印月，鎮(zhèn)華君,3#，修光利,3*

1. 上海市環(huán)境保護(hù)化學(xué)污染物環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，上海 200237 2. 國家環(huán)境保護(hù)化工過程環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，上海 200237 3. 上海污染控制與生態(tài)安全研究院，上海 200092

環(huán)境水體中存在著大量濃度低，但具有潛在生態(tài)和健康風(fēng)險(xiǎn)的污染物，例如環(huán)境激素類物質(zhì)、醫(yī)藥品和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品類物質(zhì)、工業(yè)添加劑、農(nóng)藥以及抗生素等[1-5]。如何有效地評(píng)價(jià)環(huán)境水體的綜合毒性效應(yīng)是環(huán)境科學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)問題。傳統(tǒng)的針對(duì)特定物質(zhì)的化學(xué)分析法能監(jiān)測(cè)所關(guān)注污染物的濃度水平，但不能反映復(fù)合污染暴露下的真實(shí)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[6]。而針對(duì)污染物毒性效應(yīng)的生物監(jiān)測(cè)方法則成為評(píng)價(jià)復(fù)合污染毒性效應(yīng)的主流思路之一。近年來，毒理基因組學(xué)技術(shù)(轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等)因能夠綜合評(píng)價(jià)污染物暴露后對(duì)多生物學(xué)通路造成的影響，成為評(píng)價(jià)單一污染物或復(fù)雜組分樣品毒性效應(yīng)的重要方法[7-9]。

代謝組處于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)的下游，聚焦于機(jī)體內(nèi)所有小分子代謝物(分子量<1.5 kDa的多肽、氨基酸及其衍生物、胺類物質(zhì)、脂類物質(zhì)等)的豐度變化。相比于其他組學(xué)手段，代謝組學(xué)與生物表型特征之間的聯(lián)系更為緊密，是機(jī)體對(duì)外界變化產(chǎn)生的最終應(yīng)答[10-11]。脂質(zhì)作為機(jī)體內(nèi)源性代謝物的重要組成部分，如作為細(xì)胞膜骨架組分、機(jī)體能量來源和信號(hào)分子等，參與著細(xì)胞的生長、增殖和凋亡[12]。因此，脂質(zhì)代謝紊亂被視為細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變和功能受損的重要標(biāo)志。研究表明，很多典型的環(huán)境污染物，例如多氯聯(lián)苯[13]、全氟類化合物[14]、有機(jī)磷阻燃劑[15]、雙酚A[16]和重金屬[17]等，都能影響生物體的脂代謝平衡。此外，有研究顯示，在復(fù)合污染暴露中，共暴露污染物之間產(chǎn)生的協(xié)同、加合或拮抗作用也能在暴露對(duì)象的脂質(zhì)組成分析結(jié)果中得到反映[18]。此前，Zhen等[19]采用基于斑馬魚肝細(xì)胞體外暴露實(shí)驗(yàn)的代謝組學(xué)方法，研究了美國某河流上游污水處理廠的污水排放對(duì)下游自來水源水水質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)部分脂肪酸類物質(zhì)能靈敏地指示河流中存在未知來源的污染物排放，揭示了基于細(xì)胞脂類代謝物的毒性測(cè)試方法在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的潛在應(yīng)用前景。

鑒于此，本研究以人體肝癌細(xì)胞(HepG2)作為暴露實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，利用基于脂質(zhì)組學(xué)的毒性效應(yīng)測(cè)試手段，對(duì)實(shí)際環(huán)境水體(上海市黃浦江)的污染狀況進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)。研究所采用的HepG2細(xì)胞的生物學(xué)功能與正常肝細(xì)胞極為相似，是一種研究肝臟脂質(zhì)代謝的代表性細(xì)胞模型[20-21]。本研究旨在評(píng)價(jià)基于細(xì)胞脂質(zhì)組學(xué)的環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測(cè)方法的有效性，同時(shí)研究結(jié)果可為上海市生態(tài)環(huán)境和水質(zhì)安全管理部門提供重要的參考信息。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 化學(xué)試劑

