王玲，梅峰，薛蕊，李淼，徐慧，趙楓姝，竇駿

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，南京 210009)

黑色素瘤是一類高度異質(zhì)性的腫瘤，其發(fā)病率和死亡率近年來持續(xù)上升，晚期黑色素瘤患者的10年生存率僅為10%～25%[1-2]。盡管傳統(tǒng)的放化療、免疫調(diào)節(jié)藥物和靶向治療在臨床試驗中取得了令人鼓舞的成果，但患者易產(chǎn)生耐藥性，造成疾病復(fù)發(fā)。而腫瘤異質(zhì)性可能是黑色素瘤靶向治療耐藥的重要原因之一[3-7]。為克服耐藥并有效治療黑色素瘤，亟需尋求新的治療方法。

受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1， ROR1)是單次跨膜受體酪氨酸激酶，可促進腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移，是疾病診斷的標志物之一，也是腫瘤治療的理想靶點之一[8-11]。近年來，已有文獻報道ROR與許多血液和實體惡性腫瘤的形成有關(guān)，如淋巴細胞白血病[12-13]、卵巢癌[14-16]、乳腺癌[17]以及肺癌[18]等。但關(guān)于ROR在惡性黑色素瘤中的研究報道相對較少。因此，本研究以鼠源黑色素瘤細胞系B16F10為研究對象，用慢病毒載體介導(dǎo)shRNA下調(diào)ROR1分子的表達，通過腫瘤疫苗免疫C57BL/6小鼠實驗，觀察下調(diào)ROR1分子表達后免疫鼠的免疫活性和抗瘤效應(yīng)，并初步探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象黑色素瘤B16F10細胞系，購自中國科學(xué)院細胞庫；293T、YAC-1、Scramble和Lv-shROR1-B16F10細胞，由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系竇駿課題組保存并提供。SPF級雌性C57BL/6小鼠，15只，6～8周齡，體質(zhì)量約16 g，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.3 細胞的培養(yǎng)將B16F10、Scramble和Lv-shROR1-B16F10細胞重懸于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 慢病毒的包裝及感染將慢病毒重組質(zhì)粒pHBLV-U6-shROR1-ZGreen和pHBLV-U6-shNC-ZGreen分別與psPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細胞48和72 h后收集病毒上清液，4 ℃、96 010×g離心4 h(超速離心法)濃縮病毒，后檢測其滴度；再感染B16F10細胞，具體操作詳見參考文獻[19]，得到的細胞分別命名為Lv-shROR1-B16F10和Scramble；隨后通過qRT-PCR和Western blotting驗證ROR1分子的下調(diào)情況。

1.5 黑色素瘤疫苗免疫鼠實驗分別將B16F10、Scramble和Lv-shROR1-B16F10 3組(每組5只小鼠)細胞的密度調(diào)整至5×106個/mL，于-80 ℃條件冷凍30 min，再于37 ℃水浴鍋水溶15 min，反復(fù)凍融3次制備成疫苗后皮下免疫小鼠3次，每次間隔10 d;末次免疫10 d后于小鼠背部皮下注射野生型(wild type, WT)B16F10細胞(1×106個/只)。定期測量移植瘤大小，計算腫瘤體積并記錄其變化(V=ab2/2, a為長徑， b為短徑)，于第43 d統(tǒng)一剝離瘤體。用qRT-PCR 和Western blotting分別檢測各組免疫鼠瘤組織中ROR1mRNA及蛋白表達情況。

1.6 NK細胞細胞毒活性的檢測以脾臟細胞為效應(yīng)細胞，YAC-1 細胞為靶細胞，進行NK細胞細胞毒活性及FACS檢測，具體步驟詳見參考文獻[20]。

1.7 CTL抗腫瘤效應(yīng)的檢測以脾臟細胞為效應(yīng)細胞，B16F10細胞為靶細胞，進行CTL細胞毒活性及FACS檢測，具體步驟詳見參考文獻[21]。

1.8 補體依賴的細胞毒活性(complement depen dent cytotoxicity，CDC)的檢測實驗前1 d取B16F10細胞懸液(細胞密度1×106個/mL)500 μL接種于24孔板。待細胞鋪底率達到約60%～80%時加入3組細胞疫苗免疫鼠血清，分別設(shè)5、10、20、40、80和120 μL 6個梯度，每個梯度設(shè)3個復(fù)孔，均勻混合并置37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別于0、24 h在顯微鏡下攝片，最后用胰蛋白酶消化各組細胞，臺盼藍染色，活細胞計數(shù)。

