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        毛細(xì)管電泳技術(shù)在納米材料毒性研究領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展

        2021-12-07 11:08:20張凌燕黃沛力
        生態(tài)毒理學(xué)報(bào) 2021年4期
        關(guān)鍵詞:毛細(xì)管電泳蛋白質(zhì)

        張凌燕,黃沛力

        1. 首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,北京 100069 2. 包頭醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,包頭 014040

        納米材料(nanomaterials, NMs)因其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)和良好的生物相容性在電子、催化、農(nóng)業(yè)、紡織、包裝、化妝品、食品和生物醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用非常廣泛[1-8]。然而,這也導(dǎo)致了NMs不可避免地釋放到環(huán)境中,并通過接觸、吸入、口服給藥甚至注射等途徑造成直接或間接人體暴露。當(dāng)NMs進(jìn)入人體的生理環(huán)境后,血液、組織液和細(xì)胞質(zhì)中復(fù)雜的生物分子混合物都可能與NMs相互作用,形成被稱為“蛋白冠”或“小分子冠”的NMs和生物分子的復(fù)合物。這些復(fù)合物的形成不僅改變了NMs的組成和聚集狀態(tài),影響其生物分布、細(xì)胞攝取和細(xì)胞毒性,而且還可能改變生物分子的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能而導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生[9-12]。此外,不同組成、尺寸、形狀和表面修飾官能團(tuán)的NMs與生物分子的相互作用也存在很大差異[13-14]。因此,發(fā)展能夠詳細(xì)描述NMs、生物分子以及NMs和生物分子相互作用形成的復(fù)合物的分析技術(shù)不僅可以更好地理解它們?cè)隗w內(nèi)的生物學(xué)行為和最終命運(yùn),而且對(duì)NMs的安全性評(píng)價(jià)、優(yōu)化NMs設(shè)計(jì)合成和減輕NMs毒性至關(guān)重要。

        常用于直接測(cè)量NMs和生物分子相互作用的技術(shù)包括熒光光譜、表面等離子體共振、等溫滴定量熱法等[15-17]。熒光光譜能夠根據(jù)NMs和生物分子相互作用后熒光強(qiáng)度、峰位移和熒光壽命等的改變獲得結(jié)合參數(shù)信息,但是要求分析物必須有自發(fā)熒光或熒光標(biāo)簽,并需要在實(shí)驗(yàn)過程中排除生物分子自身熒光的干擾和嚴(yán)格控制影響熒光穩(wěn)定性的條件。表面等離子體共振技術(shù)可提供NMs和生物分子結(jié)合的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和親和力參數(shù),但需要通過復(fù)雜的步驟將NMs或生物分子固定在芯片表面,芯片價(jià)格昂貴且不可重復(fù)利用,對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量小的生物分子的檢出限也較高。等溫滴定量熱法能夠給出NMs和生物分子相互作用的熱力學(xué)參數(shù),但測(cè)定一個(gè)樣品所需的滴定時(shí)間較長(1.5~4 h),無法實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。因此,這些方法都難以快速、簡(jiǎn)便和靈敏地研究具有廣泛物理化學(xué)性質(zhì)的NMs和生物分子的相互作用,更無法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)NMs和生物分子相互作用的動(dòng)態(tài)變化過程[18]。

        毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)技術(shù)是以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力,毛細(xì)管為分離通道,依據(jù)待測(cè)樣品中各組分在毛細(xì)管內(nèi)電泳、電滲淌度或分配行為的不同而實(shí)現(xiàn)分離的一種新型液相分離技術(shù)。作為一種高靈敏、高分辨、高通量、條件溫和以及低消耗的分析技術(shù),CE在表征和分析原始NMs、生物或環(huán)境中存在的NMs以及NMs從生物或環(huán)境基質(zhì)中獲得的冠狀物成分方面具有很大潛力[19-22]。隨著近年來高靈敏度檢測(cè)器、高性能毛細(xì)管柱的研發(fā)和儀器聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用,CE成為研究NMs與生物分子相互作用的一種重要手段,不僅可以在線監(jiān)測(cè)NMs與生物分子相互作用的動(dòng)態(tài)行為變化,而且能夠收集結(jié)合參數(shù)信息并評(píng)估NMs對(duì)生物分子的反應(yīng)性和親和力[23-25]。本文主要從NMs與蛋白質(zhì)的相互作用(包括動(dòng)態(tài)行為表征、結(jié)合平衡分析、蛋白冠的形成和轉(zhuǎn)換監(jiān)測(cè))、NMs與其他生物分子的相互作用這2個(gè)方面綜述了近10年來有代表性的CE技術(shù)在NMs毒性研究領(lǐng)域的應(yīng)用及取得的新進(jìn)展,為了解NMs進(jìn)入體內(nèi)后的生物學(xué)行為和評(píng)價(jià)NMs的生物安全性提供新思路。

