李瓊，李秋燕，張艷

(1. 蘭州新區(qū)第一人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，蘭州 730300；2. 永登縣人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科，蘭州 730300；3. 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 麻醉科，蘭州 730013)

肺癌是肺部最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤首位[1]，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌發(fā)病率的80%以上[2]。目前，治療NSCLC的方法有手術(shù)、化療、放療、免疫治療和基因治療等，但肺癌患者，尤其是晚期肺癌患者的5年生存率僅15%，早期診斷、早期治療對提高患者的預(yù)后尤其重要[3]，超過70%的NSCLC患者首次確診時即為晚期。因此，迫切需要探究NSCLC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以推動臨床診治[4]。

miRNA是1類由18～28個核苷酸組成的非編碼RNA分子，在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用并參與細(xì)胞的多種病理生理過程[5]，一些miRNA已被報道具有抑癌或原癌基因的功能[6]。目前已發(fā)現(xiàn)490多種miRNA分子[7]，miR-760是其中之一。更多的研究表明，miR-760表達(dá)的失調(diào)可見于多種惡性腫瘤，并與其生長、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[8-13]。miR-760通過調(diào)節(jié)Notch1/HES1-PTEN/AKT信號通路抑制肝癌細(xì)胞對阿霉素的耐藥性[12]；miR-760通過靶向SP1介導(dǎo)的PTEN/AKT信號通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[13]，但其在NSCLC病灶中的表達(dá)及功能尚不清楚。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 臨床資料 收集2016年6月至2018年6月于蘭州大學(xué)第一醫(yī)院手術(shù)治療的36例NSCLC患者腫瘤組織與癌旁正常組織，所有樣本均置-80 ℃冰箱保存?；颊吣挲g(48.0±4.6) 歲， 男性/女性為20/16。所有患者TNM分期均為T1或T2期，其中T1期17例， T2期19例， 腫瘤長徑分別為(2.2±0.7) cm和(5.6±1.8) cm，患者術(shù)前均未接受任何形式抗腫瘤治療。本研究獲得蘭州大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者或家屬均自愿簽署知情同意書。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 人傳代NSCLC細(xì)胞系(A549、H1299和H23)及正常人傳代肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)，均購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。DMEM培養(yǎng)液、10% FBS、TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR擴(kuò)增試劑盒、MTT和細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，均購自Sigma-Aldrich公司。miR-760模擬物(mimics)和陰性對照(negative control，NC)、pcDNA3.1-BATF3和空白對照(blank vector)、LipofectamineTM2000試劑盒，均購自Thermo Fisher Scientific公司。兔抗人多克隆BATF3抗體、兔抗人β-actin抗體和山羊抗兔IgG二抗，均購自Abcam公司。qRT-PCR引物由TaKaRa公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將1.1.2細(xì)胞系冷凍管置于37 ℃溫水浴中解凍，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中穩(wěn)定3～4 h；用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，待鋪底率達(dá)40%～50%時按LipofectamineTM2000 試劑盒說明書轉(zhuǎn)染miR-760至培養(yǎng)細(xì)胞，完成操作后將轉(zhuǎn)染液更換為正常細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 RNA抽提與qRT-PCR檢測 按照說明書通過TRIzol試劑從腫瘤組織和細(xì)胞系中提取總RNA。將抽提的RNA濃度稀釋至500 ng/mL，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒從總RNA中反轉(zhuǎn)錄cDNA。qRT-PCR檢測miR-760和BATF3 mRNA的表達(dá)，擴(kuò)增引物序列詳見表1。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，1個循環(huán)；94 ℃ 30 s，62 ℃ 40 s，35個循環(huán)。結(jié)果用2-△△Ct法計算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 目標(biāo)基因的引物序列