1.9 FACS檢測免疫鼠脾臟CD4+、CD8+T細胞百分比FACS檢測脾臟CD4+、CD8+T細胞百分比，具體步驟詳見參考文獻[20-21]。

1.10 ELISA檢測免疫鼠血清IFN-γ和TGF-β水平按照ELISA檢測試劑盒說明書的操作步驟進行，詳見參考文獻[21]。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染B16F10細胞及穩(wěn)定感染株的篩選慢病毒重組質(zhì)粒上帶有綠色熒光蛋白基因EGFP，可通過熒光顯微鏡觀察該基因表達情況了解ROR1的表達水平。于熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染B16F10細胞72 h，此時的感染效率超過85%(圖1A)，通過極限稀釋法篩選單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株并擴大培養(yǎng)(圖1B)。

注：A. 慢病毒感染B16F10細胞72 h；B. 篩選穩(wěn)定感染的B16F10單克隆細胞株并擴大培養(yǎng)(分組左列為熒光顯微鏡視野，右列為光學(xué)顯微鏡視野)。圖1 慢病毒pLv-shROR1感染B16F10細胞72 h及單克隆細胞株的篩選(×200)

2.2 qRT-PCR和Western blotting檢測穩(wěn)定感染株中ROR1mRNA及蛋白的表達qRT-PCR結(jié)果顯示，與WT組和Scramble組相比，Lv-shROR1-B16F10 組ROR1 mRNA相對表達量顯著減少(均P<0.05，圖2A)。Western blotting結(jié)果顯示，與WT組和Scramble組相比，Lv-shROR1-B16F10組ROR1蛋白表達量明顯減少，灰度分析顯示 Lv-shROR1-B16F10組與其他2組相比表達量顯著減少(均P<0.05，圖2B、2C)。這說明穩(wěn)定下調(diào) ROR1 分子表達的 B16F10 細胞株構(gòu)建成功。

注：A. qRT-PCR檢測WT組和各感染組細胞ROR1 mRNA相對表達量；B. Western blotting檢測各感染組細胞ROR1蛋白的表達量；C. ImageJ灰度分析統(tǒng)計分析各組Western blotting條帶灰度值。圖2 感染pLv-shROR1慢病毒的B16F10細胞ROR1 mRNA及蛋白的表達

2.3 黑色素瘤疫苗免疫鼠實驗植瘤后嚴密監(jiān)測小鼠的出瘤時間，出瘤后每隔3 d測量1次腫瘤大小并記錄，繪制移植瘤生長曲線。結(jié)果顯示，Lv-shROR1-B16F10疫苗組小鼠腫瘤體積大于B16F10疫苗組(P=0.000 1)和Scramble疫苗組(P= 0.000 1)(圖3E)。另外，與B16F10疫苗組和Scramble疫苗組小鼠的出瘤時間相比，Lv-shROR1-B16F10 疫苗組小鼠無瘤生存時間更短(P=0.010 5,P=0.048 8,圖3C);而3組疫苗免疫鼠的體質(zhì)量相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05,圖3D)。

注：A. 荷瘤小鼠大體圖；B. 剝離瘤體外觀圖；C. 荷瘤小鼠不同時間成瘤率的比較；D. 成瘤過程中小鼠體質(zhì)量的比較；E. 荷瘤小鼠瘤體體積統(tǒng)計圖。Ⅰ為B16F10；Ⅱ為Scramble；Ⅲ為Lv-shROR1-B16F10。圖3 不同疫苗免疫鼠拮抗黑色素瘤生長的情況

