(首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

透射式電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope，簡(jiǎn)稱TEM)，是根據(jù)電子光學(xué)原理，用電子束和電子透鏡代替光束和光學(xué)透鏡，使物質(zhì)的細(xì)微結(jié)構(gòu)在非常高的放大倍數(shù)下成像的儀器。透射電子顯微鏡分辨率高、放大倍數(shù)大，廣泛應(yīng)用于材料科學(xué)與生命科學(xué)領(lǐng)域。目前日本電子1400-Plus透射電鏡自帶安裝了Radius軟件，它是一款性能強(qiáng)大的應(yīng)用軟件，可采集樣品的高分辨率圖像，并可以對(duì)高分辨率圖像進(jìn)行處理分析，最后可以自動(dòng)生成圖像和報(bào)表。透射電鏡因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，價(jià)格昂貴，對(duì)軟件操作有嚴(yán)格的要求，平時(shí)還需要正確恰當(dāng)?shù)娜粘＞S護(hù)保養(yǎng)以保證儀器的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，并延長(zhǎng)其使用壽命。本文介紹了日本電子1400-Plus透射電鏡的Radius軟件基本操作和日常維護(hù)[1-3]。

1 Radius軟件介紹

Radius軟件是德國(guó)EMSIS公司研發(fā)并且應(yīng)用于透射電子顯微鏡上的專用軟件。該軟件直接控制顯微鏡，可采集處理和保存樣品的高分辨率圖像，可以更改放大倍率和控制測(cè)向儀，以及降低和升高熒光屏幕。圖像采集期間，軟件會(huì)讀出顯微鏡上安裝的攝像頭的數(shù)據(jù)，并實(shí)時(shí)成像將其顯示在計(jì)算機(jī)顯示屏上，還可以對(duì)攝像頭進(jìn)行不同設(shè)置，如陰影矯正、攝像頭分辨率、曝光時(shí)間等。圖像處理期間，可采集處理和保存樣品的高分辨率圖像，例如測(cè)量線條長(zhǎng)度或角的度數(shù)等，測(cè)量對(duì)象將顯示在圖像的繪圖層中，測(cè)量結(jié)果將會(huì)顯示在表格中，可將測(cè)量結(jié)果導(dǎo)出為XLS 格式。此軟件可以對(duì)圖像執(zhí)行傅里葉分析和多種濾鏡可逆地優(yōu)化圖像質(zhì)量，優(yōu)化亮度對(duì)比度，使得圖像變得更加光滑和清晰。除此之外，還有自動(dòng)聚焦、像散矯正、翻轉(zhuǎn)圖像，以及以任意角度旋轉(zhuǎn)圖像等功能。圖像保存期間，可以生成 MS-Word 報(bào)表或TIF 文件格式保存圖像。如果以 TIF 格式保存采集的圖像，則會(huì)隨圖像一起自動(dòng)保存大量重要的圖像信息，例如所用攝像頭、曝光時(shí)間、分辨率、創(chuàng)建時(shí)間等。

2 Radius軟件操作界面簡(jiǎn)介(圖1)

軟件為圖像的拍照采集處理設(shè)計(jì)的，操作界面簡(jiǎn)潔方便，此外有很大的配置靈活度，可方便地對(duì)其進(jìn)行調(diào)整，以滿足各種任務(wù)的具體需求。分為5個(gè)功能分區(qū)，每個(gè)分區(qū)都有不同的功能。

2.1 菜單欄

可以通過使用對(duì)應(yīng)菜單調(diào)用多個(gè)命令，可添加、修改或刪除菜單，從而滿足各種需求。

2.2 文檔組

文檔組包含所有已載入的文檔如圖表等。啟動(dòng)本軟件時(shí)，文檔組為空，此時(shí)放入樣品采集圖像或執(zhí)行各種圖像處理操作，更改源圖像和創(chuàng)建新圖像時(shí)，文檔組中會(huì)填入相關(guān)內(nèi)容。