高糖液體培養(yǎng)液(DMEM，含1%雙抗：青霉素和鏈霉素)、胎牛血清蛋白(FBS)、磷酸緩沖液(PBS)均購自北京賽澳美細(xì)胞技術(shù)有限公司(中國)；DMEM粉狀培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA均購自于美國Sigma-Aldrich公司；緩沖液Hepes購自北京索萊寶科技有限公司(中國)；碳酸氫鈉(NaHCO3)，純度≥99.5%，購自上海國藥集團(tuán)(中國)；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(中國)；SPLASH?LipidomixTM脂類標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Avanti Polar Lipids公司，包括14種常見脂類物質(zhì)的同位素內(nèi)標(biāo)磷脂酰膽堿d7-PC(15:0/18:1) (純度>99%)、磷脂酰乙醇胺d7-PE(15:0/18:1) (純度>99%)、磷脂酰絲氨酸d7-PS(15:0/18:1) (純度>99%)、磷脂酰甘油d7-PG(15:0/18:1) (純度>99%)、磷脂酰肌醇d7-PI(15:0/18:1) (純度>99%)、磷脂酰膽堿烷基醚d9-PC-e(18:1/18:1) (純度>99%)、磷脂酰乙醇胺烷基醚d9-PE-e(18:1/18:1) (純度>99%)、溶血性磷脂酰膽堿d7-LPC(18:1) (純度>99%)、溶血性磷脂酰乙醇胺d7-LPE(18:1) (純度>99%)、甘油二酯d7-DG(15:0/18:1) (純度>99%)、甘油三酯d7-TG(15:0/18:1/15:0) (純度>99%)、鞘磷脂d9-SM(d18:1/18:1) (純度>99%)、神經(jīng)酰胺Cer(d18:1/12:0) (純度>99%)、膽固醇d7-Cholesterol (純度>99%)；LC-MS級(jí)溶劑和添加劑，包括甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)、異丙醇(IPA)和甲酸銨(ammonium formate)均購自美國Fisher Scientific公司；實(shí)驗(yàn)用水均采用Milli-Q超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)并經(jīng)過0.1 μm的滅菌濾膜處理。

1.2 水樣采集

2019年8月2日(汛期，夏季)于黃浦江共采集27個(gè)水樣，各采樣點(diǎn)地理位置如圖1所示。黃浦江干流及部分支流(S2、S4、S12和S13)共布設(shè)15個(gè)采樣點(diǎn)。其中，S1～S5之間的上游河段位于上海郊區(qū)，周邊主要以農(nóng)業(yè)活動(dòng)為主，同時(shí)也作為上海市飲用水水源地之一。黃浦江中游(S6～S10)和下游采樣點(diǎn)(S11、S14和S15)則分布于人口密集的城市地區(qū)。目前，上海已有42座城市污水處理廠(WWTPs)投入使用，日處理能力834.3萬m3。此前的研究表明，WWTPs的出水是環(huán)境水體的一個(gè)主要污染源[22]。因此，為了更好地評(píng)價(jià)黃浦江整體的水質(zhì)情況，考慮到WWTPs出水的影響，剩余12個(gè)支流采樣點(diǎn)(1-1/2、2-1/2、4-1/2、5-1/2和6-1/2)選取在中心城區(qū)6個(gè)WWTPs出水口的上下游約0.5～1 km范圍之內(nèi)。所有采集到的水樣儲(chǔ)存在500 mL經(jīng)預(yù)清洗的棕色玻璃容器中，在低溫避光條件下運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室，置于-20 ℃保存直至實(shí)驗(yàn)分析。

