王玲，梅峰，薛蕊，李淼，徐慧，趙楓姝，竇駿

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，南京 210009)

黑色素瘤是一類高度異質(zhì)性的腫瘤，其發(fā)病率和死亡率近年來持續(xù)上升，晚期黑色素瘤患者的10年生存率僅為10%～25%[1-2]。盡管傳統(tǒng)的放化療、免疫調(diào)節(jié)藥物和靶向治療在臨床試驗(yàn)中取得了令人鼓舞的成果，但患者易產(chǎn)生耐藥性，造成疾病復(fù)發(fā)。而腫瘤異質(zhì)性可能是黑色素瘤靶向治療耐藥的重要原因之一[3-7]。為克服耐藥并有效治療黑色素瘤，亟需尋求新的治療方法。

受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1， ROR1)是單次跨膜受體酪氨酸激酶，可促進(jìn)腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移，是疾病診斷的標(biāo)志物之一，也是腫瘤治療的理想靶點(diǎn)之一[8-11]。近年來，已有文獻(xiàn)報(bào)道ROR與許多血液和實(shí)體惡性腫瘤的形成有關(guān)，如淋巴細(xì)胞白血病[12-13]、卵巢癌[14-16]、乳腺癌[17]以及肺癌[18]等。但關(guān)于ROR在惡性黑色素瘤中的研究報(bào)道相對(duì)較少。因此，本研究以鼠源黑色素瘤細(xì)胞系B16F10為研究對(duì)象，用慢病毒載體介導(dǎo)shRNA下調(diào)ROR1分子的表達(dá)，通過腫瘤疫苗免疫C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)，觀察下調(diào)ROR1分子表達(dá)后免疫鼠的免疫活性和抗瘤效應(yīng)，并初步探討其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象黑色素瘤B16F10細(xì)胞系，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；293T、YAC-1、Scramble和Lv-shROR1-B16F10細(xì)胞，由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系竇駿課題組保存并提供。SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠，15只，6～8周齡，體質(zhì)量約16 g，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.3 細(xì)胞的培養(yǎng)將B16F10、Scramble和Lv-shROR1-B16F10細(xì)胞重懸于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 慢病毒的包裝及感染將慢病毒重組質(zhì)粒pHBLV-U6-shROR1-ZGreen和pHBLV-U6-shNC-ZGreen分別與psPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48和72 h后收集病毒上清液，4 ℃、96 010×g離心4 h(超速離心法)濃縮病毒，后檢測(cè)其滴度；再感染B16F10細(xì)胞，具體操作詳見參考文獻(xiàn)[19]，得到的細(xì)胞分別命名為Lv-shROR1-B16F10和Scramble；隨后通過qRT-PCR和Western blotting驗(yàn)證ROR1分子的下調(diào)情況。

1.5 黑色素瘤疫苗免疫鼠實(shí)驗(yàn)分別將B16F10、Scramble和Lv-shROR1-B16F10 3組(每組5只小鼠)細(xì)胞的密度調(diào)整至5×106個(gè)/mL，于-80 ℃條件冷凍30 min，再于37 ℃水浴鍋水溶15 min，反復(fù)凍融3次制備成疫苗后皮下免疫小鼠3次，每次間隔10 d;末次免疫10 d后于小鼠背部皮下注射野生型(wild type, WT)B16F10細(xì)胞(1×106個(gè)/只)。定期測(cè)量移植瘤大小，計(jì)算腫瘤體積并記錄其變化(V=ab2/2, a為長徑， b為短徑)，于第43 d統(tǒng)一剝離瘤體。用qRT-PCR 和Western blotting分別檢測(cè)各組免疫鼠瘤組織中ROR1mRNA及蛋白表達(dá)情況。

1.6 NK細(xì)胞細(xì)胞毒活性的檢測(cè)以脾臟細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，YAC-1 細(xì)胞為靶細(xì)胞，進(jìn)行NK細(xì)胞細(xì)胞毒活性及FACS檢測(cè)，具體步驟詳見參考文獻(xiàn)[20]。

1.7 CTL抗腫瘤效應(yīng)的檢測(cè)以脾臟細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，B16F10細(xì)胞為靶細(xì)胞，進(jìn)行CTL細(xì)胞毒活性及FACS檢測(cè)，具體步驟詳見參考文獻(xiàn)[21]。