2.3 工具欄

將經(jīng)常使用的命令鏈接到某個(gè)按鈕，從而可以快速便捷地訪問這些功能。有很多功能只能通過工具欄訪問，如為圖像添加批注所需的繪圖功能等。

2.4 工具窗口

將各種功能合并到不同的組中。例如：在屬性工具窗口中，可以找到用于活動(dòng)文檔的所有信息。與對(duì)話框不同的是，工具窗口只要開啟就會(huì)始終在用戶界面上可見，這樣可隨時(shí)訪問工具窗口中的設(shè)置。

2.5 狀態(tài)欄

包含大量信息，例如每個(gè)功能的簡(jiǎn)要描述，只需將鼠標(biāo)指針移到各命令或按鈕上就可以查看此信息。

圖1 Radius軟件操作界面

3 Radius軟件的基本操作

3.1 Radius軟件拍照步驟

3.1.1尋找樣品

將裝有銅網(wǎng)的樣品桿插入樣品室，打開預(yù)抽開關(guān)進(jìn)行樣品隔離室預(yù)抽，約2～3分鐘后綠燈亮，然后順時(shí)針轉(zhuǎn)→推→轉(zhuǎn)樣品桿，最后緩慢送入觀察位置，打開高壓，待束流數(shù)值穩(wěn)定，打開燈絲電流開關(guān)，燈絲電流自動(dòng)達(dá)到飽和，熒光屏上出現(xiàn)圖像。用軌跡球或按鈕移動(dòng)樣品，在電鏡熒光屏上找到樣品的位置。

3.1.2動(dòng)態(tài)觀察

插入相機(jī)，按Live按鈕(圖2)，用控制面板上的放大倍率旋鈕選擇放大倍數(shù)，聚焦旋鈕聚焦圖像，亮度旋鈕調(diào)節(jié)亮度，觀察到樣品的畫面。

3.1.3拍攝圖像

微調(diào)焦距，得到清晰的圖像，按Snapshot按鈕(圖2)，采集圖像。

3.1.4漂移矯正

如果樣品漂移，可以在Snapshot drift correction前打勾，啟動(dòng)漂移矯正功能。此功能無需事先校準(zhǔn)，但會(huì)使拍圖像所花時(shí)間延長(zhǎng)1倍以上。

圖2 相機(jī)控制

3.2 Radius軟件保存圖片步驟

Radius軟件里可以自動(dòng)保存拍到的圖像。點(diǎn)擊Camera Control里面的Acquisition Settings圖標(biāo)(圖2中方框)，進(jìn)入設(shè)置界面(如圖3)，在Saving下的Snapshot里設(shè)置自動(dòng)保存圖像的路徑，在Movie里設(shè)置自動(dòng)保存視頻的路徑。在Create Subdirectory前打勾，會(huì)將圖像自動(dòng)保存在以當(dāng)天日期為名的子文件夾里，在這個(gè)界面里也可以設(shè)置保存圖像的格式。按Options按鈕后彈出的設(shè)置TIF格式的界面(如圖4)，這是EMSIS公司推薦采用的原始數(shù)據(jù)+縮略圖的TIF格式，圖像會(huì)包含兩層，第一層是8位的圖像，里面印入了標(biāo)尺、圖像信息以及對(duì)圖像做的任何標(biāo)記(比如測(cè)量的結(jié)果)，可以在任何圖像軟件中打開。第二層是16位的原始數(shù)據(jù)，也包含了相關(guān)信息，可以后續(xù)進(jìn)一步處理或者修改，但是只能在Radius軟件中打開。如果用Radius軟件打開，會(huì)直接打開第二層，用其他軟件打開時(shí)，會(huì)優(yōu)先打開第一層。

