程瑩,李思思,劉曉暉,李亞晨,邵靜,胡宏

1. 大連醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室，大連 116044 2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，大連 116027 3. 大連醫(yī)科大學(xué)中山學(xué)院，大連 116085

阻燃劑是一類能夠阻止聚合物材料引燃或抑制火焰?zhèn)鞑サ闹鷦浞N類繁多，但以溴系有機(jī)阻燃劑、尤其以多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)最具代表性。PBDEs與其產(chǎn)品以非共價(jià)方式結(jié)合，在使用及處理回收時(shí)，可通過(guò)揮發(fā)、燃燒或與空氣污染物形成復(fù)合顆粒物等方式存在于環(huán)境中，并隨環(huán)境介質(zhì)遠(yuǎn)距離遷移，導(dǎo)致全球性環(huán)境污染[1]。目前育齡婦女的脂肪、血液、胎盤，哺乳期乳汁，以及胚胎肝臟和新生兒臍血中均已檢出PBDEs多種同系物的存在；特別是胎盤PBDEs負(fù)荷遠(yuǎn)高于胚胎肝臟，且逐年增高，成為僅次于母血的PBDEs積攢地[2-5]。這提示PBDEs對(duì)胚胎發(fā)育可能產(chǎn)生潛在危害，日后發(fā)展為嬰幼兒、兒童甚至是成人疾病的基礎(chǔ)。

動(dòng)物研究顯示，PBDEs具有發(fā)育神經(jīng)毒性[6]，盡管目前人群流行病學(xué)調(diào)查證據(jù)有限，但仍顯示出孕期PBDEs暴露與出生兒童的神經(jīng)發(fā)育動(dòng)作和智力障礙具有相關(guān)性[7-10]。當(dāng)前，針對(duì)PBDEs發(fā)育神經(jīng)毒性研究已得到相當(dāng)規(guī)模的開(kāi)展，結(jié)果也頗為一致，然而其毒作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。孕期PBDEs暴露對(duì)子代也具有甲狀腺激素(thyroid hormone, TH)干擾效應(yīng)，結(jié)局表現(xiàn)為類似臨床或亞臨床甲狀腺功能減退(甲減)[11]。而妊娠早期，即胎腦發(fā)生、發(fā)育的關(guān)鍵期，甲減會(huì)導(dǎo)致子代出現(xiàn)不可逆的腦損傷，表現(xiàn)為智力缺陷、活躍、認(rèn)知障礙和適應(yīng)能力下降等[12-13]，這與孕期PBDEs暴露導(dǎo)致的子代神經(jīng)發(fā)育毒性效應(yīng)頗為相似。因此，有觀點(diǎn)認(rèn)為PBDEs發(fā)育神經(jīng)毒性可能由TH干擾(甲減)所致，無(wú)疑為PBDEs發(fā)育神經(jīng)毒性機(jī)制研究提出一個(gè)重要探索方向。

十溴聯(lián)苯醚(BDE 209)是PBDEs家族中含溴原子數(shù)量最多的同系物，由于其阻燃效率高、添加量較少及急性毒性相對(duì)低等特點(diǎn)而應(yīng)用最廣[14]。我國(guó)BDE209污染情況較為嚴(yán)重[15]。且2015年的一項(xiàng)研究顯示，BDE 209是我國(guó)松花江流域地表沉積物中PBDEs的主要同系物，占PBDEs總量的80%以上[16]，提示其存在潛在危害。針對(duì)BDE 209孕期暴露對(duì)子代TH的干擾研究目前尚不深入，還需進(jìn)一步研究。

