程瑩,李思思,劉曉暉,李亞晨,邵靜,胡宏
1. 大連醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室,大連 116044 2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,大連 116027 3. 大連醫(yī)科大學(xué)中山學(xué)院,大連 116085
阻燃劑是一類能夠阻止聚合物材料引燃或抑制火焰?zhèn)鞑サ闹鷦浞N類繁多,但以溴系有機(jī)阻燃劑、尤其以多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)最具代表性。PBDEs與其產(chǎn)品以非共價(jià)方式結(jié)合,在使用及處理回收時(shí),可通過(guò)揮發(fā)、燃燒或與空氣污染物形成復(fù)合顆粒物等方式存在于環(huán)境中,并隨環(huán)境介質(zhì)遠(yuǎn)距離遷移,導(dǎo)致全球性環(huán)境污染[1]。目前育齡婦女的脂肪、血液、胎盤,哺乳期乳汁,以及胚胎肝臟和新生兒臍血中均已檢出PBDEs多種同系物的存在;特別是胎盤PBDEs負(fù)荷遠(yuǎn)高于胚胎肝臟,且逐年增高,成為僅次于母血的PBDEs積攢地[2-5]。這提示PBDEs對(duì)胚胎發(fā)育可能產(chǎn)生潛在危害,日后發(fā)展為嬰幼兒、兒童甚至是成人疾病的基礎(chǔ)。
動(dòng)物研究顯示,PBDEs具有發(fā)育神經(jīng)毒性[6],盡管目前人群流行病學(xué)調(diào)查證據(jù)有限,但仍顯示出孕期PBDEs暴露與出生兒童的神經(jīng)發(fā)育動(dòng)作和智力障礙具有相關(guān)性[7-10]。當(dāng)前,針對(duì)PBDEs發(fā)育神經(jīng)毒性研究已得到相當(dāng)規(guī)模的開(kāi)展,結(jié)果也頗為一致,然而其毒作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。孕期PBDEs暴露對(duì)子代也具有甲狀腺激素(thyroid hormone, TH)干擾效應(yīng),結(jié)局表現(xiàn)為類似臨床或亞臨床甲狀腺功能減退(甲減)[11]。而妊娠早期,即胎腦發(fā)生、發(fā)育的關(guān)鍵期,甲減會(huì)導(dǎo)致子代出現(xiàn)不可逆的腦損傷,表現(xiàn)為智力缺陷、活躍、認(rèn)知障礙和適應(yīng)能力下降等[12-13],這與孕期PBDEs暴露導(dǎo)致的子代神經(jīng)發(fā)育毒性效應(yīng)頗為相似。因此,有觀點(diǎn)認(rèn)為PBDEs發(fā)育神經(jīng)毒性可能由TH干擾(甲減)所致,無(wú)疑為PBDEs發(fā)育神經(jīng)毒性機(jī)制研究提出一個(gè)重要探索方向。
十溴聯(lián)苯醚(BDE 209)是PBDEs家族中含溴原子數(shù)量最多的同系物,由于其阻燃效率高、添加量較少及急性毒性相對(duì)低等特點(diǎn)而應(yīng)用最廣[14]。我國(guó)BDE209污染情況較為嚴(yán)重[15]。且2015年的一項(xiàng)研究顯示,BDE 209是我國(guó)松花江流域地表沉積物中PBDEs的主要同系物,占PBDEs總量的80%以上[16],提示其存在潛在危害。針對(duì)BDE 209孕期暴露對(duì)子代TH的干擾研究目前尚不深入,還需進(jìn)一步研究。
目前對(duì)于PBDEs誘導(dǎo)的TH干擾效應(yīng)已經(jīng)在多種生物體系(細(xì)胞、動(dòng)物甚至人)中得到證實(shí)[17-19]。然而,迄今多數(shù)研究是通過(guò)對(duì)出生時(shí)或出生后子代血循環(huán)TH水平的檢測(cè)進(jìn)行推論,我們尚未發(fā)現(xiàn)PBDEs對(duì)孕早期胚胎TH干擾表型的直接研究。而孕早期胚胎在TH來(lái)源和調(diào)節(jié)機(jī)制上具有特殊性,出生后結(jié)果并不能反映孕早期TH真實(shí)狀態(tài)。而B(niǎo)DE 209對(duì)于出生后子代發(fā)育神經(jīng)損傷效應(yīng),本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)三代小鼠BDE 209染毒能夠影響子代發(fā)育,降低子代空間學(xué)習(xí)記憶能力和空間位置記憶能力;本課題組也曾評(píng)價(jià)孕中期女性羊水PBDEs水平及其與TH干擾的潛在關(guān)系,但尚未建立完整出生隊(duì)列以確定對(duì)出生子代的發(fā)育損傷[20]。因此,本研究以大鼠為研究對(duì)象,建立大鼠孕期BDE 209暴露模型,著重觀察BDE 209對(duì)孕早期大鼠胚胎和胎腦TH干擾表型,并檢測(cè)胎腦組織形態(tài)學(xué)改變,為深入研究BDE 209的TH干擾效應(yīng)提供基礎(chǔ)依據(jù),并為進(jìn)一步探索孕期BDE 209暴露誘導(dǎo)的TH干擾效應(yīng)與其發(fā)育神經(jīng)毒性的內(nèi)在聯(lián)系提供研究基礎(chǔ)。