        1 納米材料與蛋白質(zhì)的相互作用(Interaction between nanomaterials and proteins)

        當(dāng)NMs暴露在復(fù)雜的生理環(huán)境時(shí),多種生物分子可結(jié)合到其表面而形成蛋白冠。蛋白冠決定了NMs在生物體內(nèi)被細(xì)胞識(shí)別的方式,并能夠調(diào)節(jié)NMs的攝入、清除以及在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程[26-27]。CE技術(shù)作為描述NMs與蛋白質(zhì)相互作用過程的有力手段,得到很多研究者的青睞。

        1.1 動(dòng)態(tài)行為表征(Characterization of dynamic behavior)

        CE技術(shù)可以有效考察NMs與蛋白質(zhì)之間相互作用的動(dòng)態(tài)行為,通過記錄相當(dāng)長一段時(shí)間(24 h或更長)內(nèi)的遷移時(shí)間和峰面積來評(píng)估NMs、蛋白質(zhì)以及NMs和蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物的變化。

        Li等[28]采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis, CZE)和親和毛細(xì)管電泳(affinity capillary electrophoresis, ACE)這2種分離模式分別研究了牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)與超順磁Fe3O4納米顆粒(nanoparticles, NPs)和Au NPs的相互作用。該研究發(fā)現(xiàn),BSA與Fe3O4NPs的相互作用表現(xiàn)為慢速結(jié)合動(dòng)力學(xué),二者需混合孵育過夜后復(fù)合物的峰才不再變化,即相互作用達(dá)到平衡。隨著BSA濃度的增加,F(xiàn)e3O4NPs的峰高逐漸降低至最終消失,且在峰左側(cè)出現(xiàn)的Fe3O4NPs-BSA復(fù)合物峰向左輕微移動(dòng),說明每個(gè)Fe3O4NPs中BSA分子的數(shù)量隨著蛋白濃度的增加而增加,直至由于空間位阻而無法容納更多BSA。而BSA與Au NPs的相互作用表現(xiàn)為快速結(jié)合動(dòng)力學(xué),電泳緩沖液中的BSA與樣品中的Au NPs相遇后即發(fā)生相互作用,但該相互作用僅使遷移率發(fā)生變化,而未使復(fù)合物和游離Au NPs的峰分離。隨著BSA濃度的增加,Au NPs的遷移時(shí)間縮短,表明Au NPs粒徑增大,且該變化隨著BSA濃度的增加越來越小,直到BSA達(dá)到一定高濃度時(shí)遷移率幾乎不再變化。Matczuk等[29]采用毛細(xì)管電泳-電感耦合等離子體質(zhì)譜(capillary electrophoresis coupled inductively coupled plasma mass spectrometry, CE-ICP-MS)研究了檸檬酸鹽修飾的Au NPs與白蛋白(albumin, ALB)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin, TRF)2種血清蛋白之間的相互作用。該研究發(fā)現(xiàn),在37 ℃條件下,10~50 nm的Au NPs與ALB孵育5 min后游離Au NPs的峰已消失,而5 nm的Au NPs與ALB孵育24 h后仍有5%的游離Au NPs存在。然而,Au NPs與TRF結(jié)合達(dá)到平衡大約需要5 min,且形成的結(jié)合物隨Au NPs粒徑增大而增多,但總量不超過10%,即平衡時(shí)主要以未結(jié)合的Au NPs為主。

