李成潔，陳健，吳勇，陳愛鸞，沈伯雄

(1. 海南西部中心醫(yī)院 麻醉科，儋州 571700；2. 上海第九人民醫(yī)院 麻醉科，上海 200011)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是臨床病情危重患者的常見并發(fā)癥[1]。2018年美國重癥醫(yī)學(xué)會(huì)公布的危重患者管理方案建議，對(duì)此類患者應(yīng)盡量減少連續(xù)或間歇性鎮(zhèn)靜[2]。然而，對(duì)患?xì)獾肋^敏危重病的患者，需要使用鎮(zhèn)靜劑擴(kuò)張支氣管并盡量減少其應(yīng)激反應(yīng)。異丙酚是最常用的靜脈麻醉藥物之一，主要用于麻醉的誘導(dǎo)和維持以及重癥監(jiān)護(hù)室的鎮(zhèn)靜治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)異丙酚具有抑炎作用，如抑制單核/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的免疫活性，抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生并減少一氧化氮的生物合成[3-4]。這一抑炎特性可能有利于危重患者ALI病情的緩解。然而，異丙酚發(fā)揮抑炎作用的機(jī)制尚不清楚。線粒體來源的N-甲酰化肽在組織或細(xì)胞損傷后迅速被釋放；該分子是強(qiáng)化學(xué)誘導(dǎo)劑，能夠激活甲?；氖荏w1(formyl peptide receptor 1，F(xiàn)PR1)并觸發(fā)免疫細(xì)胞的多種功能，包括趨化、脫顆粒、活性氧類生成和吞噬作用，引發(fā)和加重炎癥反應(yīng)[5]。以往研究表明，異丙酚是N-甲?；牡母偁幮砸种苿?，通過阻斷FPR1發(fā)揮作用，但尚不清楚異丙酚是否通過阻斷FPR1改善危重患者的ALI病情[6]。本研究中，我們假設(shè)異丙酚通過抑制內(nèi)源性N-甲酰化肽誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)改善危重癥患者的肺部損傷。為驗(yàn)證該假設(shè)，研究探討了異丙酚在膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠模型中的保護(hù)作用，并通過體外試驗(yàn)觀察異丙酚對(duì)FPR1激動(dòng)劑誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞活化的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 樣本、材料、藥品、試劑與儀器12例健康體檢受試者靜脈血，采集自海南西部中心醫(yī)院。SPF級(jí)BALB/c小鼠(40只，雄性，體質(zhì)量20～25 g，7～8周齡)，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。異丙酚粉末(2，6-二異丙基苯酚)，購自Sigma-Aldrich公司。兔抗鼠磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、磷酸化p38促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)抗體和山羊抗兔IgG-HRP二抗，均購自CST公司。兔抗鼠FPR1和Ly6G抗體，購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。TNF-α、CXCL1、IL-1β和IL-6 ELISA檢測試劑盒及N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLF，F(xiàn)PR1激動(dòng)劑)，購自R&D SYSTEMS公司。N-甲氧基琥珀酰-丙酰氨-丙酰氨-脯酰氨-纈氨酸對(duì)硝基酰苯胺[L-Valinamide， N-(4-methoxy-1， 4-dioxobutyl)-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-N-(4-nitrophenyl)， N-Methoxysuccinyl-ala-ala-pro-val4-nitroanilide]，購自Tocris Bioscience公司。Western blotting檢測試劑，購自安瑪西亞中國有限公司。所有其他試劑均購自Sigma-Aldrich公司。BX51顯微鏡，來自奧林巴斯(中國)有限公司；UV-2700雙光束紫外分光光度計(jì)，來自島津公司。

1.2 小鼠LPS誘導(dǎo)膿毒癥模型的建立于25 ℃恒溫環(huán)境飼養(yǎng)小鼠，自由飲食飲水并給予12 h/12 h晝夜明暗交替。適應(yīng)性飼養(yǎng)小鼠1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：1組為用50 μL 10% 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)處理的假手術(shù)(sham)小鼠；2組為用50 μL異丙酚(40 mg/kg)處理的假手術(shù)小鼠；3組為用50 μL 10% DMSO處理的膿毒癥小鼠；4組為用50 μL異丙酚(40 mg/kg)處理的膿毒癥小鼠。將異丙酚粉末溶解于DMSO，后用生理鹽水稀釋。模型組小鼠每隔30 min腹腔注射1次DMSO或異丙酚，共治療3次。第2次注射DMSO或異丙酚后，經(jīng)腹腔單次注射200 μL LPS(10 mg/kg，提取自大腸埃希菌，血清型：O111：B4)或相同體積0.9%生理鹽水(假手術(shù)組)。膿毒癥模型鼠于注射LPS后20 h處死。固定小鼠，取右肺上葉2段于10%中性福爾馬林中固定；制備石蠟組織塊并切5 μm薄片，進(jìn)行H-E和免疫組織化學(xué)染色。在生存研究中，每組設(shè)6只小鼠，膿毒癥小鼠接受單劑量200 μL LPS(10 mg/kg)腹腔注射建模，同時(shí)治療組給予腹腔注射50 μL異丙酚(設(shè)2個(gè)劑量：20或40 mg/kg)，連續(xù)監(jiān)測7 d并統(tǒng)計(jì)小鼠的生存率。

