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        miR-760靶基因BATF3在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其對腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

        2021-12-06 10:33:04李瓊李秋燕張艷
        現(xiàn)代免疫學(xué) 2021年6期
        關(guān)鍵詞:肺癌檢測

        李瓊,李秋燕,張艷

        (1. 蘭州新區(qū)第一人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科,蘭州 730300;2. 永登縣人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科,蘭州 730300;3. 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 麻醉科,蘭州 730013)

        肺癌是肺部最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤首位[1],其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌發(fā)病率的80%以上[2]。目前,治療NSCLC的方法有手術(shù)、化療、放療、免疫治療和基因治療等,但肺癌患者,尤其是晚期肺癌患者的5年生存率僅15%,早期診斷、早期治療對提高患者的預(yù)后尤其重要[3],超過70%的NSCLC患者首次確診時即為晚期。因此,迫切需要探究NSCLC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以推動臨床診治[4]。

        miRNA是1類由18~28個核苷酸組成的非編碼RNA分子,在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用并參與細(xì)胞的多種病理生理過程[5],一些miRNA已被報道具有抑癌或原癌基因的功能[6]。目前已發(fā)現(xiàn)490多種miRNA分子[7],miR-760是其中之一。更多的研究表明,miR-760表達(dá)的失調(diào)可見于多種惡性腫瘤,并與其生長、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[8-13]。miR-760通過調(diào)節(jié)Notch1/HES1-PTEN/AKT信號通路抑制肝癌細(xì)胞對阿霉素的耐藥性[12];miR-760通過靶向SP1介導(dǎo)的PTEN/AKT信號通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[13],但其在NSCLC病灶中的表達(dá)及功能尚不清楚。

        1 資料與方法

        1.1 研究對象

        1.1.1 臨床資料 收集2016年6月至2018年6月于蘭州大學(xué)第一醫(yī)院手術(shù)治療的36例NSCLC患者腫瘤組織與癌旁正常組織,所有樣本均置-80 ℃冰箱保存?;颊吣挲g(48.0±4.6) 歲, 男性/女性為20/16。所有患者TNM分期均為T1或T2期,其中T1期17例, T2期19例, 腫瘤長徑分別為(2.2±0.7) cm和(5.6±1.8) cm,患者術(shù)前均未接受任何形式抗腫瘤治療。本研究獲得蘭州大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),所有患者或家屬均自愿簽署知情同意書。

        1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 人傳代NSCLC細(xì)胞系(A549、H1299和H23)及正常人傳代肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B),均購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。DMEM培養(yǎng)液、10% FBS、TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR擴(kuò)增試劑盒、MTT和細(xì)胞凋亡檢測試劑盒,均購自Sigma-Aldrich公司。miR-760模擬物(mimics)和陰性對照(negative control,NC)、pcDNA3.1-BATF3和空白對照(blank vector)、LipofectamineTM2000試劑盒,均購自Thermo Fisher Scientific公司。兔抗人多克隆BATF3抗體、兔抗人β-actin抗體和山羊抗兔IgG二抗,均購自Abcam公司。qRT-PCR引物由TaKaRa公司合成。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將1.1.2細(xì)胞系冷凍管置于37 ℃溫水浴中解凍,于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中穩(wěn)定3~4 h;用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,待鋪底率達(dá)40%~50%時按LipofectamineTM2000 試劑盒說明書轉(zhuǎn)染miR-760至培養(yǎng)細(xì)胞,完成操作后將轉(zhuǎn)染液更換為正常細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

        1.2.2 RNA抽提與qRT-PCR檢測 按照說明書通過TRIzol試劑從腫瘤組織和細(xì)胞系中提取總RNA。將抽提的RNA濃度稀釋至500 ng/mL,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒從總RNA中反轉(zhuǎn)錄cDNA。qRT-PCR檢測miR-760和BATF3 mRNA的表達(dá),擴(kuò)增引物序列詳見表1。反應(yīng)條件:94 ℃ 2 min,1個循環(huán);94 ℃ 30 s,62 ℃ 40 s,35個循環(huán)。結(jié)果用2-△△Ct法計算,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        表1 目標(biāo)基因的引物序列