1.3 水樣暴露

HepG2細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫)接種于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并定期進(jìn)行換液或傳代。由于采樣點(diǎn)數(shù)量較多，所采集的27個(gè)水樣的暴露實(shí)驗(yàn)分4次(A/B/C/D)完成。以第一次暴露實(shí)驗(yàn)A為例，將3個(gè)T182培養(yǎng)瓶中收集的HepG2細(xì)胞分配到63個(gè)6 cm的培養(yǎng)皿中(7個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)的暴露實(shí)驗(yàn)包含7個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本；14個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照(CON)樣本)，預(yù)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁完全。隨后，將經(jīng)過0.1 μm濾膜過濾的水樣與4倍濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)液以3∶1的體積比混合調(diào)配成細(xì)胞暴露培養(yǎng)液，并對(duì)預(yù)培養(yǎng)中的培養(yǎng)溶液進(jìn)行置換，開始48 h的HepG2細(xì)胞暴露培養(yǎng)。48 h后，采用基于Teng等[23]建立的方法進(jìn)行細(xì)胞猝滅和脂質(zhì)提取，提取得到的脂質(zhì)組分使用真空濃縮儀(Concentrator plus，美國Eppendorf公司)進(jìn)行濃縮處理，隨后儲(chǔ)存于-80 ℃直至分析。

圖1 黃浦江采樣點(diǎn)圖Fig. 1 Sampling sites of Huangpu River

1.4 脂類鑒定

將真空濃縮得到的樣品重新溶解于200 μL含有脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)的混合溶劑(V(MeOH)∶V(IPA)∶V(H2O)=65∶30∶5)中，中速渦旋30 s后置于低溫冰盒保存。利用高效液相色譜-四極桿軌道阱質(zhì)譜儀(Q-Exactive plus，美國Thermo公司)對(duì)脂類組成進(jìn)行分析檢測(cè)，本研究中脂質(zhì)鑒定采用MS Dial 2.0和Lipid Match這2種軟件包。

液相色譜條件：使用CSH C18色譜柱(Waters，1.7 μm填料內(nèi)徑，2.1 mm×100 mm)進(jìn)行分離，柱溫65 ℃，進(jìn)樣體積2 μL，流速0.5 mL·min-1。流動(dòng)相組成為水相A(V(ACN)∶V(H2O)=60∶40)和有機(jī)相B(V(ACN)∶V(IPA)=10∶90)，其中，A相、B相都含有10 mmol·L-1甲酸銨。洗脫梯度條件為：0 min，30% B；1.0 min，30% B；10.0 min，85% B；10.1 min，99% B；12.0 min，99% B；12.1 min，30% B；15.0 min，30% B。

質(zhì)譜條件：利用加熱電噴霧電離源(HESI)在Full Scan模式下進(jìn)行正負(fù)離子交替信號(hào)采集。質(zhì)譜掃描范圍m/z=200～1 200，正負(fù)離子噴霧電壓為3.2 kV，毛細(xì)管溫度350 ℃，汽化溫度300 ℃，載氣流量和輔助氣流量分別為35 Arb和10 Arb。進(jìn)樣分析過程中使用質(zhì)量控制樣品(QC)指示儀器的穩(wěn)定性，QC由所有樣品等量混合制成。在樣品檢測(cè)的開始、結(jié)束以及每間隔10個(gè)樣品時(shí)進(jìn)行一次QC分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

采用基于R語言的內(nèi)部開發(fā)程序?qū)Σ杉馁|(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。主要步驟包括使用ProteoWizard對(duì)原始數(shù)據(jù)文件進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，利用XCMS軟件包對(duì)采集信號(hào)進(jìn)行解卷積和保留時(shí)間校正處理，采用CAMERA軟件包對(duì)同位素和加合離子信號(hào)進(jìn)行注釋。在至少80%的樣品中檢測(cè)到的脂質(zhì)才被保留，而在所有QC樣品中信號(hào)強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)>30%的脂質(zhì)則被排除在最終數(shù)據(jù)列表之外。最后，對(duì)樣品中所有脂質(zhì)分子信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理。

