王菊，梁蕾

(1. 長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)護(hù)理教研室，長春 130031；2. 長春市傳染病醫(yī)院 藥劑科，長春 130123)

桔梗始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為藥食同源類中藥，具有抑炎、鎮(zhèn)咳、祛痰等藥理作用，三萜皂苷類、甾醇類、酚類、黃酮類及多糖類是其主要功效成分[1]。近年來，桔梗多糖的生物活性逐漸引起了人們的注意，它具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、保肝及抗感染等作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，桔梗多糖可顯著抑制HeLa細(xì)胞增殖[3]，也可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮抑制小鼠子宮頸癌細(xì)胞U14生長的作用[4]。但桔梗多糖對S180惡性肉瘤細(xì)胞的作用未見報(bào)道，同時(shí)，鑒于免疫功能調(diào)節(jié)是中藥抗腫瘤的重要機(jī)制[5]，本研究以S180荷瘤小鼠模型為研究對象，在進(jìn)一步探討桔梗多糖是否具有抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長作用的過程中重點(diǎn)關(guān)注其對機(jī)體免疫功能的影響，以期為桔梗多糖的臨床應(yīng)用奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象S180瘤株及小鼠淋巴瘤YAC-1細(xì)胞，購自上海歌凡生物科技有限公司。C57BL/6小鼠，55只，SPF級，雄性，體質(zhì)量(20±2) g，6～8周齡，購自長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 藥物與試劑桔梗多糖粉末，購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，多糖含量>80.0%；環(huán)磷酰胺注射液，購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；FBS及RPMI 1640培養(yǎng)液，購自HyClone公司；刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)及MTT溶液，購自Sigma-Aldrich公司；EZ-SepTMMouse 1×淋巴細(xì)胞分離液，購自南京建成生物工程研究所；小鼠血清IL-2及IFN-γ檢測試劑盒，購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠TLR4、髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)及NF-κB多克隆抗體，購自CST公司；兔抗小鼠GAPDH多克隆抗體及山羊抗兔IgG-HRP二抗，購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器BHC-1300ⅡA2生物安全柜，來自上海鼎科科學(xué)儀器有限公司；BPH-9042精密恒溫培養(yǎng)箱，來自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JA5103N電子天平，來自上海力辰儀器科技有限公司；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀，來自Thermo Fisher Scientific公司；Mini-PROTEAN Tetra電泳槽，來自伯樂公司。

1.4 小鼠S180腫瘤模型的建立用無菌生理鹽水稀釋培養(yǎng)至對數(shù)生長期的S180細(xì)胞至2×106個(gè)/mL密度，制備S180細(xì)胞懸液。隨機(jī)取5只健康C57BL/6小鼠，分別腹腔注射0.4 mL上述細(xì)胞懸液。1周后，可見小鼠腹部明顯凸起、漲大，頸椎脫臼處死小鼠，并在無菌條件下抽取腹水。于顯微鏡下計(jì)數(shù)腹水細(xì)胞，無菌生理鹽水調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL，另隨機(jī)取40只健康小鼠,分別于右腋皮下處注射上述腹水懸液0.2 mL，制備S180荷瘤小鼠模型。

1.5 分組、給藥及抑瘤率、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的測定將荷癌小鼠隨機(jī)分為模型對照組、環(huán)磷酰胺(0.02 g/kg)組及桔梗多糖低(0.2 g/kg)、高(0.4 g/kg)劑量組，每組10只；另取10只健康小鼠作為空白對照組。桔梗多糖的給藥劑量參考陸文總等[4]的研究并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。環(huán)磷酰胺組腹腔注射給藥，桔梗多糖低、高劑量組灌胃給藥，1次/d，連續(xù)治療14 d。末次給藥后24 h，取小鼠球后靜脈叢血液，離心、分離血清；頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下剝離瘤塊，電子天平稱重；摘取小鼠的胸腺及脾臟，稱重后計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)。

抑瘤率=(模型對照組瘤質(zhì)量-藥物處理組瘤質(zhì)量)/模型對照組瘤質(zhì)量×100%

胸腺(脾臟)指數(shù)=胸腺(脾臟)質(zhì)量/體質(zhì)量×100%

1.6 H-E染色觀察瘤組織病理形態(tài)用4%多聚甲醛固定新鮮腫瘤組織樣本，經(jīng)75%乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋等步驟后，將組織塊切成4 μm厚度的薄片；分別用蘇木精及伊紅染色處理，經(jīng)中性樹脂封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片。