目前對(duì)于PBDEs誘導(dǎo)的TH干擾效應(yīng)已經(jīng)在多種生物體系(細(xì)胞、動(dòng)物甚至人)中得到證實(shí)[17-19]。然而，迄今多數(shù)研究是通過(guò)對(duì)出生時(shí)或出生后子代血循環(huán)TH水平的檢測(cè)進(jìn)行推論，我們尚未發(fā)現(xiàn)PBDEs對(duì)孕早期胚胎TH干擾表型的直接研究。而孕早期胚胎在TH來(lái)源和調(diào)節(jié)機(jī)制上具有特殊性，出生后結(jié)果并不能反映孕早期TH真實(shí)狀態(tài)。而B(niǎo)DE 209對(duì)于出生后子代發(fā)育神經(jīng)損傷效應(yīng)，本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)三代小鼠BDE 209染毒能夠影響子代發(fā)育，降低子代空間學(xué)習(xí)記憶能力和空間位置記憶能力；本課題組也曾評(píng)價(jià)孕中期女性羊水PBDEs水平及其與TH干擾的潛在關(guān)系，但尚未建立完整出生隊(duì)列以確定對(duì)出生子代的發(fā)育損傷[20]。因此，本研究以大鼠為研究對(duì)象，建立大鼠孕期BDE 209暴露模型，著重觀察BDE 209對(duì)孕早期大鼠胚胎和胎腦TH干擾表型，并檢測(cè)胎腦組織形態(tài)學(xué)改變，為深入研究BDE 209的TH干擾效應(yīng)提供基礎(chǔ)依據(jù)，并為進(jìn)一步探索孕期BDE 209暴露誘導(dǎo)的TH干擾效應(yīng)與其發(fā)育神經(jīng)毒性的內(nèi)在聯(lián)系提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：T100TM Thermal Cycler梯度PCR儀(Bio-RAD，美國(guó))；TP800實(shí)時(shí)PCR儀(TaKaRa，日本)；3550酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))。

試劑：BDE 209(純度>99%，上海阿拉丁試劑公司，中國(guó))，Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR(湖南艾科瑞生物工程有限公司，中國(guó))；RNAiso Plus、SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司，中國(guó))；大鼠三碘甲狀腺原氨酸(TT3)、總甲狀腺激素(TT4)、游離甲狀腺素(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)和促甲狀腺素(TSH)免疫試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司，中國(guó))；其他試劑均為分析純，購(gòu)于中國(guó)天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 BDE 209孕期染毒大鼠模型建立及生物材料采集

(1)動(dòng)物模型建立：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在大連醫(yī)科大學(xué)重大疾病基因工程模式動(dòng)物研究所維護(hù)及喂養(yǎng)。10周齡Wistar雌性大鼠24只，稱取體質(zhì)量后排序，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組(對(duì)照組、低劑量和高劑量組，每組8只)，不同劑量組間母鼠體質(zhì)量差異無(wú)顯著性(P>0.05)。選擇階段合籠法與10周齡Wistar雄鼠按照雌∶雄=2∶1合籠交配，次日清晨檢查陰道涂片，發(fā)現(xiàn)精子則記為妊娠第0天(GD0)。避光稱取一定量BDE 209粉末溶于花生油中，渦旋搖勻。根據(jù)孕鼠體質(zhì)量，按分組劑量染毒如下：對(duì)照組(花生油)、低劑量組(100 mg·kg-1bw)、高劑量組(300 mg·kg-1bw)[15]。染毒采用每天避光灌胃一次，最長(zhǎng)至GD20(仔鼠出生前一天)。所有動(dòng)物均自由進(jìn)食、飲水；室內(nèi)溫度20～25 ℃、濕度40%～70%、光照按亮/暗12 h循環(huán)。

(2)生物樣品采集：在GD15和GD20這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，4%水合氯醛麻醉母鼠，剖開(kāi)子宮，小心吸取羊水(作為一個(gè)獨(dú)立樣本)至無(wú)菌管并放入液氮中速凍，標(biāo)記后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，用于羊水TH水平測(cè)定；記錄每窩胚胎大鼠體質(zhì)量；GD20胎鼠每窩斷頭后取血(作為一個(gè)獨(dú)立樣本)，室溫靜置10 min后，2 500 r·min-1離心20 min，吸取上層血清，標(biāo)記后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，用于GD20胎鼠血清中TH水平測(cè)定；采集GD15和GD20胎腦組織，用于檢測(cè)胎腦下丘腦-垂體-甲狀腺素軸(hypothalamic-pituitary-thyroxine axis，HPT軸)功能變化；采集GD20胎腦，浸泡于4%多聚甲醛溶液中24 h，隔日換液，用作孕后期胎腦形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

1.2.2 RT-qPCR

本研究通過(guò)檢測(cè)不同胚胎發(fā)育時(shí)期胚胎大鼠腦組織促甲狀腺激素釋放激素(thyrotropin-releasing hormone, Trh)的表達(dá)，觀察孕期BDE 209暴露對(duì)胎腦HPT軸功能的影響，初步分析其在胎鼠循環(huán)和干擾胎腦組織TH中的作用。