本文所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±SE)的形式表示，采用SIMCA14.1進(jìn)行數(shù)據(jù)的多變量分析，使用SPSS 24.0進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)分析，利用單向方差分析(one way ANOVA)和Tukey事后檢驗(yàn)法檢驗(yàn)主成分分析結(jié)果中的組間差異，采用學(xué)生t檢驗(yàn)法比較實(shí)驗(yàn)組與CON之間的脂質(zhì)豐度差異(進(jìn)行假陽性FDR校正，q<0.1)。本研究中的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果將P<0.05定義為顯著性差異。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 HepG2細(xì)胞脂類組成分析

A/B/C/D這4次暴露實(shí)驗(yàn)的最終脂質(zhì)組數(shù)據(jù)結(jié)果分別包含998、1 089、810和810個(gè)脂質(zhì)信號(hào)，其中，分別相對(duì)應(yīng)地鑒定出了344、356、322和322種脂質(zhì)。按照國際脂類分類和命名委員會(huì)發(fā)布的分類標(biāo)準(zhǔn)，上述鑒定出來的脂質(zhì)涵蓋了八大脂類中的6類，分別是甘油磷脂類、鞘脂類、甘油酯類、脂肪酸類、固醇脂類和孕烯醇酮脂類。4次暴露實(shí)驗(yàn)中HepG2脂質(zhì)組成(包括亞類)基本一致，在此以A組暴露實(shí)驗(yàn)中的CON為例進(jìn)行說明。如圖2(a)所示，在HepG2細(xì)胞非極性組分提取物中鑒定出：(1)甘油磷脂181種，包括9大亞類PC、PE、PS、PG、PI、LPC、LPE、PC-e和PE-e；(2)鞘脂61種，包括四大亞類SM、Cer、己糖基神經(jīng)酰胺(HexCer)和二己糖基神經(jīng)酰胺(Hex2Cer)；(3)甘油酯98種，包括TG和DG兩個(gè)亞類；(4)脂肪酸2種，均為?；鈮A(CAR)；(5)固醇脂1種，為Cholesterol；(6)孕烯醇酮脂1種，為輔酶Q10(Ubiquinones)。在上述脂類中，甘油脂類是細(xì)胞儲(chǔ)存能量的主要化合物；鞘脂類是細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分之一，影響著細(xì)胞與外界的物質(zhì)與信號(hào)的交換和傳導(dǎo)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和凋亡活動(dòng)的第二信使；而甘油磷脂類主要參與細(xì)胞膜固定、膜內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜蛋白結(jié)合以及底物轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生物代謝過程[24]。

在鑒定出的六大脂類中，甘油磷脂、鞘脂和甘油酯三大脂類的組分眾多，這三大脂類及其分別包含的亞脂類的物質(zhì)的量濃度百分比如圖2(b)所示。甘油磷脂類在HepG2細(xì)胞內(nèi)屬于高豐度脂類，占比超過50%，主要以PC和PE為主，其濃度占比分別為30.11%和19.88%；甘油脂類的豐度次之(約35%)，其中TG和DG的濃度占比分別是31.44%和4.01%；鞘脂類的豐度約10%，主要亞類為SM，濃度占比約為9.52%?？v觀HepG2細(xì)胞主要脂質(zhì)的分類及組成，可以發(fā)現(xiàn)TG在所有亞脂類中豐度最高，而TG的蓄積是非酒精性肝炎(NAFLD)發(fā)生的一個(gè)標(biāo)志性特征[25]，因此研究結(jié)果進(jìn)一步佐證了HepG2細(xì)胞是研究NAFLD的良好細(xì)胞模型。