1.7 淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)的測定參考文獻(xiàn)[6]處死小鼠后，無菌條件下剖取脾臟，PBS漂洗2次；將脾臟置于RPMI 1640培養(yǎng)液中，用注射器拉桿柄輕輕研磨，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾。收集濾液于1.5 mL無菌離心管中，1 700×g離心5 min；將沉淀溶于Tris-NH4Cl溶液中，用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞；1 700×g離心5 min收集沉淀；將沉淀溶于RPMI 1640完全培養(yǎng)液中。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞，調(diào)整脾臟淋巴細(xì)胞懸液至密度為5×106個(gè)/mL。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中先分別加入100 μL脾臟淋巴細(xì)胞懸液，再分別加入100 μL ConA(10 μg/mL)，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)48 h， 此為實(shí)驗(yàn)組； 陰性對照組不加ConA， 其余操作同實(shí)驗(yàn)組。參考文獻(xiàn)[7]，通過MTT法檢測各孔光密度[D(570 nm)]值，計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)(公式如下)。

淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)=實(shí)驗(yàn)組D(570 nm)值/對照組D(570 nm)值

1.8 NK細(xì)胞活度的測定調(diào)整處于對數(shù)生長期的YAC-1細(xì)胞(靶細(xì)胞)密度至1×105個(gè)/mL；調(diào)整制備的脾臟淋巴細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞，含NK細(xì)胞)密度至2×106個(gè)/mL。各取100 μL效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞懸液至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)72 h，此為實(shí)驗(yàn)組； 另設(shè)靶細(xì)胞組(培養(yǎng)液和靶細(xì)胞懸液各100 μL)和效應(yīng)細(xì)胞組(培養(yǎng)液和效應(yīng)細(xì)胞懸液各100 μL)，其余操作同實(shí)驗(yàn)組。MTT法檢測各孔D(570 nm)值，計(jì)算NK細(xì)胞活度(公式如下)。

NK細(xì)胞活度={1-[實(shí)驗(yàn)組D(570 nm)值/靶細(xì)胞組D(570 nm)值-效應(yīng)細(xì)胞組D(570 nm)值/靶細(xì)胞組D(570 nm)值]}×100%

1.9 小鼠血清細(xì)胞因子水平的測定ELISA檢測各組小鼠血清IL-2及IFN-γ水平，具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.10 小鼠瘤組織炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)水平的測定于冰水浴條件下的研缽中研磨腫瘤組織，加入組織裂解液充分裂解，制備總蛋白提取液。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法測定總蛋白含量，煮沸變性后加入上樣緩沖液。進(jìn)行12% SDS-PAGE及半干法轉(zhuǎn)膜，加入相應(yīng)的兔抗小鼠TLR4(1∶2 000)、MyD88(1∶1 000)及NF-κB(1∶1 000)多克隆抗體，于4 ℃條件下孵育12 h。依次經(jīng)TBST洗膜，山羊抗兔IgG-HRP孵育，顯影及曝光后，通過Quantity One軟件分析各目的條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 桔梗多糖抑制S180荷瘤小鼠腫瘤的生長與空白對照組比較，給藥7 d后，環(huán)磷酰胺組小鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)；給藥14 d后，與空白對照組比較，環(huán)磷酰胺組及模型對照組小鼠體質(zhì)量顯著降低(均P<0.05)；給藥7 d及14 d后，與空白對照組比較，桔梗多糖低、高劑量組小鼠體質(zhì)量無顯著變化(均P>0.05)。與模型對照組比較，給藥7 d及14 d后，環(huán)磷酰胺組小鼠體質(zhì)量降低，而桔梗多糖低、高劑量組小鼠體質(zhì)量增加，但差異不顯著(均P>0.05)。與模型對照組比較，環(huán)磷酰胺組及桔梗多糖低、高劑量組小鼠瘤質(zhì)量顯著減少(均P<0.05)，抑瘤率顯著增加(均P<0.05)。H-E染色結(jié)果可見，模型對照組小鼠腫瘤細(xì)胞排列緊密，核固縮、核碎裂少見；環(huán)磷酰胺組小鼠腫瘤細(xì)胞排列松散，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)核固縮、核碎裂等改變；桔梗多糖低、高劑量組小鼠腫瘤細(xì)胞排列較緊密，部分細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核碎裂等改變。(圖1)

注：A. 各組小鼠體質(zhì)量的變化曲線；B. 各組小鼠腫瘤質(zhì)量的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；C. 各組小鼠腫瘤標(biāo)本的比較； D. 各組荷瘤小鼠抑瘤率的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；E. 各組荷瘤小鼠腫瘤組織的H-E染色結(jié)果(×200)。Ⅰ為空白對照組；Ⅱ?yàn)槟Ｐ蛯φ战M；Ⅲ為環(huán)磷酰胺組；Ⅳ為桔梗多糖低劑量組；Ⅴ為桔梗多糖高劑量組。與空白對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05。圖1 桔梗多糖對各組小鼠及移植瘤一般情況的影響〗

2.2 桔梗多糖增加S180荷瘤小鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，模型對照組、環(huán)磷酰胺組及桔梗多糖低、高劑量組小鼠的胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；與模型對照組比較，環(huán)磷酰胺組小鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)顯著降低(均P<0.05)，而桔梗多糖低、高劑量組小鼠相應(yīng)指數(shù)顯著增加(均P<0.05)。以上結(jié)果提示，桔梗多糖對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用與其促進(jìn)小鼠免疫功能有關(guān)。(表1)