儀器:T100TM Thermal Cycler梯度PCR儀(Bio-RAD,美國(guó));TP800實(shí)時(shí)PCR儀(TaKaRa,日本);3550酶標(biāo)儀(Thermo,美國(guó))。
試劑:BDE 209(純度>99%,上海阿拉丁試劑公司,中國(guó)),Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR(湖南艾科瑞生物工程有限公司,中國(guó));RNAiso Plus、SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司,中國(guó));大鼠三碘甲狀腺原氨酸(TT3)、總甲狀腺激素(TT4)、游離甲狀腺素(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)和促甲狀腺素(TSH)免疫試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司,中國(guó));其他試劑均為分析純,購(gòu)于中國(guó)天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。
1.2.1 BDE 209孕期染毒大鼠模型建立及生物材料采集
(1)動(dòng)物模型建立:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在大連醫(yī)科大學(xué)重大疾病基因工程模式動(dòng)物研究所維護(hù)及喂養(yǎng)。10周齡Wistar雌性大鼠24只,稱取體質(zhì)量后排序,按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組(對(duì)照組、低劑量和高劑量組,每組8只),不同劑量組間母鼠體質(zhì)量差異無(wú)顯著性(P>0.05)。選擇階段合籠法與10周齡Wistar雄鼠按照雌∶雄=2∶1合籠交配,次日清晨檢查陰道涂片,發(fā)現(xiàn)精子則記為妊娠第0天(GD0)。避光稱取一定量BDE 209粉末溶于花生油中,渦旋搖勻。根據(jù)孕鼠體質(zhì)量,按分組劑量染毒如下:對(duì)照組(花生油)、低劑量組(100 mg·kg-1bw)、高劑量組(300 mg·kg-1bw)[15]。染毒采用每天避光灌胃一次,最長(zhǎng)至GD20(仔鼠出生前一天)。所有動(dòng)物均自由進(jìn)食、飲水;室內(nèi)溫度20~25 ℃、濕度40%~70%、光照按亮/暗12 h循環(huán)。
(2)生物樣品采集:在GD15和GD20這2個(gè)時(shí)間點(diǎn),4%水合氯醛麻醉母鼠,剖開(kāi)子宮,小心吸取羊水(作為一個(gè)獨(dú)立樣本)至無(wú)菌管并放入液氮中速凍,標(biāo)記后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存,用于羊水TH水平測(cè)定;記錄每窩胚胎大鼠體質(zhì)量;GD20胎鼠每窩斷頭后取血(作為一個(gè)獨(dú)立樣本),室溫靜置10 min后,2 500 r·min-1離心20 min,吸取上層血清,標(biāo)記后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存,用于GD20胎鼠血清中TH水平測(cè)定;采集GD15和GD20胎腦組織,用于檢測(cè)胎腦下丘腦-垂體-甲狀腺素軸(hypothalamic-pituitary-thyroxine axis,HPT軸)功能變化;采集GD20胎腦,浸泡于4%多聚甲醛溶液中24 h,隔日換液,用作孕后期胎腦形態(tài)學(xué)檢測(cè)。
1.2.2 RT-qPCR
本研究通過(guò)檢測(cè)不同胚胎發(fā)育時(shí)期胚胎大鼠腦組織促甲狀腺激素釋放激素(thyrotropin-releasing hormone, Trh)的表達(dá),觀察孕期BDE 209暴露對(duì)胎腦HPT軸功能的影響,初步分析其在胎鼠循環(huán)和干擾胎腦組織TH中的作用。
(1)總RNA提取及質(zhì)量控制:取出適量-80 ℃凍存組織,用500~1 000 mg·mL-1Trizol將稱量質(zhì)量后的組織置于4 mL無(wú)菌管中,高速研磨20 s。冰上靜置10 min后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,4 ℃、2 500 r·min-1離心5 min。吸取上清至新的1.5 mL離心管中置于冰上。按照RNAiso Plus試劑盒(南京諾維贊公司,中國(guó))說(shuō)明書(shū),提取總RNA,通過(guò)紫外吸收值A(chǔ)260/280進(jìn)行質(zhì)量控制。A260/280比值在1.8~2.0之間時(shí),可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
(2)RNA反轉(zhuǎn)錄:按照Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)常規(guī)操作,將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ ∞。