2.2 HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝的總體變化

暴露48 h后，各個(gè)采樣點(diǎn)的HepG2細(xì)胞存活率分布在95%～102%范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組與CON之間以及不同實(shí)驗(yàn)組之間的細(xì)胞存活率無顯著差異(P>0.05)。主成分分析(PCA)是考察多個(gè)變量間相關(guān)性的一種多元統(tǒng)計(jì)方法，能夠基于暴露后細(xì)胞脂類豐度信息，表征實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于CON的脂質(zhì)組成變化。4次暴露實(shí)驗(yàn)的主成分分析如圖3所示，圖3中每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表一個(gè)采樣點(diǎn)，根據(jù)不同采樣點(diǎn)沿第一主分(PC1)或第二主分(PC2)方向上與CON的分離程度，并結(jié)合方差分析(ANVOA)結(jié)果，來評(píng)估各組之間的脂代謝差異?？梢钥闯龃蟛糠謱?shí)驗(yàn)組和CON在第一和/或第二主成分上有明顯的區(qū)分。

圖2 A組暴露實(shí)驗(yàn)中HepG2細(xì)胞對(duì)照組(CON)的脂類組成注：PC表示磷脂酰膽堿，PE表示磷脂酰乙醇胺，PS表示磷脂酰絲氨酸，PG表示磷脂酰甘油， PI表示磷脂酰肌醇，LPC表示溶血性磷脂酰膽堿，LPE表示溶血性磷脂酰乙醇胺，PC-e表示磷脂酰膽堿烷基醚，PE-e表示磷脂酰乙醇胺烷基醚， Cer表示神經(jīng)酰胺，HexCer表示己糖基神經(jīng)酰胺，Hex2Cer表示二己糖基神經(jīng)酰胺，SM表示鞘磷脂，DG表示甘油二酯，TG表示甘油三酯， CAR表示?；鈮A，Cholesterol表示膽固醇，Ubiquinones表示輔酶Q10。Fig. 2 The composition of lipids in HepG2 cells from control group (CON) in experiment ANote: PC means phosphatidylcholine; PE means phosphatidylethanolamine; PS means phosphatidylserine; PG means phosphatidylglycerol; PI means phosphatidylinositol; LPC means lyso-phosphatidylcholine; LPE means lyso-phosphatidylethanolamine; PC-e means phosphatidylcholine with ether- or vinyl ether- linkages; PE-e means phosphatidylethanolamine with ether- or vinyl ether- linkages; Cer means ceramide; HexCer means hexaglycosylceramide; Hex2Cer means dihexaglycosylceramide; SM means sphingomyelin; DG means diacylglycerol; TG means triacylglycerol; CAR means acyl carnitine; ubiquinones means Coenzyme Q10.

由圖3可知，黃浦江干流11個(gè)采樣點(diǎn)與CON的區(qū)分程度與采樣點(diǎn)所屬河段緊密相關(guān)。位于上游的S1、S3、S5以及中游的S6、S7與CON在PC1和PC2坐標(biāo)軸上均無顯著差異(圖3(a))，僅S2與CON在PC1上呈現(xiàn)顯著差異(P<0.001)；位于中游的S8和S9與CON在PCA(圖3(b))上差異顯著(PC1：P<0.05，PC2：P<0.001)，而S10則與CON在PC1和PC2上無顯著差異(圖3(c))；位于下游的S11、S14和S15(圖3(b))，僅S15與CON在PC2上呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。綜合來看，對(duì)HepG2脂質(zhì)代謝影響較大的黃浦江干流水樣主要來自中游河段，上游和下游河段對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)代謝影響相對(duì)較弱。位于黃浦江支流的16個(gè)采樣點(diǎn)，除去1-2(圖3(b))和4-2(圖3(d))，剩余14個(gè)支流采樣點(diǎn)，其暴露后的脂質(zhì)代謝變化與CON相比差異顯著，表明大多數(shù)污染主要發(fā)生在位于中心城區(qū)的黃浦江支流，這一結(jié)論與黃浦江某些單一污染物(藥物和個(gè)人護(hù)理品、全氟化合物)的調(diào)查結(jié)果一致[26-27]。

