯(lián)合放療，可增強小鼠T 淋巴細胞抗腫瘤免疫活性，誘導針對PCa 的強特異性抗腫瘤免疫應答。本研究結果顯示：當歸六黃湯可降低PCa 荷瘤小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達水平，且與劑量呈負相關關系，提示當歸六黃湯對免疫功能的改善作用，可能與抑制PD-1/PD-L1 信號通路有關聯(lián)。

綜上所述，當歸六黃湯可增強PCa 荷瘤小鼠免疫功能，可能通過抑制PD-1/PD-L1 信號通路發(fā)揮作用，為臨床PCa 的治療提供新的治療方案。