圖3 文件設(shè)置

圖4 圖片格式

3.3 Radius軟件陰影矯正步驟

陰影矯正是刪除來源于成像系統(tǒng)但不屬于實(shí)際圖像信息的噪聲。如果不進(jìn)行陰影矯正，成像系統(tǒng)會(huì)導(dǎo)致實(shí)際圖像信息上疊加噪聲，使得實(shí)際圖像失真。采用陰影矯正后，圖像中的這些噪聲會(huì)被測(cè)定并立刻在實(shí)時(shí)圖像中矯正。TEM圖像的背景噪音分為兩種，對(duì)這兩種噪音的矯正在Radius軟件中分別稱為dark current correction(矯正暗背底)和flatfield correction(矯正亮背底)。dark current correction采集的是圖像信號(hào)傳輸中的噪音，比如CCD/CMOS芯片、圖像采集卡或者電腦造成的噪音。flatfield correction采集的是有電子束照射下產(chǎn)生的噪音，比如閃爍體上的斑點(diǎn)、光纖的輪廓等。一般情況下，更換燈絲和很長(zhǎng)一段時(shí)間未用電鏡，需要矯正暗背底和亮背底，當(dāng)發(fā)現(xiàn)圖像中總是在固定位置出現(xiàn)黑斑、白斑、塊狀噪音的時(shí)候，就需要重新采集參照?qǐng)D像并矯正亮背底即可。

3.3.1矯正準(zhǔn)備

采集陰影矯正圖像期間，光路中不應(yīng)有樣品，或在樣品中找到大小足夠的孔。設(shè)置加速電壓100kV，然后將TEM的電子束亮度調(diào)整到常用的大小，放大到常用的倍率。如果高倍和低倍都很常用，可選擇中間值比如100K。

3.3.2調(diào)節(jié)束流

調(diào)節(jié)電子束流，看成像是否正常。多數(shù)情況下current density 取30～40pA/cm2時(shí)效果最佳。確保熒光屏幕受到均勻照明，將電子束展寬，使得整個(gè)熒光屏幕受到均勻照明。展寬電子束，直至其比熒光屏幕大至少 10%。

3.3.3軟件操作

按軟件界面最上面的Acquire進(jìn)入Calibration界面(如圖5)，按Shading Correction，然后按Calibrate，進(jìn)入Shading correction界面，確認(rèn)Use existing dark current correction images前面打了勾，然后按Next。

進(jìn)入Step 4/6頁面，如果之前已經(jīng)設(shè)置好電子束，可以直接按下一步?？偣残枰臅r(shí)5到10分鐘左右。如果采集到一半時(shí)彈出對(duì)話框顯示太暗或者太亮，請(qǐng)?jiān)赥EM上調(diào)整亮度后重新開始。

全部結(jié)束后，軟件會(huì)自動(dòng)再拍一張照片，得到的應(yīng)該是灰色的亮度均勻的圖像，如果滿意，陰影矯正完成。

圖5 陰影矯正

3.4 Radius軟件圖像測(cè)量步驟

3.4.1選擇工具

3.4.2測(cè)量方法

測(cè)量時(shí)，可以在圖像里起始點(diǎn)用鼠標(biāo)左鍵點(diǎn)擊，然后移動(dòng)到結(jié)束點(diǎn)再點(diǎn)擊一次確認(rèn)線段，結(jié)果會(huì)立即顯示在圖像上和圖6所示的列表里。

3.4.3數(shù)據(jù)保存

雖然拍到的圖像能自動(dòng)保存，但測(cè)量結(jié)果不會(huì)自動(dòng)保存，需要按Save按鈕保存。如果圖像按照默認(rèn)的TIF疊加縮略圖的格式保存，測(cè)量結(jié)果會(huì)同時(shí)保存在第一層的縮略圖和第二層的原始圖像中?？s略圖中已經(jīng)印入，無法修改，原始圖像中的測(cè)量結(jié)果可以修改。

圖6 測(cè)量工具

4 日常維護(hù)