本研究對(duì)暴露后HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝的整體變化進(jìn)行了定量評(píng)估。具體做法是比較各個(gè)實(shí)驗(yàn)組與CON之間所有脂質(zhì)組分的相對(duì)豐度，將具有顯著性差異的豐度組分進(jìn)行絕對(duì)值的加和處理，最終得到一個(gè)表征細(xì)胞脂類代謝物受影響程度的數(shù)值，可更為直觀地比較每個(gè)采樣點(diǎn)暴露后脂質(zhì)變化的整體情況。如圖4所示，黃浦江中游的脂代謝受影響程度(0.01%～7.07%，均值3.40%)要高于上游(0.01%～6.67%，均值1.65%)和下游(0.03%～1.27%，均值0.78%)；支流水樣的脂代謝受影響程度(0.01%～9.15%，均值5.20%)要高于干流水樣(0.01%～7.07%，均值1.80%)，此結(jié)果與PCA分析結(jié)果一致。另外，位于各個(gè)WWTP上下游的支流點(diǎn)(1-1/2、2-1/2、3-1/2、4-1/2、5-1/2、6-1/2)，其脂質(zhì)受影響程度無明顯差異(成對(duì)t檢驗(yàn)，P>0.05)。

圖3 27個(gè)采樣點(diǎn)細(xì)胞脂質(zhì)組分的主成分分析得分圖Fig. 3 Two-component score plots of lipid composition in cell extracts from 27 sampling sites

圖4 不同水樣對(duì)HepG2細(xì)胞脂代謝的影響程度Fig. 4 The overall impact of samples from different sites on lipidome of HepG2 cells

造成干流和支流之間脂質(zhì)代謝變化的主要原因可能是黃浦江自身的水力條件。黃浦江干流河道寬闊，河水流速較快，污染物的有效停留時(shí)間相較于支流較短。同時(shí)，黃浦江夏季平均水位約為4.48 m，較高的水位和較快的流速會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的稀釋效應(yīng)，有利于污染物的擴(kuò)散和稀釋，類似的結(jié)論在Liu等[28]研究中也有報(bào)道。但S8和S9位于黃浦江干流，其脂質(zhì)代謝受影響程度分別為7.07%和5.38%，表明了S8與S9所在區(qū)域受到的環(huán)境脅迫壓力更大，污染物排放所造成的影響大于河流自身的稀釋效應(yīng)。因此，研究推測(cè)S8與S9附近可能存在其他重要的污染排放源，多涉及未經(jīng)處理的生活污水和工業(yè)廢水等。隨著河流的流動(dòng)，下游各點(diǎn)的脂質(zhì)代謝受影響程度逐漸減弱，造成此現(xiàn)象的原因可能是黃浦江下游無明顯的污染排放源。值得注意的是，S15位于黃浦江和長江交匯處，屬于典型的潮汐河口，且伴隨著大量往返的船只，水中沉積物會(huì)反復(fù)經(jīng)歷懸浮(S15濁度：126 NTU)，S15和CON之間的脂質(zhì)代謝差異可能是長江中的污染物回流所致。另外，本研究也嘗試探索了WWTPs對(duì)于支流河道污染程度的貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)WWTPs的上下游并沒有顯著差異。特別是在某些支流河道，WWTPs上游水樣對(duì)HepG2脂代謝受影響程度要明顯高于下游水樣。而且，沒有接納WWTPs出水的部分支流河道(S12、S13)，其水樣對(duì)HepG2脂代謝影響程度也維持在較高水平。因此，本研究結(jié)果表明，WWTPs出水不是造成黃埔江支流水質(zhì)惡化的主要污染源，具體污染成因有待進(jìn)一步研究。