(1)總RNA提取及質(zhì)量控制：取出適量-80 ℃凍存組織，用500～1 000 mg·mL-1Trizol將稱量質(zhì)量后的組織置于4 mL無(wú)菌管中，高速研磨20 s。冰上靜置10 min后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，4 ℃、2 500 r·min-1離心5 min。吸取上清至新的1.5 mL離心管中置于冰上。按照RNAiso Plus試劑盒(南京諾維贊公司，中國(guó))說(shuō)明書(shū)，提取總RNA，通過(guò)紫外吸收值A(chǔ)260/280進(jìn)行質(zhì)量控制。A260/280比值在1.8～2.0之間時(shí)，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(2)RNA反轉(zhuǎn)錄：按照Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)常規(guī)操作，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ ∞。

(3)引物設(shè)計(jì)和合成：大鼠來(lái)源GAPDH和Trh引物系委托大連萬(wàn)澤貿(mào)易有限公司設(shè)計(jì)合成。名稱和序列詳見(jiàn)表1。

(4)PCR反應(yīng)：根據(jù)SYBR qPCR Master Mix試劑盒配制20 μL體系上機(jī)反應(yīng)。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。

(5)結(jié)果分析：應(yīng)用TP800 v4.01軟件，以GAPDH表達(dá)量對(duì)mRNA表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.2.3 ELISA

從-80 ℃冰箱中取出組織樣品，2 500 r·min-1離心20 min，上清轉(zhuǎn)移至新1.5 mL離心管中，組別中上樣量不足時(shí)吸取各組最低量后加入同等量三蒸水補(bǔ)齊。由4 ℃冰箱中取出試劑盒，置于室溫平衡30 min以上。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及各孔OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將各樣品孔OD值帶入公式，計(jì)算樣品濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 大鼠mRNA表達(dá)引物序列Table 1 Primer sequences for mRNA expression in fetal rats

1.2.4 HE染色

將固定好的GD20胎鼠腦組織取出后放入包埋盒中，按照分組情況以序號(hào)標(biāo)記。從低濃度酒精(40%)開(kāi)始向高濃度酒精依次脫水，再將其依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中透明。將已透明的組織塊用鑷子小心夾取，大腦皮層朝上置于已溶化好的石蠟中，放入冷卻箱中冷卻。待石蠟完全凝固取下組織蠟塊，固定在切片機(jī)載物臺(tái)上，切片的厚度為3 μm。將切好的蠟片置于50 ℃溫水中，待蠟片平展后，用防脫載玻片撈出，70 ℃烤箱烤片，干燥后可置于37 ℃恒溫箱備用。染色時(shí)經(jīng)二甲苯逐級(jí)脫蠟過(guò)酒精后清洗，經(jīng)蘇木素、伊紅染色，逐級(jí)酒精脫水，用中性樹(shù)膠封片，干燥后蓋片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均來(lái)源于至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，所有結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS 13.0，統(tǒng)計(jì)分析方法采用方差分析(ANOVO)檢驗(yàn)。按檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 孕期BDE 209暴露對(duì)胚胎大鼠生長(zhǎng)發(fā)育狀況的影響

大鼠2月齡時(shí)性成熟，妊娠期(GD)通常為19～22 d。GD15為胎鼠甲狀腺功能完全建立之前，GD20時(shí)胎鼠甲狀腺功能基本達(dá)到高峰[21-22]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取GD15和GD20這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)生物樣品采集和檢測(cè)。由表2可知，GD15低劑量組胎鼠體質(zhì)量與對(duì)照組差異不明顯，高劑量組胎鼠體質(zhì)量與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.01)；GD20低劑量組胎鼠體質(zhì)量相比對(duì)照組亦有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高劑量組體質(zhì)量則顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

2.2 孕期BDE 209暴露對(duì)羊水和胎鼠血清TH水平的影響

在GD15和GD20采集孕鼠子宮羊水，并在GD20剝離胎鼠，斷頭取血。GD15仔鼠胚胎由于個(gè)體較小，無(wú)法采集其血液，故僅收集GD20胎鼠外周血液。對(duì)羊水和外周血TH的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括TT3、FT3、TT4、FT4和TSH。