4.1 電鏡室環(huán)境要求

電鏡機(jī)房需要潔凈的環(huán)境，進(jìn)入電鏡機(jī)房前要有緩沖間，機(jī)房墻壁需要刷漆，門窗平時(shí)密閉，每天用吸塵器徹底清潔機(jī)房，保持電鏡、桌面、地面的潔凈。實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入室內(nèi)需要換拖鞋或戴鞋套，無關(guān)人員不得隨意進(jìn)入主機(jī)室，盡量減少人員流動(dòng)，以防止灰塵落在樣品和儀器上而影響機(jī)器的正常運(yùn)行和像片質(zhì)量。電鏡對(duì)于外界的磁場(chǎng)是很敏感的，對(duì)于交變磁場(chǎng)則提出了嚴(yán)格的要求，一般要求小于3毫高斯，如果不能滿足條件，需要采取屏蔽措施例如用鐵網(wǎng)或銅網(wǎng)做成包裹電鏡室的封鎖體。電源應(yīng)遠(yuǎn)離振動(dòng)源和噪聲。為防止其他用電設(shè)備的干擾，最好專線為電鏡供電，需要電壓穩(wěn)流器，由于電鏡需要使用三相電源，必須裝有斷電保護(hù)開關(guān)，電鏡的配電盤應(yīng)安裝在離鏡體2米以外的地方，電鏡要有單獨(dú)良好的地線，接地電阻小于4Ω。電鏡在工作時(shí)是一個(gè)熱源，冷卻水雖然能夠帶走一部分熱量，也只有1/2至1/3左右，大量的熱量仍然散發(fā)在室內(nèi)，需要室溫控制在20±5℃，如外界溫度不滿足條件，需要使用空調(diào)。此外，為保證室溫的恒定，電鏡室最好是密閉空間并采用隔熱門窗。為防止電子元器件受潮漏電及真空系統(tǒng)快速抽真空，電鏡室內(nèi)的濕度控制在50%～70%[4，5]。

4.2 電鏡真空系統(tǒng)維護(hù)

4.2.1空氣壓縮機(jī)的定期維護(hù)

空氣壓縮機(jī)是將大氣壓縮成壓強(qiáng)較大的氣體以推動(dòng)電鏡內(nèi)氣體閥門的運(yùn)動(dòng)，由于大氣中含有水分，故在壓縮機(jī)底部會(huì)有存水，當(dāng)存水不能及時(shí)排放時(shí)就會(huì)腐蝕儀器，引起鐵管生銹導(dǎo)致出水管堵塞，排水不暢易引發(fā)空壓機(jī)故障等?？諌悍潘芷诳筛鶕?jù)不同區(qū)域和季節(jié)進(jìn)行調(diào)整，最好每月檢查一次，定期放水并記錄，放水時(shí)要關(guān)閉燈絲和高壓，放水地點(diǎn)在空氣壓縮機(jī)下方。此外，空壓機(jī)的吸氣過濾網(wǎng)需及時(shí)除塵[6]。

4.2.2機(jī)械泵的定期維護(hù)

注意觀察機(jī)械泵油量及油的顏色，油量應(yīng)在檢查玻璃窗口超過2/3處，油的顏色應(yīng)為透明或黃色。觀察機(jī)械泵有無漏油，如果漏油，需要更換油封。注意機(jī)械泵有無噪音，主要是皮帶運(yùn)行的時(shí)間長(zhǎng)，表面污損產(chǎn)生摩擦聲音，若有噪音，可將皮帶吸塵清潔，或者更換皮帶[7]。

4.2.2樣品桿和測(cè)角臺(tái)的定期維護(hù)

為保證真空度，注意檢查樣品桿的O型圈，定期清潔和涂抹真空脂。暫時(shí)不用的樣品桿，放在樣品室中預(yù)抽，這樣可以有效縮短樣品桿在電鏡中的預(yù)抽時(shí)間，還可以延長(zhǎng)樣品桿的使用壽命。如果樣品桿帶入雜質(zhì)污染阻塞測(cè)角臺(tái)氣路，可以導(dǎo)致測(cè)角臺(tái)處漏氣，所以需要平時(shí)經(jīng)常擦拭樣品桿，定期將測(cè)角臺(tái)內(nèi)部各個(gè)部件拆下仔細(xì)擦拭清洗[8]。

4.3 電鏡高壓系統(tǒng)維護(hù)