(3)引物設(shè)計(jì)和合成:大鼠來(lái)源GAPDH和Trh引物系委托大連萬(wàn)澤貿(mào)易有限公司設(shè)計(jì)合成。名稱和序列詳見(jiàn)表1。
(4)PCR反應(yīng):根據(jù)SYBR qPCR Master Mix試劑盒配制20 μL體系上機(jī)反應(yīng)。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán),95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s。
(5)結(jié)果分析:應(yīng)用TP800 v4.01軟件,以GAPDH表達(dá)量對(duì)mRNA表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。
1.2.3 ELISA
從-80 ℃冰箱中取出組織樣品,2 500 r·min-1離心20 min,上清轉(zhuǎn)移至新1.5 mL離心管中,組別中上樣量不足時(shí)吸取各組最低量后加入同等量三蒸水補(bǔ)齊。由4 ℃冰箱中取出試劑盒,置于室溫平衡30 min以上。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及各孔OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將各樣品孔OD值帶入公式,計(jì)算樣品濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
表1 大鼠mRNA表達(dá)引物序列Table 1 Primer sequences for mRNA expression in fetal rats
1.2.4 HE染色
將固定好的GD20胎鼠腦組織取出后放入包埋盒中,按照分組情況以序號(hào)標(biāo)記。從低濃度酒精(40%)開(kāi)始向高濃度酒精依次脫水,再將其依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中透明。將已透明的組織塊用鑷子小心夾取,大腦皮層朝上置于已溶化好的石蠟中,放入冷卻箱中冷卻。待石蠟完全凝固取下組織蠟塊,固定在切片機(jī)載物臺(tái)上,切片的厚度為3 μm。將切好的蠟片置于50 ℃溫水中,待蠟片平展后,用防脫載玻片撈出,70 ℃烤箱烤片,干燥后可置于37 ℃恒溫箱備用。染色時(shí)經(jīng)二甲苯逐級(jí)脫蠟過(guò)酒精后清洗,經(jīng)蘇木素、伊紅染色,逐級(jí)酒精脫水,用中性樹(shù)膠封片,干燥后蓋片,在光學(xué)顯微鏡下觀察。
本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均來(lái)源于至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn),所有結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS 13.0,統(tǒng)計(jì)分析方法采用方差分析(ANOVO)檢驗(yàn)。按檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
大鼠2月齡時(shí)性成熟,妊娠期(GD)通常為19~22 d。GD15為胎鼠甲狀腺功能完全建立之前,GD20時(shí)胎鼠甲狀腺功能基本達(dá)到高峰[21-22]。因此,本實(shí)驗(yàn)選取GD15和GD20這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)生物樣品采集和檢測(cè)。由表2可知,GD15低劑量組胎鼠體質(zhì)量與對(duì)照組差異不明顯,高劑量組胎鼠體質(zhì)量與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.01);GD20低劑量組胎鼠體質(zhì)量相比對(duì)照組亦有下降趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),高劑量組體質(zhì)量則顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。
在GD15和GD20采集孕鼠子宮羊水,并在GD20剝離胎鼠,斷頭取血。GD15仔鼠胚胎由于個(gè)體較小,無(wú)法采集其血液,故僅收集GD20胎鼠外周血液。對(duì)羊水和外周血TH的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括TT3、FT3、TT4、FT4和TSH。
2.2.1 孕期BDE 209暴露對(duì)GD15羊水TH的影響
如表3所示,GD15羊水中TT3含量有升高趨勢(shì),尤其低劑量組,但未見(jiàn)顯著性差異;而FT3含量在低、高劑量組均有下降趨勢(shì),但與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。TT4和FT4含量在低、高劑量組均有升高趨勢(shì),尤其FT4差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。TSH在高劑量組水平上升,與對(duì)照組之間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