1.2.4 Western blotting檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá) 添加蛋白裂解液至組織樣本與細(xì)胞系，提取總蛋白；加入5×蛋白上樣緩沖液后煮沸10 min，用10% SDS-PAGE分離蛋白，將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉溶液封閉載體膜1 h，加入兔抗人多克隆BATF3抗體(1∶1 000)于4 ℃條件下孵育過夜；PBS漂洗后加入山羊抗兔IgG(1∶8 000)室溫孵育1 h，漂洗后滴加ECL液顯影；通過凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白質(zhì)條帶圖片，用ImageJ軟件分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 MTT法檢測腫瘤細(xì)胞的增殖能力 分別取轉(zhuǎn)染后24、48、72和96 h的A549細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，111.8×g離心5 min；用10% FBS調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×103個/mL；將細(xì)胞接種于96孔板，加MTT(20 μL/孔)孵育4 h；PBS漂洗3次后每孔滴加150 μL二甲基亞砜，室溫孵育15 min。通過酶標(biāo)儀讀取光密度[D(490 nm)]值，計算腫瘤細(xì)胞的增殖率。

1.2.6 Transwell法檢測腫瘤細(xì)胞的遷移能力 將6×104個腫瘤細(xì)胞添加至200 μL無血清培養(yǎng)液中，過夜(饑餓)培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后加入10% FBS調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個/mL。取150 μL細(xì)胞懸液接種于Transwell上室，下室加入450 μL含10% FBS的培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用90%甲醇固定，0.05%結(jié)晶紫染色，置倒置相差顯微鏡下計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1miR-760mRNA在NSCLC腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)qRT-PCR檢測miR-760 mRNA在36例NSCLC患者腫瘤組織與正常癌旁組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，miR-760 mRNA在NSCLC患者腫瘤組織中的表達(dá)量顯著低于正常癌旁組織(P<0.01，圖1A)。

qRT-PCR檢測miR-760 mRNA在NSCLC細(xì)胞系(A549、H1299和H23)及正常人肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)中的表達(dá)。結(jié)果顯示，miR-760 mRNA在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)量顯著低于正常肺上皮細(xì)胞，且在A549細(xì)胞中的表達(dá)量最低(均P<0.01，圖1B)。

注：A. miR-760 mRNA在NSCLC腫瘤及正常癌旁組織中的相對表達(dá)量；B. miR-760 mRNA在NSCLC腫瘤細(xì)胞系、正常人肺上皮細(xì)胞中的相對表達(dá)量。與癌旁組織相比，**P<0.01； 與BEAS-2B組相比， ##P<0.01。圖1 miR-760 mRNA在NSCLC腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

2.2BATF3mRNA在NSCLC腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)qRT-PCR檢測BATF3 mRNA在36例NSCLC患者腫瘤組織與正常癌旁組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，BATF3 mRNA在NSCLC患者腫瘤組織中的表達(dá)量顯著高于正常癌旁組織(P<0.01，圖2A)。

qRT-PCR檢測BATF3 mRNA在NSCLC細(xì)胞系(A549、H1299和H23)及正常人肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)中的表達(dá)。結(jié)果顯示，BATF3 mRNA在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)量顯著高于正常人肺上皮細(xì)胞，且在A549細(xì)胞中的表達(dá)量最高(均P<0.01，圖2B)。

注：A. BATF3 mRNA在NSCLC腫瘤及正常癌旁組織中的相對表達(dá)量；B. BATF3 mRNA在NSCLC腫瘤細(xì)胞系、正常人肺上皮細(xì)胞中的相對表達(dá)量。與癌旁組織相比，**P<0.01； 與BEAS-2B組相比， ##P<0.01。圖2 BATF3 mRNA在NSCLC腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

2.3 過表達(dá)miR-760對NSCLC腫瘤細(xì)胞系惡性生物學(xué)行為的影響由于A549細(xì)胞miR-760表達(dá)量較其他細(xì)胞低(圖1)，因此，選擇將miR-760 mimics轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染操作后miR-760相對表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01，圖3A)。過表達(dá)miR-760可顯著抑制A549細(xì)胞的增殖和遷移(均P<0.01，圖3B、3C)。

注：A. 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)后A549細(xì)胞miR-760的相對表達(dá)量；B. 轉(zhuǎn)染miR-760對A549細(xì)胞增殖的影響；C. 轉(zhuǎn)染miR-760對A549細(xì)胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×400)。與miR-760 NC組相比，**P<0.01。圖3 轉(zhuǎn)染miR-760對A549細(xì)胞系惡性生物學(xué)行為的影響