表1 桔梗多糖對各組小鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)的影響

2.3 桔梗多糖增加S180荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)及NK細(xì)胞活度與空白對照組比較，模型對照組、環(huán)磷酰胺組小鼠淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)及NK細(xì)胞活度顯著降低(均P<0.05)，桔梗多糖低劑量組的NK細(xì)胞活度與之相比也顯著降低(P<0.05)。與模型對照組比較，環(huán)磷酰胺組小鼠淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)顯著降低(P<0.05)，而NK細(xì)胞活度變化無顯著差異(P>0.05)；與模型對照組比較，桔梗多糖低、高劑量組小鼠淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)及NK細(xì)胞活度顯著增加(均P<0.05)。以上結(jié)果進(jìn)一步提示，桔梗多糖對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用與其促進(jìn)機(jī)體免疫功能有關(guān)。(表2)

表2 桔梗多糖對各組小鼠淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)及NK細(xì)胞活度的影響

2.4 桔梗多糖增加S180荷瘤小鼠血清IL-2及IFN-γ水平與空白對照組比較，模型對照組、環(huán)磷酰胺組小鼠血清IL-2及IFN-γ水平顯著降低(均P<0.05)，桔梗多糖低、高劑量組小鼠IL-2水平變化無顯著差異(均P>0.05)，而IFN-γ水平顯著降低(均P<0.05)。與模型對照組比較，環(huán)磷酰胺組IL-2水平顯著降低(P<0.05)，IFN-γ水平顯著增加(P<0.05)；給予低、高劑量的桔梗多糖治療后，IL-2及IFN-γ水平顯著增加(均P<0.05)。上述結(jié)果表明，增加荷瘤小鼠血清細(xì)胞因子表達(dá)是桔梗多糖抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長的可能機(jī)制之一。(表3)

表3 桔梗多糖對各組小鼠血清IL-2及IFN-γ水平的影響

2.5 桔梗多糖下調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的活性與模型對照組比較，環(huán)磷酰胺組及桔梗多糖低、高劑量組TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表達(dá)量顯著降低(均P<0.05)。上述結(jié)果表明，桔梗多糖具有抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路活化的作用。(圖2、表4)

注：Ⅱ?yàn)槟Ｐ蛯φ战M；Ⅲ為環(huán)磷酰胺組；Ⅳ為桔梗多糖低劑量組；Ⅴ為桔梗多糖高劑量組。圖2 桔梗多糖對各組小鼠瘤組織TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表達(dá)的影響

表4 桔梗多糖對各組小鼠瘤組織TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表達(dá)的量化影響

3 討論

機(jī)體免疫系統(tǒng)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。近年來，免疫類中藥多糖因其抗腫瘤活性顯著、毒副作用小且具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床[8]。胸腺是T細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟的場所，對維持淋巴器官發(fā)育及機(jī)體免疫功能的正常發(fā)揮作用關(guān)鍵，胸腺若退化機(jī)體的免疫功能也會(huì)降低[9]。脾臟是機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫的“生發(fā)”中心，為機(jī)體最大的外周淋巴組織器官，通過輸出巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等調(diào)節(jié)免疫功能[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型對照組比較，桔梗多糖低、高劑量組小鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)均明顯增加，提示桔梗多糖對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用與增加其免疫功能有關(guān)。此外，桔梗多糖低、高劑量組小鼠淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)及NK細(xì)胞活度均明顯增加，進(jìn)一步提示桔梗多糖對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用與其免疫功能的增加有關(guān)。

細(xì)胞因子表達(dá)水平是衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)，可間接反映機(jī)體的免疫功能和腫瘤的進(jìn)展情況[11]。IL-2由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，具有強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)，為最強(qiáng)的免疫活性細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為是免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗腫瘤作用的首要因素[12]。IFN-γ由T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，是1種免疫調(diào)節(jié)劑，可增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性，也可促進(jìn)CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的敏感性[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型對照組比較，桔梗多糖低、高劑量組小鼠IL-2及IFN-γ水平均明顯增加，表明增加荷瘤小鼠血清細(xì)胞因子的表達(dá)是其抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長的可能機(jī)制之一。

研究表明，TLR信號通路與許多中藥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)，其中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在中藥多糖主導(dǎo)的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14-15]。MyD88是1種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)銜接蛋白，含TLR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，TLR4可通過與MyD88結(jié)合促進(jìn)NF-κB活化，誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的活化，進(jìn)而改善機(jī)體免疫功能是多種中藥成分發(fā)揮抗腫瘤作用的主要機(jī)制[18-19]。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，與模型對照組比較，桔梗多糖低、高劑量組小鼠TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表達(dá)均明顯降低，表明阻斷該信號通路的活化與其抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長關(guān)系密切。

綜上所述，本研究證實(shí)桔梗多糖具有抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長的作用，該作用與改善機(jī)體免疫功能有關(guān)，但具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。