1.8 補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒活性(complement depen dent cytotoxicity，CDC)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前1 d取B16F10細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度1×106個(gè)/mL)500 μL接種于24孔板。待細(xì)胞鋪底率達(dá)到約60%～80%時(shí)加入3組細(xì)胞疫苗免疫鼠血清，分別設(shè)5、10、20、40、80和120 μL 6個(gè)梯度，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，均勻混合并置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別于0、24 h在顯微鏡下攝片，最后用胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.9 FACS檢測(cè)免疫鼠脾臟CD4+、CD8+T細(xì)胞百分比FACS檢測(cè)脾臟CD4+、CD8+T細(xì)胞百分比，具體步驟詳見參考文獻(xiàn)[20-21]。

1.10 ELISA檢測(cè)免疫鼠血清IFN-γ和TGF-β水平按照ELISA檢測(cè)試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行，詳見參考文獻(xiàn)[21]。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染B16F10細(xì)胞及穩(wěn)定感染株的篩選慢病毒重組質(zhì)粒上帶有綠色熒光蛋白基因EGFP，可通過熒光顯微鏡觀察該基因表達(dá)情況了解ROR1的表達(dá)水平。于熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染B16F10細(xì)胞72 h，此時(shí)的感染效率超過85%(圖1A)，通過極限稀釋法篩選單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株并擴(kuò)大培養(yǎng)(圖1B)。

注：A. 慢病毒感染B16F10細(xì)胞72 h；B. 篩選穩(wěn)定感染的B16F10單克隆細(xì)胞株并擴(kuò)大培養(yǎng)(分組左列為熒光顯微鏡視野，右列為光學(xué)顯微鏡視野)。圖1 慢病毒pLv-shROR1感染B16F10細(xì)胞72 h及單克隆細(xì)胞株的篩選(×200)

2.2 qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)穩(wěn)定感染株中ROR1mRNA及蛋白的表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示，與WT組和Scramble組相比，Lv-shROR1-B16F10 組ROR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著減少(均P<0.05，圖2A)。Western blotting結(jié)果顯示，與WT組和Scramble組相比，Lv-shROR1-B16F10組ROR1蛋白表達(dá)量明顯減少，灰度分析顯示 Lv-shROR1-B16F10組與其他2組相比表達(dá)量顯著減少(均P<0.05，圖2B、2C)。這說明穩(wěn)定下調(diào) ROR1 分子表達(dá)的 B16F10 細(xì)胞株構(gòu)建成功。

注：A. qRT-PCR檢測(cè)WT組和各感染組細(xì)胞ROR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量；B. Western blotting檢測(cè)各感染組細(xì)胞ROR1蛋白的表達(dá)量；C. ImageJ灰度分析統(tǒng)計(jì)分析各組Western blotting條帶灰度值。圖2 感染pLv-shROR1慢病毒的B16F10細(xì)胞ROR1 mRNA及蛋白的表達(dá)

2.3 黑色素瘤疫苗免疫鼠實(shí)驗(yàn)植瘤后嚴(yán)密監(jiān)測(cè)小鼠的出瘤時(shí)間，出瘤后每隔3 d測(cè)量1次腫瘤大小并記錄，繪制移植瘤生長曲線。結(jié)果顯示，Lv-shROR1-B16F10疫苗組小鼠腫瘤體積大于B16F10疫苗組(P=0.000 1)和Scramble疫苗組(P= 0.000 1)(圖3E)。另外，與B16F10疫苗組和Scramble疫苗組小鼠的出瘤時(shí)間相比，Lv-shROR1-B16F10 疫苗組小鼠無瘤生存時(shí)間更短(P=0.010 5,P=0.048 8,圖3C);而3組疫苗免疫鼠的體質(zhì)量相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05,圖3D)。

注：A. 荷瘤小鼠大體圖；B. 剝離瘤體外觀圖；C. 荷瘤小鼠不同時(shí)間成瘤率的比較；D. 成瘤過程中小鼠體質(zhì)量的比較；E. 荷瘤小鼠瘤體體積統(tǒng)計(jì)圖。Ⅰ為B16F10；Ⅱ?yàn)镾cramble；Ⅲ為Lv-shROR1-B16F10。圖3 不同疫苗免疫鼠拮抗黑色素瘤生長的情況