        Matczuk等[30]還使用CE-ICP-MS方法觀察了CdSeS/ZnS量子點(diǎn)(quantum dots, QDs)與ALB、TRF這2種血清蛋白結(jié)合的兩步動(dòng)力學(xué)機(jī)制。在第一階段,只有一小部分QDs(約4%)轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)結(jié)合形式,但1 h后在電泳圖中就只觀察到一個(gè)單獨(dú)的與ALB結(jié)合物相對(duì)應(yīng)的Cd或Zn的信號(hào),即CdSeS/ZnS QDs已全部轉(zhuǎn)化為QDs-ALB結(jié)合物形式。而QDs-TRF結(jié)合物的形成要快得多(約5 min),并顯著導(dǎo)致ZnS殼層從CdSeS核上解體。Wang等[31]利用毛細(xì)管電泳-熒光(capillary electrophoresis coupled fluorescence, CE-FL)檢測(cè)法研究了CdSe/ZnS QDs與多巰基變性BSA(denatured BSA, dBSA)在不同pH和離子強(qiáng)度下相互作用的機(jī)理和動(dòng)力學(xué),發(fā)現(xiàn)QDs與dBSA的相互作用動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)為兩相動(dòng)力學(xué),即初始階段為線性,隨后為飽和平衡階段。此外,該研究還發(fā)現(xiàn)QDs表面的結(jié)合位點(diǎn)有不同的優(yōu)先級(jí),可以分層組裝配體,且會(huì)導(dǎo)致QDs表面多價(jià)巰基的低程度取代。當(dāng)dBSA和QDs混合后,由于形成了多種QDs-dBSA預(yù)飽和中間體,在電泳圖中可以分離出從游離QDs到結(jié)合QDs的不同形式,且形成的QDs-dBSA配合物的量與混合的物質(zhì)的量比例和混合時(shí)間相關(guān)。

        1.2 結(jié)合平衡分析(Analysis of binding equilibrium)

        當(dāng)NMs表面結(jié)合蛋白質(zhì)的濃度隨時(shí)間延長而不再改變時(shí),即達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。收集達(dá)到平衡時(shí)的結(jié)合數(shù)據(jù)對(duì)研究NMs與蛋白的相互作用非常重要,它可以為預(yù)測(cè)細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)不同NMs的吸收所作出的反應(yīng)提供依據(jù)。結(jié)合平衡常數(shù)(K)以及其他附加親和參數(shù)可以用CE內(nèi)外相互作用模式來測(cè)定,如生物分子與每個(gè)粒子的結(jié)合數(shù)、結(jié)合協(xié)同性以及表觀速率常數(shù)等(表1)。當(dāng)發(fā)生快速反應(yīng)(tbinding<>tCE),需要將反應(yīng)混合物孵育一段時(shí)間后再進(jìn)行分析,并分別使用CZE或FACE監(jiān)測(cè)電泳遷移率或峰高的變化來獲得結(jié)合參數(shù)。Matczuk等[32]利用CE-ICP-MS同時(shí)檢測(cè)NMs中的金屬元素和蛋白質(zhì)中的硫元素來確定蛋白冠的化學(xué)計(jì)量組成。通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)不同粒徑的Au NPs與ALB或人血清相互作用后的蛋白質(zhì)結(jié)合個(gè)數(shù)非常一致,這可能是由于ALB在血清中占主導(dǎo)地位。Boulos等[33]還利用ACE對(duì)具有不同表面電荷的Au納米棒(nanorods, NRs)與BSA的結(jié)合進(jìn)行了定量。通過測(cè)量隨著電泳緩沖液中蛋白濃度的增加Au NRs遷移率的改變來測(cè)定BSA吸附到每個(gè)帶負(fù)電和不帶電的Au NRs上的結(jié)合平衡常數(shù),發(fā)現(xiàn)無論Au NRs表面電荷多少,BSA與所有測(cè)試的Au NRs均具有類似的結(jié)合親和力。

        當(dāng)研究毛細(xì)管內(nèi)相對(duì)快速達(dá)到結(jié)合平衡的相互作用時(shí),可采用電泳介導(dǎo)的微分析(electrophoretically mediated microanalysis, EMMA)方法。例如,Wang等[34]采用EMMA法研究QDs和dBSA在毛細(xì)管內(nèi)的自組裝動(dòng)力學(xué),將QDs和dBSA連續(xù)注入毛細(xì)管,在恒定電場(chǎng)作用下,由于QDs的遷移速度比dBSA慢(dBSA第2位置注入),二者會(huì)發(fā)生局部微混合。通過該方式將不同物質(zhì)的量比例的QDs和dBSA在毛細(xì)管內(nèi)混合后觀察其相互作用。此過程中QDs-dBSA結(jié)合物的峰隨著dBSA濃度的增加而增加,而QDs的峰逐漸減小,直到dBSA∶QDs的物質(zhì)的量比為32∶1時(shí)達(dá)到平衡狀態(tài)。通過Hill方程可計(jì)算QDs和dBSA相互作用的解離常數(shù)(KD)和結(jié)合協(xié)同性(binding cooperativity, BC)。而當(dāng)QDs作為背景電解質(zhì)組分時(shí),還可以監(jiān)測(cè)其與2個(gè)不同生物分子的結(jié)合順序[35-36]。