黃浦江上游水源地供應(yīng)上海市約30%的飲用水，其水質(zhì)狀況直接關(guān)系到上海市及周邊地區(qū)的人群健康。本研究發(fā)現(xiàn)，S2水樣對(duì)HepG2脂代謝的影響程度(6.70%)明顯高于黃浦江其他上游點(diǎn)，推測(cè)S2點(diǎn)附近可能存在未知的污染源，而農(nóng)業(yè)活動(dòng)可能是造成這種現(xiàn)象的主要原因。黃浦江上游有集約化養(yǎng)殖業(yè)，每年生產(chǎn)近千萬噸的畜禽糞便。Jiang等[29]評(píng)估，每年約有20%畜禽糞便和50%尿液未經(jīng)任何處理就排入了黃浦江，檢出的黃浦江上游夏季的抗生素濃度可達(dá)1 011 ng·L-1。與此同時(shí)，對(duì)此次采集的水樣中典型的藥品和個(gè)人護(hù)理品類污染物進(jìn)行了分析檢測(cè)(未發(fā)表)，但是并未發(fā)現(xiàn)S2與上游其他采樣點(diǎn)的濃度水平存在顯著差異。因此，有必要進(jìn)一步地對(duì)S2水樣中的主要污染物進(jìn)行分析鑒定，并對(duì)該點(diǎn)附近的潛在污染排放源進(jìn)行調(diào)查。

2.3 HepG2細(xì)胞脂類的變化特征

為了進(jìn)一步探討不同水樣暴露后HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)變化特征，本研究將暴露后HepG2細(xì)胞的不同脂類豐度值經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后以熱圖形式呈現(xiàn)，并通過脂類的代謝路徑圖進(jìn)行輔助說明(圖5)。由圖5(a)可知，于河流中游和中心城區(qū)支流采集的水樣導(dǎo)致HepG2細(xì)胞內(nèi)TG水平出現(xiàn)不同程度的上調(diào)。如前所述，TG在肝組織中的積聚是NAFLD等肝臟疾病的標(biāo)志性特征。因此，上述現(xiàn)象表明水樣中的復(fù)合污染物能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)TG的蓄積，可能誘發(fā)產(chǎn)生NAFLD的健康風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞體內(nèi)，游離脂肪酸與TG時(shí)刻維持著動(dòng)態(tài)平衡，即細(xì)胞內(nèi)多余的脂肪酸能夠被轉(zhuǎn)化為TG進(jìn)行能量儲(chǔ)存，反之TG也能釋放出游離的脂肪酸為細(xì)胞供能。因此，脂肪酸合成的增加或脂肪酸β-氧化的減少是導(dǎo)致TG在細(xì)胞內(nèi)積累的主要原因。大量研究表明CAR作為脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β-氧化降解的重要載體，是表征線粒體功能是否受損的重要生物標(biāo)志物[30-33]。為此，本研究對(duì)CAR和TG二者之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了探索，結(jié)果如圖6所示，27種不同水樣暴露后，CAR和TG的豐度變化呈現(xiàn)顯著性的負(fù)相關(guān)。由此可見，環(huán)境水樣暴露造成的線粒體功能受損是造成HepG2細(xì)胞TG蓄積的主要原因之一。

圖5 不同脂類變化熱圖與脂類的代謝路徑注：(a)熱圖；(b)脂類的代謝路徑；SPH、S1P、PA和CDP-DG分別表示鞘氨醇、磷酸鞘氨醇、磷脂酸和胞苷二磷酸-二酰甘油。Fig. 5 Heat map and metabolic pathway of individual lipid classesNote: (a) heat map; (b) metabolic pathway of lipid classes; SPH, S1P, PA, CDP-DG stand for sphingosine, sphingosine-l-phosphate, phosphatidic acid, 1,2-diacyl-sn-glycerol, respectively.

圖6 不同實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞內(nèi)CAR和 TG豐度相對(duì)變化關(guān)系(vs.CON)Fig. 6 Correlation analysis of the fold changes of CAR and TG in HepG2 cells after exposure (vs.CON)