2.4 qRT-PCR和Western blotting檢測各組免疫鼠腫瘤組織中ROR1mRNA及蛋白的表達結(jié)果顯示，與WT組和Scramble疫苗組相比，Lv-shROR1-B16F10疫苗免疫鼠瘤組織中ROR1 mRNA和蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05，圖4A～4C)。這表明，ROR1分子表達下調(diào)后，其疫苗抑制免疫鼠體內(nèi)ROR1分子表達的能力明顯減弱，與未下調(diào)組相比，ROR1分子表達水平明顯增加。因此，根據(jù)疫苗免疫鼠的抗瘤效應(yīng)可知，腫瘤組織中ROR1分子的表達水平與黑色素瘤疫苗免疫原性強弱有關(guān)，即黑色素瘤細胞系B16F10中ROR1分子表達水平降低，其疫苗的免疫原性減弱，可引起機體抗腫瘤效應(yīng)的減弱。

注：A. qRT-PCR檢測疫苗免疫鼠瘤組織中ROR1 mRNA的相對表達量；B. Western blotting檢測疫苗免疫鼠瘤組織中ROR1蛋白的表達；C. ImageJ灰度分析統(tǒng)計各組Western blotting條帶灰度值。圖4 各疫苗免疫鼠黑色素瘤組織中ROR1 mRNA及蛋白的表達

2.5 NK細胞細胞毒活性的檢測結(jié)果顯示，Lv-shROR1-B16F10黑色素瘤免疫組NK效應(yīng)細胞殺傷靶細胞的陽性率較低(圖5A)。因此，Lv-shROR1-B16F10腫瘤疫苗免疫鼠的NK細胞殺傷活性比WT組及Scramble免疫組要弱，殺傷靶細胞的百分比顯著降低(P=0.002 8，P=0.024 9，圖5B)。這說明下調(diào)ROR1分子水平能減弱疫苗免疫鼠的NK細胞細胞毒活性。

注：A. FACS檢測各疫苗免疫鼠組NK細胞殺傷活性；B. NK細胞殺傷活性FACS結(jié)果的統(tǒng)計圖。圖5 FACS檢測各疫苗免疫鼠組脾臟細胞中NK細胞殺傷活性

2.6 CTL細胞毒效應(yīng)的檢測FACS檢測結(jié)果顯示，Lv-shROR1-B16F10疫苗免疫組CTL殺傷活性最低(圖6A)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.000 1，圖6B)。以上結(jié)果表明，下調(diào)ROR1分子表達可減弱疫苗免疫鼠脾臟中CTL細胞毒活性。

注：A. FACS檢測各疫苗免疫鼠組脾臟細胞中CTL的殺傷活性；B. CTL殺傷活性FACS結(jié)果的統(tǒng)計圖。圖6 各疫苗免疫鼠組脾臟細胞中CTL細胞毒活性的檢測

2.7 FACS檢測免疫鼠脾臟中CD4+和CD8+T細胞百分比結(jié)果顯示，與WT組和Scramble疫苗組相比，Lv-shROR1-B16F10疫苗免疫鼠組脾臟細胞中CD4+T細胞和CD8+T細胞百分比顯著降低(均P<0.000 1，圖7A、7B)。這表明，下調(diào)ROR1分子表達后，疫苗免疫鼠的免疫活性細胞(CD4+T和CD8+T細胞)數(shù)量明顯減少，可能是導(dǎo)致機體特異性殺傷效果減弱的原因之一。

注：A. FACS檢測各疫苗免疫鼠組脾臟細胞中CD4+和CD8+T細胞百分比；B. CD4+和CD8+T細胞百分比FACS結(jié)果的統(tǒng)計圖。圖7 FACS檢測各疫苗免疫鼠組脾臟細胞中CD4+和CD8+T細胞百分比

2.8 CDC實驗檢測抗體殺瘤活性結(jié)果顯示，經(jīng)Lv-shROR1-B16F10疫苗免疫鼠血清孵育24 h后，B16F10細胞的生存狀態(tài)良好；而加入WT組和Scramble疫苗組血清后，鏡下可見大量細胞碎片(圖8A)。同時，Lv-shROR1-B16F10疫苗免疫組血清CDC殺傷B16F10的活性相對于WT組及Scramble免疫組有差異(圖8B)，且有統(tǒng)計學(xué)意義(均P=0.000 1，圖8C)。

注：A. 各疫苗免疫鼠組血清CDC活性(×200/×400)；B. 腫瘤細胞臺盼藍染色及計數(shù)(×100/×200)；C. 各疫苗免疫鼠組CDC活性的統(tǒng)計分析圖。圖8 各疫苗免疫鼠組血清CDC的活性