        表1 毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)研究納米材料和蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)合信息Table 1 Binding information of the interactions between nanomaterials and proteins obtained by capillary electrophoresis (CE)

        當(dāng)研究的NPs和蛋白質(zhì)之間的相互作用相對(duì)較弱時(shí),可以采用毛細(xì)管電泳電動(dòng)力學(xué)Hummel-Dreyer方法(CE-HD)。例如,Ramírez-García等[37]在研究PEG功能化的ZnGa1.995Cr0.005O4NPs(ZGO-PEG NPs)與BSA之間的非特異性相互作用時(shí),首次嘗試使用該方法測(cè)定了不同離子強(qiáng)度下的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。該方法對(duì)結(jié)合參數(shù)的微小變化非常敏感,能夠反映帶相反電荷的離子在NPs表面的凝結(jié),表明ZGO-PEG NPs與BSA之間存在靜電相互作用。

        1.3 蛋白冠的形成和轉(zhuǎn)換監(jiān)測(cè)(Monitoring of formation and transformation of protein corona)

        在生理環(huán)境如血清中,NMs會(huì)遇到復(fù)雜的蛋白質(zhì)組,因而會(huì)形成隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化的蛋白冠。蛋白冠的形成和組成受多種參數(shù)控制,如NMs的大小、形狀和修飾官能團(tuán),蛋白質(zhì)的豐度、與NMs的結(jié)合親和力,血清基質(zhì)成分等。采用CE-ICP-MS技術(shù)可以在復(fù)雜的基質(zhì)中對(duì)含有可檢測(cè)元素的NMs及其蛋白冠的形成和轉(zhuǎn)換過程進(jìn)行定性和定量監(jiān)測(cè)。

        Matczuk等[29]利用CE-ICP-MS檢測(cè)Au、Fe和S元素,發(fā)現(xiàn)血清中的全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白(holo-transferrin, holo-TRF)、脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白(apo-transferrin, apo-TRF)和ALB與Au NPs的結(jié)合狀態(tài)會(huì)隨時(shí)間延長而發(fā)生改變。在與血清相互作用2 min后,Au NPs就會(huì)轉(zhuǎn)化為ALB和TRF結(jié)合物的形式。然而,當(dāng)Au NPs在血液中的循環(huán)時(shí)間延長至4 h后,2種形式的TRF峰均消失,即ALB完全取代了2種形式的TRF,成為蛋白冠中唯一的平衡成分。此外,Au NPs的尺寸影響蛋白冠的形成,不同大小的Au NPs表面形成蛋白冠的相對(duì)含量和吸附平衡時(shí)間存在差異,如5 nm和50 nm的Au NPs分別在20 min和24 h達(dá)到吸附平衡。而當(dāng)NMs表面化學(xué)性質(zhì)不同時(shí),其結(jié)合行為也存在差異。例如,將人血清和Au NRs混合后,Au NRs-PEG-COOH和apo-TRF立刻形成吸附層,成為主要的蛋白冠,該過程大約40 min完成;而Au NRs-PEG-NH2則首先形成ALB結(jié)合物,但這種軟冠中的ALB會(huì)逐漸被其他不太豐富的蛋白取代,說明這些蛋白對(duì)胺化表面具有更高的親和力[38]。

        此外,研究發(fā)現(xiàn),ALB與CdSeS/ZnS QDs表面的結(jié)合在1 h后完成,且沒有明顯破壞QDs的核殼結(jié)構(gòu);而TRF與之結(jié)合后則會(huì)導(dǎo)致ZnS外殼的解離[30]。該研究還發(fā)現(xiàn),CdSeS/ZnS QDs在真實(shí)血清環(huán)境中同樣也會(huì)失去外殼,但并不是因?yàn)榕c主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合,而是與ALB和TRF以外的血漿蛋白相互作用,表明一些較小的血漿蛋白可能對(duì)QDs表面有更高的親和力。該結(jié)果有助于闡明QDs向機(jī)體目標(biāo)區(qū)域傳遞的機(jī)制,但不能明確CdSeS/ZnS QDs失去外殼是否會(huì)產(chǎn)生特定類型的NMs毒性。

        2 納米材料與其他生物分子的相互作用(Interaction between nanomaterials and other biomolecules)

        CE評(píng)價(jià)NMs與生物分子之間的相互作用并不局限于蛋白質(zhì),在生物基質(zhì)中存在的其他小分子如寡核苷酸、病毒、DNA、適配體和多肽等也可能和NMs相互作用形成冠。