1.3 H-E和免疫組織化學(xué)染色石蠟切片常規(guī)脫蠟，用3%過氧化氫孵育10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶。于室溫條件用山羊血清封閉切片15 min，后用蒸餾水和PBS各漂洗3次。于4 ℃條件下用抗FPR1抗體(1∶150)、抗Ly6G抗體(1∶150)過夜孵育切片，后用PBS漂洗2次。于室溫條件下將切片與山羊抗兔IgG-HRP抗體(1∶500)共孵育20 min。PBS漂洗3次后，用二氨基聯(lián)苯胺染色，蘇木精復(fù)染。在BX51顯微鏡下觀察切片及攝片，并用Image Pro Plus v6.0分析圖像。

1.4 各組小鼠肺組織MPO活性的測定研究以肺組織中MPO活性作為中性粒細(xì)胞聚積數(shù)的衡量指標(biāo)，用于評(píng)估肺組織中中性粒細(xì)胞的浸潤情況。使用玻璃勻漿器在冷藏的pH值7.4的磷酸鉀緩沖溶液中勻漿肺組織(使質(zhì)量體積濃度為10%)。于4 ℃條件下以10 000×g離心勻漿20 min，收集上清液。使用MPO測定試劑盒評(píng)估肺組織中MPO的活性。所有步驟均按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的分析于室溫條件下向分離自每只大鼠的左肺支氣管中注射0.5 mL PBS，反復(fù)抽吸3次后，收集BALF，重復(fù)操作3次，保證每次樣本回收率超過80%。于4 ℃條件下按1 200×g離心BALF 10 min。將上清液分成小份(0.1 mL/份)，并于-70 ℃條件下保存，以便通過ELISA批量分析樣本。使用小鼠TNF-α、CXCL1、IL-1β和IL-6 ELISA檢測試劑盒檢測BALF樣本中TNF-α、CXCL1、IL-1β和IL-6水平。

1.6 人中性粒細(xì)胞樣本的制備自20～30歲健康受試者捐獻(xiàn)的肝素化靜脈血(每位受試者取50 mL外周血)分離人中性粒細(xì)胞(受試者于采血前1周內(nèi)未報(bào)告有全身性疾病)。根據(jù)文獻(xiàn)[7]報(bào)道的方法分離人中性粒細(xì)胞。采用Ficoll密度梯度離心法離心血液樣本，用低滲溶血法去除混雜的紅細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)前，將分離的中性粒細(xì)胞懸浮于pH值7.4的含Ca2+Hank＇s平衡鹽溶液中，于4 ℃條件下保存。通過瑞氏-吉姆薩染色確定中性粒細(xì)胞懸液的純度，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定得細(xì)胞存活率>98%。

1.7 人中性粒細(xì)胞超氧陰離子釋放的檢測本研究使用可被超氧化物還原的鐵細(xì)胞色素c評(píng)估人中性粒細(xì)胞中的超氧化物釋放情況。將分離的中性粒細(xì)胞懸液(6×105個(gè)/mL)接種于含鐵細(xì)胞色素c(0.5 mg/mL)和CaCl2(1 mmol/L)的Hank＇s平衡鹽溶液中，添加DMSO或異丙酚(5～100 μmol/L)處理5 min。然后加入fMLF(30 nmol/L)活化中性粒細(xì)胞。用UV-2700雙光束紫外分光光度計(jì)連續(xù)監(jiān)測鐵細(xì)胞色素c還原引起的光密度[D(550 nm)]值的變化。超氧化物釋放量的計(jì)算公式為：超氧化物釋放量=[D(550 nm)含超氧化物歧化酶(100 U/mL)的反應(yīng)-D(550 nm)無超氧化物歧化酶的反應(yīng)]/ε還原形式鐵細(xì)胞色素c的消光系數(shù)[8]。

1.8 人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶釋放的檢測本研究通過檢測彈性蛋白酶釋放評(píng)估活化中性粒細(xì)胞的脫顆粒情況。以N-甲氧基琥珀酰-丙酰氨-丙酰氨-脯酰氨-纈氨酸對(duì)硝基酰苯胺為彈性蛋白酶底物，將人中性粒細(xì)胞懸液(6×105個(gè)/mL)與底物(0.1 mmol/L)加入含CaCl2(1 mmol/L)的Hank＇s平衡鹽溶液中，添加DMSO或異丙酚(5～100 μmol/L)處理5 min，然后加入fMLF(30 nmol/L)活化中性粒細(xì)胞。使用UV-2700雙光束紫外分光光度計(jì)連續(xù)監(jiān)測D(405 nm)值的變化[8]。