2.2.2 孕期BDE 209暴露對(duì)GD20羊水和胚胎大鼠外周血TH的影響
GD20羊水TH水平由表4所示,BDE 209低劑量組TT3水平有增高趨勢(shì),但未見(jiàn)顯著差異;FT3水平在BDE 209低、高劑量組均出現(xiàn)降低,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TT4水平則與GD15時(shí)相反,與對(duì)照組相比略有下降趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;FT4水平與GD15的表現(xiàn)一致,有上升趨勢(shì),在高劑量組有明顯差異(P<0.05);而TSH水平明顯增高,在低劑量組和高劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
GD20胚胎大鼠外周血TH水平如表5所示,TT3水平在低劑量組雖然有所降低,但與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異;FT3水平與同時(shí)期羊水中的變化趨勢(shì)一致(表4),具有下降趨勢(shì),尤其在低劑量時(shí),但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TT4和FT4具有下降趨勢(shì),但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TSH水平逐漸升高,高劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),這與同時(shí)期羊水中的情況類似。
表2 大鼠孕期BDE 209暴露對(duì)胚胎大鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on the body mass of fetal rats
表3 大鼠孕期BDE 209暴露對(duì)GD15羊水甲狀腺激素(TH)的影響Table 3 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on the amniotic fluid thyroid hormone (TH) level on GD15
表4 大鼠孕期BDE 209暴露對(duì)GD20羊水TH的影響Table 4 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on the amniotic fluid TH level on GD20
通過(guò)觀察孕期BDE 209暴露對(duì)不同胚胎發(fā)育時(shí)期胎腦Trh表達(dá)的影響,初步分析HPT軸功能損傷在PBDEs致胎鼠循環(huán)和胎腦組織TH干擾的可能作用。
GD15和GD20胎腦Trh基因表達(dá)如圖1所示,正常胎腦(對(duì)照組)在孕期不同時(shí)期Trh基因表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定(表6);BDE 209孕期暴露可顯著抑制胎腦Trh表達(dá),且隨著孕期進(jìn)程,對(duì)Trh抑制程度加深。低劑量組TrhmRNA水平在GD15時(shí)是對(duì)照組的68.85%(P<0.05),在GD20時(shí)是對(duì)照組的57.53%(P<0.05);高劑量組TrhmRNA水平在GD15時(shí)是對(duì)照組的79.44%,在GD20時(shí)是對(duì)照組的62.17%(P<0.05)。這提示,孕期BDE 209持續(xù)暴露對(duì)Trh具有進(jìn)行性抑制作用(表7)。
由于GD15胎鼠胎腦較小且含水量較多,受HE染色時(shí)脫水等可操作條件的限制,檢測(cè)GD15胎鼠腦組織發(fā)育形態(tài)學(xué)改變較為困難。因此,只選擇GD20胎腦觀察。如圖2所示,對(duì)照組胎腦細(xì)胞較為完整,細(xì)胞形態(tài)正常,未見(jiàn)明顯病理性改變。低劑量組胎腦與對(duì)照組相比也未見(jiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變。高劑量組胎腦與對(duì)照組相比,出現(xiàn)局域性腦細(xì)胞排列明顯稀疏、核固縮和細(xì)胞間隙增大現(xiàn)象??梢?jiàn),孕期BDE 209可引起胎鼠腦組織病理?yè)p傷,使孕末期胎鼠腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,細(xì)胞數(shù)量減少,腦組織出現(xiàn)萎縮,可能影響后代學(xué)習(xí)和記憶能力。
圖1 大鼠孕期BDE 209暴露對(duì)GD15和GD20 大鼠胎腦Trh mRNA表達(dá)的影響注:*P<0.05,與對(duì)照組相比。Fig. 1 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on the Trh mRNA expression in fetal brain on GD15 and GD20Note: *means P<0.05 compared with the control.