2.2.1 孕期BDE 209暴露對(duì)GD15羊水TH的影響

如表3所示，GD15羊水中TT3含量有升高趨勢(shì)，尤其低劑量組，但未見(jiàn)顯著性差異；而FT3含量在低、高劑量組均有下降趨勢(shì)，但與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。TT4和FT4含量在低、高劑量組均有升高趨勢(shì)，尤其FT4差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。TSH在高劑量組水平上升，與對(duì)照組之間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2.2 孕期BDE 209暴露對(duì)GD20羊水和胚胎大鼠外周血TH的影響

GD20羊水TH水平由表4所示，BDE 209低劑量組TT3水平有增高趨勢(shì)，但未見(jiàn)顯著差異；FT3水平在BDE 209低、高劑量組均出現(xiàn)降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TT4水平則與GD15時(shí)相反，與對(duì)照組相比略有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；FT4水平與GD15的表現(xiàn)一致，有上升趨勢(shì)，在高劑量組有明顯差異(P<0.05)；而TSH水平明顯增高，在低劑量組和高劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

GD20胚胎大鼠外周血TH水平如表5所示，TT3水平在低劑量組雖然有所降低，但與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異；FT3水平與同時(shí)期羊水中的變化趨勢(shì)一致(表4)，具有下降趨勢(shì)，尤其在低劑量時(shí)，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TT4和FT4具有下降趨勢(shì)，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TSH水平逐漸升高，高劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這與同時(shí)期羊水中的情況類似。

表2 大鼠孕期BDE 209暴露對(duì)胚胎大鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on the body mass of fetal rats

表3 大鼠孕期BDE 209暴露對(duì)GD15羊水甲狀腺激素(TH)的影響Table 3 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on the amniotic fluid thyroid hormone (TH) level on GD15

表4 大鼠孕期BDE 209暴露對(duì)GD20羊水TH的影響Table 4 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on the amniotic fluid TH level on GD20

2.3 孕期BDE 209暴露對(duì)胚胎大鼠腦組織Trh基因表達(dá)的影響

通過(guò)觀察孕期BDE 209暴露對(duì)不同胚胎發(fā)育時(shí)期胎腦Trh表達(dá)的影響，初步分析HPT軸功能損傷在PBDEs致胎鼠循環(huán)和胎腦組織TH干擾的可能作用。

GD15和GD20胎腦Trh基因表達(dá)如圖1所示，正常胎腦(對(duì)照組)在孕期不同時(shí)期Trh基因表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定(表6)；BDE 209孕期暴露可顯著抑制胎腦Trh表達(dá)，且隨著孕期進(jìn)程，對(duì)Trh抑制程度加深。低劑量組TrhmRNA水平在GD15時(shí)是對(duì)照組的68.85%(P<0.05)，在GD20時(shí)是對(duì)照組的57.53%(P<0.05)；高劑量組TrhmRNA水平在GD15時(shí)是對(duì)照組的79.44%，在GD20時(shí)是對(duì)照組的62.17%(P<0.05)。這提示，孕期BDE 209持續(xù)暴露對(duì)Trh具有進(jìn)行性抑制作用(表7)。

2.4 孕期BDE 209暴露對(duì)胚胎大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響

由于GD15胎鼠胎腦較小且含水量較多，受HE染色時(shí)脫水等可操作條件的限制，檢測(cè)GD15胎鼠腦組織發(fā)育形態(tài)學(xué)改變較為困難。因此，只選擇GD20胎腦觀察。如圖2所示，對(duì)照組胎腦細(xì)胞較為完整，細(xì)胞形態(tài)正常，未見(jiàn)明顯病理性改變。低劑量組胎腦與對(duì)照組相比也未見(jiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變。高劑量組胎腦與對(duì)照組相比，出現(xiàn)局域性腦細(xì)胞排列明顯稀疏、核固縮和細(xì)胞間隙增大現(xiàn)象?？梢?jiàn)，孕期BDE 209可引起胎鼠腦組織病理?yè)p傷，使孕末期胎鼠腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細(xì)胞數(shù)量減少，腦組織出現(xiàn)萎縮，可能影響后代學(xué)習(xí)和記憶能力。

圖1 大鼠孕期BDE 209暴露對(duì)GD15和GD20 大鼠胎腦Trh mRNA表達(dá)的影響注：*P<0.05，與對(duì)照組相比。Fig. 1 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on the Trh mRNA expression in fetal brain on GD15 and GD20Note: *means P<0.05 compared with the control.