2.4 qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)各組免疫鼠腫瘤組織中ROR1mRNA及蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，與WT組和Scramble疫苗組相比，Lv-shROR1-B16F10疫苗免疫鼠瘤組織中ROR1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05，圖4A～4C)。這表明，ROR1分子表達(dá)下調(diào)后，其疫苗抑制免疫鼠體內(nèi)ROR1分子表達(dá)的能力明顯減弱，與未下調(diào)組相比，ROR1分子表達(dá)水平明顯增加。因此，根據(jù)疫苗免疫鼠的抗瘤效應(yīng)可知，腫瘤組織中ROR1分子的表達(dá)水平與黑色素瘤疫苗免疫原性強(qiáng)弱有關(guān)，即黑色素瘤細(xì)胞系B16F10中ROR1分子表達(dá)水平降低，其疫苗的免疫原性減弱，可引起機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)的減弱。

注：A. qRT-PCR檢測(cè)疫苗免疫鼠瘤組織中ROR1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量；B. Western blotting檢測(cè)疫苗免疫鼠瘤組織中ROR1蛋白的表達(dá)；C. ImageJ灰度分析統(tǒng)計(jì)各組Western blotting條帶灰度值。圖4 各疫苗免疫鼠黑色素瘤組織中ROR1 mRNA及蛋白的表達(dá)

2.5 NK細(xì)胞細(xì)胞毒活性的檢測(cè)結(jié)果顯示，Lv-shROR1-B16F10黑色素瘤免疫組NK效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的陽性率較低(圖5A)。因此，Lv-shROR1-B16F10腫瘤疫苗免疫鼠的NK細(xì)胞殺傷活性比WT組及Scramble免疫組要弱，殺傷靶細(xì)胞的百分比顯著降低(P=0.002 8，P=0.024 9，圖5B)。這說明下調(diào)ROR1分子水平能減弱疫苗免疫鼠的NK細(xì)胞細(xì)胞毒活性。

注：A. FACS檢測(cè)各疫苗免疫鼠組NK細(xì)胞殺傷活性；B. NK細(xì)胞殺傷活性FACS結(jié)果的統(tǒng)計(jì)圖。圖5 FACS檢測(cè)各疫苗免疫鼠組脾臟細(xì)胞中NK細(xì)胞殺傷活性

2.6 CTL細(xì)胞毒效應(yīng)的檢測(cè)FACS檢測(cè)結(jié)果顯示，Lv-shROR1-B16F10疫苗免疫組CTL殺傷活性最低(圖6A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.000 1，圖6B)。以上結(jié)果表明，下調(diào)ROR1分子表達(dá)可減弱疫苗免疫鼠脾臟中CTL細(xì)胞毒活性。

注：A. FACS檢測(cè)各疫苗免疫鼠組脾臟細(xì)胞中CTL的殺傷活性；B. CTL殺傷活性FACS結(jié)果的統(tǒng)計(jì)圖。圖6 各疫苗免疫鼠組脾臟細(xì)胞中CTL細(xì)胞毒活性的檢測(cè)

2.7 FACS檢測(cè)免疫鼠脾臟中CD4+和CD8+T細(xì)胞百分比結(jié)果顯示，與WT組和Scramble疫苗組相比，Lv-shROR1-B16F10疫苗免疫鼠組脾臟細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞百分比顯著降低(均P<0.000 1，圖7A、7B)。這表明，下調(diào)ROR1分子表達(dá)后，疫苗免疫鼠的免疫活性細(xì)胞(CD4+T和CD8+T細(xì)胞)數(shù)量明顯減少，可能是導(dǎo)致機(jī)體特異性殺傷效果減弱的原因之一。

注：A. FACS檢測(cè)各疫苗免疫鼠組脾臟細(xì)胞中CD4+和CD8+T細(xì)胞百分比；B. CD4+和CD8+T細(xì)胞百分比FACS結(jié)果的統(tǒng)計(jì)圖。圖7 FACS檢測(cè)各疫苗免疫鼠組脾臟細(xì)胞中CD4+和CD8+T細(xì)胞百分比

2.8 CDC實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體殺瘤活性結(jié)果顯示，經(jīng)Lv-shROR1-B16F10疫苗免疫鼠血清孵育24 h后，B16F10細(xì)胞的生存狀態(tài)良好；而加入WT組和Scramble疫苗組血清后，鏡下可見大量細(xì)胞碎片(圖8A)。同時(shí)，Lv-shROR1-B16F10疫苗免疫組血清CDC殺傷B16F10的活性相對(duì)于WT組及Scramble免疫組有差異(圖8B)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P=0.000 1，圖8C)。

注：A. 各疫苗免疫鼠組血清CDC活性(×200/×400)；B. 腫瘤細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色及計(jì)數(shù)(×100/×200)；C. 各疫苗免疫鼠組CDC活性的統(tǒng)計(jì)分析圖。圖8 各疫苗免疫鼠組血清CDC的活性