        Alsudir和Lai[40]利用毛細(xì)管電泳-紫外(capillary electrophoresis coupled ultraviolet, CE-UV)檢測(cè)法分析了TiO2NPs與單鏈DNA和雙鏈DNA的相互作用,發(fā)現(xiàn)TiO2NPs與單鏈DNA結(jié)合后涂上PEG涂層可精確測(cè)定分散TiO2NPs的濃度,分析靈敏度提高10倍~16倍。該研究發(fā)現(xiàn)單鏈DNA是一種比雙鏈DNA更有效的吸附劑,可以通過其糖-磷酸骨架與TiO2NPs發(fā)生更強(qiáng)的相互作用。Stanisavljevic等[41]采用CE-UV和毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光(capillary electrophoresis coupled laser-induced fluorescence, CE-LIF)方法證實(shí)了鏈霉親和素(streptavidin, strep)修飾的MPA-CdTe QDs與所選寡核苷酸之間存在相互作用,可用于標(biāo)記檢測(cè)生物素化寡核苷酸癌序列BCL-2和乙型肝炎病毒癌序列,該檢測(cè)可能有助于此類疾病的快速診斷。該研究團(tuán)隊(duì)還利用CE-LIF和凝膠電泳發(fā)現(xiàn)CdTe QDs與雞基因組DNA和500 bp DNA片段之間的相互作用依賴于CdTe QDs尺寸與DNA之間的匹配度[42]。

        Girardot等[43]利用微芯片毛細(xì)管電泳模式(microchip capillary electrophoresis format, FACMCE)評(píng)估了不同性質(zhì)和組成的電泳緩沖溶液中適配子(aptamer)標(biāo)記的Fe2O3NPs與溶菌酶(aptamer靶標(biāo))之間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。該技術(shù)能夠測(cè)定溶菌酶上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和二者解離常數(shù),從而證明溶菌酶aptamer與NPs結(jié)合后仍然保留靶向功能。

        Grela等[44]研究了在毛細(xì)管電色譜中聚合物NPs作為偽固定相與多種生物活性肽的相互作用,發(fā)現(xiàn)聚合物NPs與黃體生成素釋放激素和緩激肽有很強(qiáng)的相互作用,并通過改變顆粒的大小研究其對(duì)肽電色譜行為的影響。Wang和Xia[45]利用CE-FL檢測(cè)配體與QDs之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移,并結(jié)合熒光峰遷移時(shí)間的改變,共同證明了在復(fù)雜的結(jié)合溶液(細(xì)胞裂解液)中多組氨酸肽聚合物與QDs的相互作用。Brambilla等[46-47]通過CE-LIF和輔助技術(shù)研究了聚氰基丙烯酸烷酯NPs和聚乳酸NPs對(duì)濃度接近生理?xiàng)l件的單體和可溶性低聚物形式的Aβ1-42肽的動(dòng)電學(xué)行為的影響。

        3 展望(Prospect)

        NMs憑借其優(yōu)越性能成為眾多領(lǐng)域最具吸引力和發(fā)展最迅速的革命性材料,其種類和產(chǎn)量的迅速增加使其不可避免地在環(huán)境中累積,并最終進(jìn)入人體。因此,深入研究NMs與生物分子的相互作用有助于揭示NMs可能的毒性效應(yīng)和內(nèi)在機(jī)制。在眾多研究NMs和生物分子相互作用的方法中,毛細(xì)管電泳技術(shù)不僅可以與各種檢測(cè)器聯(lián)用監(jiān)測(cè)NMs與生物分子相互作用的動(dòng)態(tài)變化,還可以收集結(jié)合參數(shù)信息并評(píng)估NMs對(duì)蛋白質(zhì)及生物小分子的反應(yīng)性和親和力。然而,由于復(fù)雜的生物系統(tǒng)中存在眾多蛋白質(zhì)和生物小分子,利用常規(guī)CE技術(shù)對(duì)多種生物分子進(jìn)行精確定性和定量仍然存在很大挑戰(zhàn)。近年來,隨著CE和分子質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及電噴霧電離質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)的聯(lián)用[48]、金屬穩(wěn)定同位素標(biāo)記生物分子技術(shù)的發(fā)展[49]、集成芯片形式的轉(zhuǎn)變[43]以及毛細(xì)管涂層和電極修飾技術(shù)的改善[50-51],CE技術(shù)可能成為深入了解NMs和生物分子相互作用機(jī)制和預(yù)測(cè)NMs在生物系統(tǒng)中分布和傳遞的一項(xiàng)前沿技術(shù)。

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