表5 大鼠孕期BDE 209暴露對(duì)GD20胚胎大鼠血清TH的影響Table 5 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on the serum TH level of fetal rats on GD20

表6 對(duì)照組胚胎大鼠腦組織Trh基因表達(dá)Table 6 Trh gene expression in the brain of control fetal rats

表7 大鼠孕期BDE 209暴露對(duì)胚胎大鼠腦組織Trh基因表達(dá)的影響Table 7 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on Trh gene expression in the fetal rat brain

圖2 大鼠孕期BDE 209暴露對(duì)GD20胎腦發(fā)育形態(tài)學(xué)影響注：C對(duì)照組；L低劑量組(100 mg·kg-1 bw)；H高劑量組 (300 mg·kg-1 bw)；放大倍數(shù)100倍和200倍。Fig. 2 Representative morphological changes induced by BDE 209 exposure during pregnancy on GD20 fetal rat brainsNote: C represents control; L represents low dose group (100 mg·kg-1 bw); H represents high dose group (300 mg·kg-1 bw); magnifications is 100 or 200.

3 討論(Discussion)

TH可調(diào)節(jié)大腦皮層海馬區(qū)的膽堿能和多巴胺能系統(tǒng)的發(fā)育，對(duì)于促進(jìn)機(jī)體正常新陳代謝，維持機(jī)體骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。而在孕早期(即胎腦發(fā)生發(fā)育關(guān)鍵期)，TH對(duì)胎腦發(fā)育和成熟起著關(guān)鍵作用。大量研究顯示，PBDEs具有TH干擾毒性效應(yīng)，如損傷甲狀腺形態(tài)、改變TH水平、高親和力結(jié)合TH轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白拮抗TH等[23-24]。而甲狀腺功能的微小改變就可能對(duì)人體健康，特別是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生影響。

目前有關(guān)孕期PBDEs暴露對(duì)胎鼠TH干擾的評(píng)價(jià)，多是通過(guò)對(duì)出生子鼠循環(huán)TH水平的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行間接/回顧性推測(cè)[17,25]，直接研究尚未見(jiàn)報(bào)道。有研究認(rèn)為，羊水TH水平與臍血激素水平有一定的相關(guān)性，反映了胎兒TH的代謝，而與孕婦血激素濃度相關(guān)性不強(qiáng)。因此，羊水TH可能是反映胎兒甲狀腺功能的較好指標(biāo)[26]。在本實(shí)驗(yàn)中，孕早期(GD15)BDE 209暴露可導(dǎo)致羊水FT4顯著升高，并有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，同時(shí)TT4水平也有升高的趨勢(shì)，盡管與對(duì)照相比沒(méi)有顯著差異。這提示，BDE 209暴露可導(dǎo)致孕早期胚胎處于高TH狀態(tài)(類T4甲亢)。而在孕末期(GD20)，羊水FT4水平回降至與對(duì)照相比差別不大，雖然在高劑量組仍有顯著升高；FT3水平在低、高劑量組均出現(xiàn)顯著降低；TSH水平顯著升高，這表明胎腦垂體對(duì)胚胎循環(huán)TH水平變化的抵抗。GD20胎鼠血清循環(huán)TH水平總體變化趨勢(shì)與同時(shí)期羊水TH動(dòng)態(tài)變化基本一致，TSH水平升高，孕末期羊水FT3水平明顯降低，且在GD20胎鼠血清中也顯著下降，可能由于BDE 209損傷中樞HPT軸，導(dǎo)致胎鼠甲狀腺T3生成不足所致。結(jié)果提示，孕末期胎鼠可能處于中樞性甲狀腺功能減退狀態(tài)。文獻(xiàn)報(bào)道，孕期BDE 209暴露(300 mg·kg-1bw)可導(dǎo)致出生子鼠出生后20 d(PND20)血清T3水平下降，TSH水平升高[27]，這與本研究結(jié)果基本一致。孕早期胚胎在TH來(lái)源和調(diào)節(jié)機(jī)制上具有特殊性。在來(lái)源方面，孕(早)期胚胎甲狀腺功能尚未建立完全，其主要依賴于母體循環(huán)TH；在調(diào)節(jié)機(jī)制方面，來(lái)自母體的高濃度TH需要胎盤脫碘酶3(Dio3)調(diào)節(jié)，將細(xì)胞外T3和T4滅活，以保證胎兒TH處于最佳生理水平[28]。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，PBDEs可誘導(dǎo)小鼠胎盤Dio3表達(dá)下調(diào)，并可能與其發(fā)育神經(jīng)毒性效應(yīng)有關(guān)[11]。結(jié)合PBDEs在胎盤蓄積程度，我們推測(cè)，PBDEs可能通過(guò)抑制胎盤Dio3活性，干擾胚胎TH。而TH對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程和結(jié)局起關(guān)鍵作用，無(wú)論甲亢或甲減均可導(dǎo)致胚胎發(fā)育損害。在本實(shí)驗(yàn)中，BDE 209孕期高劑量暴露可導(dǎo)致GD15胎鼠體質(zhì)量升高，而GD20胎鼠體質(zhì)量降低，這可能因?yàn)锽DE 209對(duì)孕早、晚期胚胎TH的干擾表型存在差異，同時(shí)可能也與BDE 209或其代謝產(chǎn)物在胎鼠體內(nèi)持續(xù)蓄積有關(guān)，導(dǎo)致不同發(fā)育窗口對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育影響的結(jié)局不同。