2.9 ELISA檢測(cè)免疫鼠血清中IFN-γ和TGF-β分泌水平結(jié)果顯示，與WT組和Scramble疫苗免疫組相比，Lv-shROR1-B16F10疫苗免疫鼠血清中IFN-γ分泌水平顯著降低(P=0.010 9，P=0.026 9，圖9A)。與WT組和Scramble疫苗免疫組相比，Lv-shROR1-B16F10疫苗免疫鼠血清中TGF-β分泌水平顯著升高(P=0.005 0，P=0.012 4，圖9B)。

圖9 ELISA檢測(cè)疫苗免疫鼠血清中IFN-γ和TGF-β水平

3 討論

惡性黑色素瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移擴(kuò)散是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[22]。過表達(dá)ROR1與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為此，本研究通過下調(diào)黑色素瘤細(xì)胞中ROR1分子的表達(dá)，研究黑色素瘤疫苗免疫鼠的抗瘤效應(yīng)。

通過反復(fù)凍融的方式制備腫瘤疫苗注射至C57BL/6小鼠體內(nèi)，末次免疫10 d后再用B16F10細(xì)胞攻擊免疫鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與WT組和Scramble疫苗組相比，下調(diào)B16F10細(xì)胞中ROR1分子水平后，其疫苗誘導(dǎo)的免疫活性減弱，抗腫瘤效果欠佳。其中，Lv-shROR1-B16F10疫苗組的ROR1mRNA及蛋白表達(dá)水平最高，說明下調(diào)B16F10細(xì)胞ROR1表達(dá)后，其疫苗免疫原性減弱，免疫效應(yīng)下降，導(dǎo)致對(duì)B16F10細(xì)胞所致鼠黑色素瘤細(xì)胞的殺傷作用減弱，而使瘤組織中的ROR1表達(dá)依然高位(圖4)。對(duì)NK細(xì)胞殺傷率和CTL細(xì)胞毒活性的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Lv-shROR1-B16F10疫苗組NK細(xì)胞和CTL殺傷活性低于WT組和Scramble疫苗組(圖5、6)。進(jìn)一步結(jié)果證實(shí)，Lv-shROR1-B16F10疫苗組CD4+和CD8+T細(xì)胞百分比顯著低于其他2組(圖7)。CDC活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示，Lv-shROR1-B16F10疫苗免疫組小鼠血清中抗體與靶細(xì)胞抗原結(jié)合激活補(bǔ)體系統(tǒng)殺傷B16F10細(xì)胞的能力相對(duì)于其他2組也明顯減弱，其加入免疫鼠血清后細(xì)胞生存狀態(tài)依然良好(圖8)。此外，相對(duì)其他2組，Lv-shROR1-B16F10疫苗組外周血清中IFN-γ分泌水平受到明顯抑制，而具有免疫抑制功能的TGF-β分泌水平有所升高(圖9)。以上結(jié)果均表明，下調(diào)ROR1分子表達(dá)能夠減弱黑色素瘤疫苗的免疫原性，從而使NK細(xì)胞和CTL殺傷活性均有所下降，致使疫苗誘導(dǎo)的抗瘤效應(yīng)也隨之減弱。所以，ROR1分子在黑色素瘤疫苗中抗瘤效應(yīng)的發(fā)揮中起重要作用。然而，ROR1分子僅是黑色素瘤疫苗中的優(yōu)勢(shì)抗原之一，經(jīng)反復(fù)凍融的疫苗中包含了大量的優(yōu)勢(shì)蛋白，它們?cè)谄渲邪l(fā)揮的免疫效應(yīng)及機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

總之，鼠源黑色素瘤全細(xì)胞疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，達(dá)到拮抗腫瘤的作用。其疫苗的優(yōu)勢(shì)在于含高免疫原性的優(yōu)勢(shì)抗原ROR1分子，可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫效應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和存活。然而，下調(diào)ROR1表達(dá)導(dǎo)致黑色素瘤疫苗免疫活性減弱而影響免疫鼠抗瘤效應(yīng)，這說明ROR1是黑色素瘤疫苗的重要靶點(diǎn)。但對(duì)上調(diào)B16F10細(xì)胞ROR1表達(dá)是否能增強(qiáng)該疫苗的抗瘤效應(yīng)等問題，尚待探究，以便為該疫苗防治黑色素瘤提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。