在高壓控制窗口中設(shè)置目標(biāo)電壓(如100kV)，點(diǎn)擊HT Voltage-ON，等待暗電流穩(wěn)定后，才可以加燈絲電壓電流。暗電流是加上高壓但未打開燈絲加熱電流時(shí)的電流，一定程度反映出高壓的穩(wěn)定度，不同的高壓對(duì)應(yīng)不同的暗電流。暗電流過高或過低都是不正常的，可以直接反應(yīng)出電子束的狀態(tài)。電鏡長(zhǎng)時(shí)間不用，第一次開機(jī)時(shí)加高壓的速度不能過快，否則高壓不能加上，會(huì)自動(dòng)停止，所以需要逐步慢慢升高壓(要求：0～60kV，0.2kV/sec，約5分鐘；60～90kV，0.1kV/4sec，約20 分鐘；90～100kV，0.1kV/6sec，約10 分鐘)。確認(rèn)暗電流穩(wěn)定后，觀察暗電流數(shù)值，暗電流數(shù)值<電壓值/2+2。在100kV 時(shí)，暗電流約為50.9～51.1μA，隨著時(shí)間推移該值會(huì)有所變動(dòng)，但不能超過51.3μA。按下Filament ON 按鈕，等電子束發(fā)射穩(wěn)定，最終的束流比不加燈絲電流時(shí)上升不超過3μA(束流=暗電流+發(fā)射電流)。若亮度不滿足要求，可以通過調(diào)節(jié)偏壓調(diào)節(jié)燈絲發(fā)射量，偏壓是指在燈絲的柵極上加上一定的電壓以阻止電子過度逸出，偏壓的指示值越大，其偏壓絕對(duì)值越小，抑制能力越差，電子束發(fā)射量越大。在使用一段時(shí)間后才調(diào)節(jié)偏壓，一般先調(diào)高Fine，再調(diào)高Coarse[5]。

4.4 電鏡循環(huán)水維護(hù)

循環(huán)水用來帶走透射電鏡運(yùn)轉(zhuǎn)過程中線圈及擴(kuò)散泵所產(chǎn)生的熱量，透射電鏡內(nèi)的各級(jí)磁透鏡需通過循環(huán)水冷卻。一般循環(huán)水的水溫設(shè)置在18～20℃，循環(huán)水的溫度既不能太低也不能太高，溫度太低時(shí)電鏡無法啟動(dòng)，溫度太高時(shí)會(huì)導(dǎo)致電鏡熱保護(hù)從而掉高壓甚至電鏡停機(jī)保護(hù)。當(dāng)lens打開時(shí)電鏡會(huì)產(chǎn)生大量的熱量，因此循環(huán)水室必須配備空調(diào)，而且最好為柜式空從而防止夏季熱量無法及時(shí)散出。冬天可根據(jù)實(shí)際情況選擇是否關(guān)閉空調(diào)，必須注意循環(huán)水室內(nèi)的溫度可以適當(dāng)高一些，但是絕對(duì)不能太低，溫度太低時(shí)會(huì)導(dǎo)致結(jié)晶水落到電路板上從而燒毀電路板。開機(jī)前一般先查看循環(huán)水屋的空調(diào)是否正常工作，循環(huán)水的溫度是否正常。定期檢查循環(huán)水狀況，每月檢查一次水位，半年到一年徹底更換一次，若循環(huán)水混濁變質(zhì)，應(yīng)馬上更換循環(huán)水，防止循環(huán)系統(tǒng)堵塞和結(jié)垢，保證正常的運(yùn)轉(zhuǎn)。換水時(shí)除了將水箱的水徹底放空，還應(yīng)該用濕布將水箱內(nèi)壁的雜質(zhì)污物擦洗干凈，防止滋生絮狀微生物然后堵塞管路。放水時(shí)水位上限低于水箱出水口1cm，水位下限為水箱中白色浮漂，低于白色浮漂循環(huán)水將不能啟動(dòng)，要保證循環(huán)水的水位達(dá)到要求，水位低于禁戒線時(shí)要及時(shí)添加純凈水。水箱吸氣過濾網(wǎng)要定期除塵[9-11]。