胎兒下丘腦在其自身HPT軸發(fā)育、成熟的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，且在孕晚期，胎腦HPT軸發(fā)育基本成熟，對(duì)胚胎循環(huán)和胎腦TH調(diào)節(jié)也有重要作用[29]。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)不同時(shí)期胎腦促甲狀腺激素釋放激素(Trh)的表達(dá)，觀察孕期BDE 209暴露對(duì)胎腦HPT軸功能的影響，分析其在胎鼠循環(huán)和胎腦組織TH干擾中的作用。研究結(jié)果顯示，孕早期BDE 209暴露導(dǎo)致胎腦(GD15)Trh的表達(dá)顯著下調(diào)，表明在孕早期胎鼠下丘腦功能已受損。在孕末期，胎鼠本身HPT軸的功能基本成熟，TH主要來(lái)自其自身甲狀腺的分泌，循環(huán)TH水平可能取決于BDE209對(duì)中樞HPT軸功能的損傷程度。如果HPT軸功能失調(diào)，可能影響下丘腦Trh的生成和釋放，抑制垂體對(duì)Trh的反應(yīng)或TSH活性成熟過(guò)程，導(dǎo)致T3、T4生成不足而在血循環(huán)的水平下降，而TSH水平可能出現(xiàn)下降、不變或上升，這與Trh或Trh受體基因敲除小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[30]，也與上述孕末期羊水和胎鼠血清中的TH干擾的表型基本一致。

除了前述一系列功能指標(biāo)，BDE 209對(duì)胎鼠腦組織形態(tài)學(xué)的改變，是評(píng)價(jià)其毒性效應(yīng)不可或缺的指標(biāo)。目前，針對(duì)PBDEs的TH干擾及發(fā)育神經(jīng)毒性研究多數(shù)通過(guò)對(duì)出生子代神經(jīng)行為、認(rèn)知能力和學(xué)習(xí)記憶等損傷效應(yīng)進(jìn)行探討，涉及體內(nèi)胎腦的病理變化和分子通路的研究較少。本研究通過(guò)觀察GD20胎鼠胎腦形態(tài)學(xué)的改變，發(fā)現(xiàn)孕期BDE 209暴露可引起孕后期胎鼠腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細(xì)胞數(shù)量減少，腦組織出現(xiàn)萎縮，從而影響出生子代神經(jīng)行為、學(xué)習(xí)和記憶能力。日后，可對(duì)胎腦各功能區(qū)域細(xì)致分區(qū)，并檢測(cè)胚胎腦組織TH信號(hào)傳導(dǎo)分子表達(dá)，進(jìn)一步探討孕期BDE 209暴露對(duì)于后代的毒性效應(yīng)。

目前對(duì)于PBDEs毒性作用研究還較為獨(dú)立，而神經(jīng)發(fā)育缺陷的重要機(jī)制之一即為TH水平不平衡，這提示，PBDEs誘導(dǎo)的TH干擾與發(fā)育神經(jīng)毒性之間可能存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)。孕期是生命的初始，與生命質(zhì)量關(guān)系密切。因此，深入研究PBDEs毒性效應(yīng)的內(nèi)在聯(lián)系，找出特異性作用靶點(diǎn)即生物標(biāo)志物，對(duì)防治PBDEs造成的早期健康損害具有深遠(yuǎn)意義，是目前急需重視的研究方向。