除TG大范圍上調(diào)之外，由圖5(a)可知，DG在包括中下游以及大部分支流的HepG2脂質(zhì)組中出現(xiàn)了普遍性的下調(diào)；PI在部分脂代謝影響程度高的水樣中出現(xiàn)了明顯的上調(diào)(4-1/2，5-1/2，6-1/2)，在S8、1-1/2、2-1/2水樣中則呈現(xiàn)明顯的下調(diào)。此前已有文獻(xiàn)報(bào)道[34]，DG和PI可以通過胰島素信號(hào)通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)儲(chǔ)存。研究指出DG可以激活蛋白激酶C(PKC)進(jìn)而調(diào)節(jié)胰島素受體活性使細(xì)胞產(chǎn)生胰島素耐受性。因此，DG的下調(diào)有可能誘使細(xì)胞胰島素通路激活，促使細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的合成并抑制TG的代謝分解。另外，胰島素信號(hào)通路的重要組成——磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號(hào)通路包含一系列重要中間體，例如磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)和三磷酸肌醇(PIP3)，而PI是合成這些中間體的重要前體物質(zhì)，PI的代謝紊亂進(jìn)一步表明暴露后HepG2細(xì)胞的胰島素耐受性可能發(fā)生了改變。最新的一項(xiàng)研究指出[35]，低劑量的雙酚A(BPA)能介導(dǎo)斑馬魚PI3K通路信號(hào)改變，并導(dǎo)致DG和PI的上調(diào)，而相同濃度的雙酚S(BPS)暴露則誘導(dǎo)斑馬魚DG和PI的下調(diào)。上述結(jié)果表明，不同污染物可能對(duì)DG和PI代謝產(chǎn)生不同類型的影響。在復(fù)合污染情況下，污染物借由包括PI3K在內(nèi)的胰島素信號(hào)通路導(dǎo)致脂類代謝紊亂的機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。

各個(gè)實(shí)驗(yàn)組與CON相比，PC和PE這2種主要的甘油磷脂亞類未呈現(xiàn)明顯的變化，而2種主要的鞘脂亞類SM和Cer的水平經(jīng)大部分支流水樣暴露后則出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)。由圖5(b)可知，SM和Cer二者在細(xì)胞體內(nèi)相互轉(zhuǎn)化，它們共同參與著細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，例如細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥調(diào)控。許多研究已經(jīng)證明[36-37]，通過鞘磷脂酶(SMase)水解SM產(chǎn)生的Cer可以介導(dǎo)細(xì)胞生長停滯。而對(duì)于癌細(xì)胞來說，低水平的Cer有利于細(xì)胞的生長增殖，此外，內(nèi)源性Cer水平上調(diào)或暴露于外源性Cer已被證明是有效的抗癌干預(yù)策略[38]。此前，Zhang等[39]利用三氯生(TCS)分別對(duì)人體肝細(xì)胞(L02)和HepG2細(xì)胞進(jìn)行暴露，并探究了TCS對(duì)2種細(xì)胞的脂代謝影響，發(fā)現(xiàn)低濃度的TCS對(duì)L02細(xì)胞產(chǎn)生了一定的毒性損傷，造成L02細(xì)胞內(nèi)SM和Cer水平顯著上調(diào)；相同劑量的TCS則對(duì)HepG2細(xì)胞的活力無顯著影響，而HepG2細(xì)胞內(nèi)SM和Cer水平顯著下調(diào)。本研究中，部分暴露組HepG2較低的SM和Cer水平可能意味著細(xì)胞對(duì)水環(huán)境的污染物應(yīng)激源產(chǎn)生了一定的耐受性。

綜上所述，本研究從污染物影響細(xì)胞脂質(zhì)代謝這一視角出發(fā)，系統(tǒng)性地評(píng)估了上海市黃浦江的綜合水質(zhì)情況，發(fā)現(xiàn)于黃浦江中游以及支流采集的水樣暴露會(huì)導(dǎo)致HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，造成細(xì)胞內(nèi)大量的TG積累，揭示了環(huán)境水體中復(fù)合污染物可能誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生脂毒性損傷。研究結(jié)果證明基于HepG2細(xì)胞體外暴露的脂質(zhì)組學(xué)方法可以有效地豐富目前環(huán)境生物監(jiān)測(cè)方法和毒性評(píng)價(jià)手段。