2.9 ELISA檢測免疫鼠血清中IFN-γ和TGF-β分泌水平結(jié)果顯示，與WT組和Scramble疫苗免疫組相比，Lv-shROR1-B16F10疫苗免疫鼠血清中IFN-γ分泌水平顯著降低(P=0.010 9，P=0.026 9，圖9A)。與WT組和Scramble疫苗免疫組相比，Lv-shROR1-B16F10疫苗免疫鼠血清中TGF-β分泌水平顯著升高(P=0.005 0，P=0.012 4，圖9B)。

圖9 ELISA檢測疫苗免疫鼠血清中IFN-γ和TGF-β水平

3 討論

惡性黑色素瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移擴散是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[22]。過表達ROR1與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為此，本研究通過下調(diào)黑色素瘤細胞中ROR1分子的表達，研究黑色素瘤疫苗免疫鼠的抗瘤效應(yīng)。

通過反復(fù)凍融的方式制備腫瘤疫苗注射至C57BL/6小鼠體內(nèi)，末次免疫10 d后再用B16F10細胞攻擊免疫鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與WT組和Scramble疫苗組相比，下調(diào)B16F10細胞中ROR1分子水平后，其疫苗誘導(dǎo)的免疫活性減弱，抗腫瘤效果欠佳。其中，Lv-shROR1-B16F10疫苗組的ROR1mRNA及蛋白表達水平最高，說明下調(diào)B16F10細胞ROR1表達后，其疫苗免疫原性減弱，免疫效應(yīng)下降，導(dǎo)致對B16F10細胞所致鼠黑色素瘤細胞的殺傷作用減弱，而使瘤組織中的ROR1表達依然高位(圖4)。對NK細胞殺傷率和CTL細胞毒活性的檢測發(fā)現(xiàn)，Lv-shROR1-B16F10疫苗組NK細胞和CTL殺傷活性低于WT組和Scramble疫苗組(圖5、6)。進一步結(jié)果證實，Lv-shROR1-B16F10疫苗組CD4+和CD8+T細胞百分比顯著低于其他2組(圖7)。CDC活性檢測實驗顯示，Lv-shROR1-B16F10疫苗免疫組小鼠血清中抗體與靶細胞抗原結(jié)合激活補體系統(tǒng)殺傷B16F10細胞的能力相對于其他2組也明顯減弱，其加入免疫鼠血清后細胞生存狀態(tài)依然良好(圖8)。此外，相對其他2組，Lv-shROR1-B16F10疫苗組外周血清中IFN-γ分泌水平受到明顯抑制，而具有免疫抑制功能的TGF-β分泌水平有所升高(圖9)。以上結(jié)果均表明，下調(diào)ROR1分子表達能夠減弱黑色素瘤疫苗的免疫原性，從而使NK細胞和CTL殺傷活性均有所下降，致使疫苗誘導(dǎo)的抗瘤效應(yīng)也隨之減弱。所以，ROR1分子在黑色素瘤疫苗中抗瘤效應(yīng)的發(fā)揮中起重要作用。然而，ROR1分子僅是黑色素瘤疫苗中的優(yōu)勢抗原之一，經(jīng)反復(fù)凍融的疫苗中包含了大量的優(yōu)勢蛋白，它們在其中發(fā)揮的免疫效應(yīng)及機制還需進一步探索。

總之，鼠源黑色素瘤全細胞疫苗能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，達到拮抗腫瘤的作用。其疫苗的優(yōu)勢在于含高免疫原性的優(yōu)勢抗原ROR1分子，可激發(fā)機體產(chǎn)生強烈的免疫效應(yīng)，抑制腫瘤細胞的生長和存活。然而，下調(diào)ROR1表達導(dǎo)致黑色素瘤疫苗免疫活性減弱而影響免疫鼠抗瘤效應(yīng)，這說明ROR1是黑色素瘤疫苗的重要靶點。但對上調(diào)B16F10細胞ROR1表達是否能增強該疫苗的抗瘤效應(yīng)等問題，尚待探究，以便為該疫苗防治黑色素瘤提供可靠的實驗依據(jù)。