注：A. BATF3 與miR-760的3＇UTR可能存在結(jié)合位點(diǎn)；B. BATF3與miR-760的3＇UTR結(jié)合位點(diǎn)；C. WT BATF3 3＇UTR和Mut BATF3 3＇UTR與miR-760的結(jié)合情況；D. miR-760 mimics轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后對 BATF3蛋白表達(dá)的影響。與miR-760 NC組相比，**P<0.01。圖4 BATF3是NSCLC細(xì)胞中miR-760的靶基因

2.5 miR-760靶向BATF3影響NSCLC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為將pcDNA3.1-BATF3轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)BATF3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01，圖5A)。經(jīng)miR-760 mimics轉(zhuǎn)染和pcDNA3.1-BATF3共轉(zhuǎn)染，過表達(dá)BATF3顯著促進(jìn)了miR-760 mimics誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的增殖和遷移(均P<0.01，圖5B、5C)，即miR-760與BATF3協(xié)同作用促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移。

注：A. pcDNA3.1-BATF3轉(zhuǎn)染組與空白對照組BATF3蛋白的表達(dá)水平；B. BATF3轉(zhuǎn)染對A549細(xì)胞增殖的影響；C. BATF3轉(zhuǎn)染對A549細(xì)胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×400)。與空白對照組相比，**P<0.01； 與miR-760 mimics+空白載體組相比， ##P<0.01。圖5 miR-760靶向BATF3影響NSCLC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為

3 討論

肺癌是國內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一[18]。NSCLC是肺癌中發(fā)生率和死亡率最高的腫瘤類型，許多患者在發(fā)現(xiàn)時已為晚期[19]。目前，肺癌的治療手段主要是手術(shù)治療輔以化療，但患者的預(yù)后很差[20]。所以，提高患者早期診斷率、生存率和預(yù)后效果是亟待解決的問題，這迫切需要厘清NSCLC的發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制。

miRNA除了參與細(xì)胞正常的生理過程，還參與腫瘤細(xì)胞的病理過程[21]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-10a/b在髓系分化和急性髓系白血病的發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[8]，miR-140在結(jié)直腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮抑制作用[9]。miR-760是miRNA家族的重要成員，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中miR-760的表達(dá)量顯著低于癌旁組織(P<0.01)，這與Yan等[22]的研究結(jié)果一致，提示miR-760的異常低表達(dá)與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-760表達(dá)升高顯著抑制NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549的增殖與遷移(均P<0.01)。

研究發(fā)現(xiàn)，BATF-/-小鼠Th17缺乏，并且對通常誘發(fā)類似多發(fā)性硬化癥的自身免疫條件具有抵抗力[23]。BATF3是BATF家族的重要成員，研究發(fā)現(xiàn)BATF3的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[24-25]。本研究通過檢測NSCLC組織與癌旁組織BATF3的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織BATF3的表達(dá)量顯著高于癌旁組織(P<0.01)；檢測NSCLC細(xì)胞與正常肺上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞BATF3的表達(dá)量顯著高于正常細(xì)胞(均P<0.01)，這與Cao等[26]的研究結(jié)果一致，提示BATF3的異常高表達(dá)參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程。

研究發(fā)現(xiàn)miR-150通過靶向PDCD4促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性發(fā)展[10]；miR-1179通過靶向精子相關(guān)抗原5介導(dǎo)的AKT信號通路抑制人NSCLC細(xì)胞的生長和侵襲[11]；miR-760通過靶向BATF3/AP-1/CyclinD1信號通路抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長[26]。本研究通過質(zhì)粒構(gòu)建和熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，BATF3是miR-760的直接靶點(diǎn)；進(jìn)一步將pcDNA3.1-BATF3轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)BATF3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；A549細(xì)胞經(jīng)miR-760 mimics轉(zhuǎn)染和pcDNA3.1-BATF3共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)BATF3促進(jìn)miR-760 mimics誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的增殖和遷移，提示miR-760通過與BATF3互作抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移，即miR-760靶向BATF3調(diào)控NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549的惡性發(fā)展。

綜上所述，miR-760在NSCLC組織與細(xì)胞系中低表達(dá)；BATF3在NSCLC組織與細(xì)胞系中高表達(dá)；miR-760的過表達(dá)能抑制NSCLC組織中BATF3的表達(dá)，miR-760靶向BATF3調(diào)控NSCLC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。以上研究提示BATF3未來可能作為NSCLC的治療靶標(biāo)。