        1.2.4 Western blotting檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá) 添加蛋白裂解液至組織樣本與細(xì)胞系,提取總蛋白;加入5×蛋白上樣緩沖液后煮沸10 min,用10% SDS-PAGE分離蛋白,將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉溶液封閉載體膜1 h,加入兔抗人多克隆BATF3抗體(1∶1 000)于4 ℃條件下孵育過夜;PBS漂洗后加入山羊抗兔IgG(1∶8 000)室溫孵育1 h,漂洗后滴加ECL液顯影;通過凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白質(zhì)條帶圖片,用ImageJ軟件分析結(jié)果,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        1.2.5 MTT法檢測腫瘤細(xì)胞的增殖能力 分別取轉(zhuǎn)染后24、48、72和96 h的A549細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化后,111.8×g離心5 min;用10% FBS調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×103個/mL;將細(xì)胞接種于96孔板,加MTT(20 μL/孔)孵育4 h;PBS漂洗3次后每孔滴加150 μL二甲基亞砜,室溫孵育15 min。通過酶標(biāo)儀讀取光密度[D(490 nm)]值,計算腫瘤細(xì)胞的增殖率。

        1.2.6 Transwell法檢測腫瘤細(xì)胞的遷移能力 將6×104個腫瘤細(xì)胞添加至200 μL無血清培養(yǎng)液中,過夜(饑餓)培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后加入10% FBS調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個/mL。取150 μL細(xì)胞懸液接種于Transwell上室,下室加入450 μL含10% FBS的培養(yǎng)液,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用90%甲醇固定,0.05%結(jié)晶紫染色,置倒置相差顯微鏡下計數(shù)。

        2 結(jié)果

        2.1miR-760mRNA在NSCLC腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)qRT-PCR檢測miR-760 mRNA在36例NSCLC患者腫瘤組織與正常癌旁組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示,miR-760 mRNA在NSCLC患者腫瘤組織中的表達(dá)量顯著低于正常癌旁組織(P<0.01,圖1A)。

        qRT-PCR檢測miR-760 mRNA在NSCLC細(xì)胞系(A549、H1299和H23)及正常人肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)中的表達(dá)。結(jié)果顯示,miR-760 mRNA在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)量顯著低于正常肺上皮細(xì)胞,且在A549細(xì)胞中的表達(dá)量最低(均P<0.01,圖1B)。

        注:A. miR-760 mRNA在NSCLC腫瘤及正常癌旁組織中的相對表達(dá)量;B. miR-760 mRNA在NSCLC腫瘤細(xì)胞系、正常人肺上皮細(xì)胞中的相對表達(dá)量。與癌旁組織相比,**P<0.01; 與BEAS-2B組相比, ##P<0.01。圖1 miR-760 mRNA在NSCLC腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

        2.2BATF3mRNA在NSCLC腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)qRT-PCR檢測BATF3 mRNA在36例NSCLC患者腫瘤組織與正常癌旁組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示,BATF3 mRNA在NSCLC患者腫瘤組織中的表達(dá)量顯著高于正常癌旁組織(P<0.01,圖2A)。

        qRT-PCR檢測BATF3 mRNA在NSCLC細(xì)胞系(A549、H1299和H23)及正常人肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)中的表達(dá)。結(jié)果顯示,BATF3 mRNA在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)量顯著高于正常人肺上皮細(xì)胞,且在A549細(xì)胞中的表達(dá)量最高(均P<0.01,圖2B)。

        注:A. BATF3 mRNA在NSCLC腫瘤及正常癌旁組織中的相對表達(dá)量;B. BATF3 mRNA在NSCLC腫瘤細(xì)胞系、正常人肺上皮細(xì)胞中的相對表達(dá)量。與癌旁組織相比,**P<0.01; 與BEAS-2B組相比, ##P<0.01。圖2 BATF3 mRNA在NSCLC腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

        2.3 過表達(dá)miR-760對NSCLC腫瘤細(xì)胞系惡性生物學(xué)行為的影響由于A549細(xì)胞miR-760表達(dá)量較其他細(xì)胞低(圖1),因此,選擇將miR-760 mimics轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染操作后miR-760相對表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01,圖3A)。過表達(dá)miR-760可顯著抑制A549細(xì)胞的增殖和遷移(均P<0.01,圖3B、3C)。

        注:A. 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)后A549細(xì)胞miR-760的相對表達(dá)量;B. 轉(zhuǎn)染miR-760對A549細(xì)胞增殖的影響;C. 轉(zhuǎn)染miR-760對A549細(xì)胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色,×400)。與miR-760 NC組相比,**P<0.01。圖3 轉(zhuǎn)染miR-760對A549細(xì)胞系惡性生物學(xué)行為的影響