表5 大鼠孕期BDE 209暴露對(duì)GD20胚胎大鼠血清TH的影響Table 5 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on the serum TH level of fetal rats on GD20
表6 對(duì)照組胚胎大鼠腦組織Trh基因表達(dá)Table 6 Trh gene expression in the brain of control fetal rats
表7 大鼠孕期BDE 209暴露對(duì)胚胎大鼠腦組織Trh基因表達(dá)的影響Table 7 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on Trh gene expression in the fetal rat brain
圖2 大鼠孕期BDE 209暴露對(duì)GD20胎腦發(fā)育形態(tài)學(xué)影響注:C對(duì)照組;L低劑量組(100 mg·kg-1 bw);H高劑量組 (300 mg·kg-1 bw);放大倍數(shù)100倍和200倍。Fig. 2 Representative morphological changes induced by BDE 209 exposure during pregnancy on GD20 fetal rat brainsNote: C represents control; L represents low dose group (100 mg·kg-1 bw); H represents high dose group (300 mg·kg-1 bw); magnifications is 100 or 200.
TH可調(diào)節(jié)大腦皮層海馬區(qū)的膽堿能和多巴胺能系統(tǒng)的發(fā)育,對(duì)于促進(jìn)機(jī)體正常新陳代謝,維持機(jī)體骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。而在孕早期(即胎腦發(fā)生發(fā)育關(guān)鍵期),TH對(duì)胎腦發(fā)育和成熟起著關(guān)鍵作用。大量研究顯示,PBDEs具有TH干擾毒性效應(yīng),如損傷甲狀腺形態(tài)、改變TH水平、高親和力結(jié)合TH轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白拮抗TH等[23-24]。而甲狀腺功能的微小改變就可能對(duì)人體健康,特別是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生影響。
目前有關(guān)孕期PBDEs暴露對(duì)胎鼠TH干擾的評(píng)價(jià),多是通過(guò)對(duì)出生子鼠循環(huán)TH水平的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行間接/回顧性推測(cè)[17,25],直接研究尚未見(jiàn)報(bào)道。有研究認(rèn)為,羊水TH水平與臍血激素水平有一定的相關(guān)性,反映了胎兒TH的代謝,而與孕婦血激素濃度相關(guān)性不強(qiáng)。因此,羊水TH可能是反映胎兒甲狀腺功能的較好指標(biāo)[26]。在本實(shí)驗(yàn)中,孕早期(GD15)BDE 209暴露可導(dǎo)致羊水FT4顯著升高,并有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系,同時(shí)TT4水平也有升高的趨勢(shì),盡管與對(duì)照相比沒(méi)有顯著差異。這提示,BDE 209暴露可導(dǎo)致孕早期胚胎處于高TH狀態(tài)(類T4甲亢)。而在孕末期(GD20),羊水FT4水平回降至與對(duì)照相比差別不大,雖然在高劑量組仍有顯著升高;FT3水平在低、高劑量組均出現(xiàn)顯著降低;TSH水平顯著升高,這表明胎腦垂體對(duì)胚胎循環(huán)TH水平變化的抵抗。GD20胎鼠血清循環(huán)TH水平總體變化趨勢(shì)與同時(shí)期羊水TH動(dòng)態(tài)變化基本一致,TSH水平升高,孕末期羊水FT3水平明顯降低,且在GD20胎鼠血清中也顯著下降,可能由于BDE 209損傷中樞HPT軸,導(dǎo)致胎鼠甲狀腺T3生成不足所致。結(jié)果提示,孕末期胎鼠可能處于中樞性甲狀腺功能減退狀態(tài)。文獻(xiàn)報(bào)道,孕期BDE 209暴露(300 mg·kg-1bw)可導(dǎo)致出生子鼠出生后20 d(PND20)血清T3水平下降,TSH水平升高[27],這與本研究結(jié)果基本一致。孕早期胚胎在TH來(lái)源和調(diào)節(jié)機(jī)制上具有特殊性。