        注:A. BATF3 與miR-760的3'UTR可能存在結(jié)合位點(diǎn);B. BATF3與miR-760的3'UTR結(jié)合位點(diǎn);C. WT BATF3 3'UTR和Mut BATF3 3'UTR與miR-760的結(jié)合情況;D. miR-760 mimics轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后對 BATF3蛋白表達(dá)的影響。與miR-760 NC組相比,**P<0.01。圖4 BATF3是NSCLC細(xì)胞中miR-760的靶基因

        2.5 miR-760靶向BATF3影響NSCLC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為將pcDNA3.1-BATF3轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞,Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)BATF3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01,圖5A)。經(jīng)miR-760 mimics轉(zhuǎn)染和pcDNA3.1-BATF3共轉(zhuǎn)染,過表達(dá)BATF3顯著促進(jìn)了miR-760 mimics誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的增殖和遷移(均P<0.01,圖5B、5C),即miR-760與BATF3協(xié)同作用促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移。

        注:A. pcDNA3.1-BATF3轉(zhuǎn)染組與空白對照組BATF3蛋白的表達(dá)水平;B. BATF3轉(zhuǎn)染對A549細(xì)胞增殖的影響;C. BATF3轉(zhuǎn)染對A549細(xì)胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色,×400)。與空白對照組相比,**P<0.01; 與miR-760 mimics+空白載體組相比, ##P<0.01。圖5 miR-760靶向BATF3影響NSCLC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為

        3 討論

        肺癌是國內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,也是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一[18]。NSCLC是肺癌中發(fā)生率和死亡率最高的腫瘤類型,許多患者在發(fā)現(xiàn)時已為晚期[19]。目前,肺癌的治療手段主要是手術(shù)治療輔以化療,但患者的預(yù)后很差[20]。所以,提高患者早期診斷率、生存率和預(yù)后效果是亟待解決的問題,這迫切需要厘清NSCLC的發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制。

        miRNA除了參與細(xì)胞正常的生理過程,還參與腫瘤細(xì)胞的病理過程[21]。研究發(fā)現(xiàn),miR-10a/b在髓系分化和急性髓系白血病的發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[8],miR-140在結(jié)直腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮抑制作用[9]。miR-760是miRNA家族的重要成員,其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn),腫瘤組織中miR-760的表達(dá)量顯著低于癌旁組織(P<0.01),這與Yan等[22]的研究結(jié)果一致,提示miR-760的異常低表達(dá)與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),miR-760表達(dá)升高顯著抑制NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549的增殖與遷移(均P<0.01)。

        研究發(fā)現(xiàn),BATF-/-小鼠Th17缺乏,并且對通常誘發(fā)類似多發(fā)性硬化癥的自身免疫條件具有抵抗力[23]。BATF3是BATF家族的重要成員,研究發(fā)現(xiàn)BATF3的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[24-25]。本研究通過檢測NSCLC組織與癌旁組織BATF3的表達(dá)發(fā)現(xiàn),腫瘤組織BATF3的表達(dá)量顯著高于癌旁組織(P<0.01);檢測NSCLC細(xì)胞與正常肺上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞BATF3的表達(dá)量顯著高于正常細(xì)胞(均P<0.01),這與Cao等[26]的研究結(jié)果一致,提示BATF3的異常高表達(dá)參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程。

        研究發(fā)現(xiàn)miR-150通過靶向PDCD4促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性發(fā)展[10];miR-1179通過靶向精子相關(guān)抗原5介導(dǎo)的AKT信號通路抑制人NSCLC細(xì)胞的生長和侵襲[11];miR-760通過靶向BATF3/AP-1/CyclinD1信號通路抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長[26]。本研究通過質(zhì)粒構(gòu)建和熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn),BATF3是miR-760的直接靶點(diǎn);進(jìn)一步將pcDNA3.1-BATF3轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)BATF3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01);A549細(xì)胞經(jīng)miR-760 mimics轉(zhuǎn)染和pcDNA3.1-BATF3共轉(zhuǎn)染,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)BATF3促進(jìn)miR-760 mimics誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的增殖和遷移,提示miR-760通過與BATF3互作抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移,即miR-760靶向BATF3調(diào)控NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549的惡性發(fā)展。

        綜上所述,miR-760在NSCLC組織與細(xì)胞系中低表達(dá);BATF3在NSCLC組織與細(xì)胞系中高表達(dá);miR-760的過表達(dá)能抑制NSCLC組織中BATF3的表達(dá),miR-760靶向BATF3調(diào)控NSCLC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。以上研究提示BATF3未來可能作為NSCLC的治療靶標(biāo)。

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