在來(lái)源方面,孕(早)期胚胎甲狀腺功能尚未建立完全,其主要依賴于母體循環(huán)TH;在調(diào)節(jié)機(jī)制方面,來(lái)自母體的高濃度TH需要胎盤脫碘酶3(Dio3)調(diào)節(jié),將細(xì)胞外T3和T4滅活,以保證胎兒TH處于最佳生理水平[28]。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),PBDEs可誘導(dǎo)小鼠胎盤Dio3表達(dá)下調(diào),并可能與其發(fā)育神經(jīng)毒性效應(yīng)有關(guān)[11]。結(jié)合PBDEs在胎盤蓄積程度,我們推測(cè),PBDEs可能通過(guò)抑制胎盤Dio3活性,干擾胚胎TH。而TH對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程和結(jié)局起關(guān)鍵作用,無(wú)論甲亢或甲減均可導(dǎo)致胚胎發(fā)育損害。在本實(shí)驗(yàn)中,BDE 209孕期高劑量暴露可導(dǎo)致GD15胎鼠體質(zhì)量升高,而GD20胎鼠體質(zhì)量降低,這可能因?yàn)锽DE 209對(duì)孕早、晚期胚胎TH的干擾表型存在差異,同時(shí)可能也與BDE 209或其代謝產(chǎn)物在胎鼠體內(nèi)持續(xù)蓄積有關(guān),導(dǎo)致不同發(fā)育窗口對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育影響的結(jié)局不同。
胎兒下丘腦在其自身HPT軸發(fā)育、成熟的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用,且在孕晚期,胎腦HPT軸發(fā)育基本成熟,對(duì)胚胎循環(huán)和胎腦TH調(diào)節(jié)也有重要作用[29]。因此,本研究通過(guò)檢測(cè)不同時(shí)期胎腦促甲狀腺激素釋放激素(Trh)的表達(dá),觀察孕期BDE 209暴露對(duì)胎腦HPT軸功能的影響,分析其在胎鼠循環(huán)和胎腦組織TH干擾中的作用。研究結(jié)果顯示,孕早期BDE 209暴露導(dǎo)致胎腦(GD15)Trh的表達(dá)顯著下調(diào),表明在孕早期胎鼠下丘腦功能已受損。在孕末期,胎鼠本身HPT軸的功能基本成熟,TH主要來(lái)自其自身甲狀腺的分泌,循環(huán)TH水平可能取決于BDE209對(duì)中樞HPT軸功能的損傷程度。如果HPT軸功能失調(diào),可能影響下丘腦Trh的生成和釋放,抑制垂體對(duì)Trh的反應(yīng)或TSH活性成熟過(guò)程,導(dǎo)致T3、T4生成不足而在血循環(huán)的水平下降,而TSH水平可能出現(xiàn)下降、不變或上升,這與Trh或Trh受體基因敲除小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[30],也與上述孕末期羊水和胎鼠血清中的TH干擾的表型基本一致。
除了前述一系列功能指標(biāo),BDE 209對(duì)胎鼠腦組織形態(tài)學(xué)的改變,是評(píng)價(jià)其毒性效應(yīng)不可或缺的指標(biāo)。目前,針對(duì)PBDEs的TH干擾及發(fā)育神經(jīng)毒性研究多數(shù)通過(guò)對(duì)出生子代神經(jīng)行為、認(rèn)知能力和學(xué)習(xí)記憶等損傷效應(yīng)進(jìn)行探討,涉及體內(nèi)胎腦的病理變化和分子通路的研究較少。本研究通過(guò)觀察GD20胎鼠胎腦形態(tài)學(xué)的改變,發(fā)現(xiàn)孕期BDE 209暴露可引起孕后期胎鼠腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,細(xì)胞數(shù)量減少,腦組織出現(xiàn)萎縮,從而影響出生子代神經(jīng)行為、學(xué)習(xí)和記憶能力。日后,可對(duì)胎腦各功能區(qū)域細(xì)致分區(qū),并檢測(cè)胚胎腦組織TH信號(hào)傳導(dǎo)分子表達(dá),進(jìn)一步探討孕期BDE 209暴露對(duì)于后代的毒性效應(yīng)。
目前對(duì)于PBDEs毒性作用研究還較為獨(dú)立,而神經(jīng)發(fā)育缺陷的重要機(jī)制之一即為TH水平不平衡,這提示,PBDEs誘導(dǎo)的TH干擾與發(fā)育神經(jīng)毒性之間可能存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)。孕期是生命的初始,與生命質(zhì)量關(guān)系密切。因此,深入研究PBDEs毒性效應(yīng)的內(nèi)在聯(lián)系,找出特異性作用靶點(diǎn)即生物標(biāo)志物,對(duì)防治PBDEs造成的早期健康損害具有深遠(yuǎn)意義,是目前急需重視的研究方向。