1.9 Western blotting檢測人中性粒細(xì)胞MAPK信號(hào)通路蛋白的表達(dá)用10%DMSO或異丙酚(50 μmol/L)處理人中性粒細(xì)胞5 min，添加fMLF(30 nmol/L)激動(dòng)30 s，后將細(xì)胞置于冰上終止反應(yīng)。于培養(yǎng)液中加入含有NaCl(100 mmol/L)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)(1 mmol/L)、HEPES(50 mmol/L、pH值7.4)、Na3VO4(釩酸鈉，2 mmol/L)、對(duì)硝基苯基磷酸酯(10 mmol/L)、5% 2-巰基乙醇、苯甲磺酰氟化物(1 mmol/L)、1%蛋白酶抑制劑和1% Triton X-100的裂解緩沖液。于冰浴中采用超聲波細(xì)胞破碎儀勻漿細(xì)胞，具體為超聲5 s，停3 s，如此循環(huán)3～5次。于4 ℃條件下14 000×g離心20 min，收集上清液。通過SDS-PAGE將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(nitrocellulose, NC)膜上，后用5%脫脂奶粉溶液封閉膜2 h，共孵育NC膜與山羊抗兔IgG-HRP。將Western blotting系統(tǒng)添加至NC膜，使用ImageJ軟件分析條帶灰度。

2 結(jié)果

2.1 異丙酚減輕膿毒癥小鼠ALI并提高其存活率H-E染色結(jié)果顯示，膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的病理改變?nèi)绶嗡[、肺泡出血、肺泡壁增厚和炎癥細(xì)胞浸潤；然而，腹腔注射異丙酚緩解了肺組織的上述病理改變。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，膿毒癥增加了小鼠肺組織FPR1和Ly6G蛋白表達(dá)，表明中性粒細(xì)胞浸潤增加，而腹腔注射異丙酚可有效減少肺部因炎癥引起的中性粒細(xì)胞浸潤增加(圖1B、1C)。此外，MPO活性是中性粒細(xì)胞浸潤程度的定量指標(biāo)，在膿毒癥小鼠的肺組織中顯著增加(P<0.001，圖1D)；腹腔注射異丙酚則顯著抑制了膿毒癥小鼠肺部MPO活性的升高(P<0.01，圖1D)。生存研究中，LPS注射后3 d內(nèi)，本組小鼠存活率為0(圖1E)。相比之下，LPS注射后87.5%(7/8)接受異丙酚(40 mg/kg)治療的小鼠存活時(shí)間達(dá)7 d(圖1E)。

注：A. 各組小鼠肺組織H-E染色(×200)；B. 各組小鼠免疫組織化學(xué)染色分析肺組織中FPR1蛋白表達(dá)水平(×200)；C. 各組小鼠免疫組織化學(xué)染色分析肺組織中Ly6G蛋白表達(dá)水平(×400)；D. 各組小鼠肺組織中MPO活性的測定；E. 各組小鼠的Kaplan-Meier生存曲線分析。與假手術(shù)組相比，***P<0.001；與LPS組相比，##P<0.01。圖1 異丙酚對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)ALI小鼠肺部損傷及存活率的影響

表1 異丙酚對(duì)膿毒癥小鼠ALI模型BALF中炎性因子水平的影響

2.2 異丙酚抑制小鼠BALF中炎性因子的表達(dá)膿毒癥小鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL1表達(dá)水平顯著增加(均P<0.01)，而腹腔注射異丙酚顯著抑制了膿毒癥小鼠BALF中上述細(xì)胞因子表達(dá)水平的升高(均P<0.05)。

2.3 異丙酚抑制fMLF誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和超氧化物的釋放中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的超氧陰離子和彈性蛋白酶是殺死病原體的重要成分，其中涉及許多病理反應(yīng)[9]。研究評(píng)估了異丙酚對(duì)中性粒細(xì)胞胞外彈性蛋白酶活化和超氧陰離子釋放的影響。結(jié)果表明，異丙酚(5～100 μmol/L)劑量依賴性地降低彈性蛋白酶活性和超氧化物釋放(均P<0.05，表2)。此外，異丙酚預(yù)處理使fMLF釋放彈性蛋白酶和產(chǎn)生超氧陰離子的濃度響應(yīng)曲線右移(圖2A、2B)，提示異丙酚可能是FPR1的抑制劑。

表2 異丙酚對(duì)fMLF誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性和超氧化物釋放的影響

注：A. 異丙酚對(duì)fMLF作用下中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性的影響；B. 異丙酚對(duì)fMLF作用下中性粒細(xì)胞超氧化物釋放量的影響。與DMSO組相比，**P<0.01，***P<0.001。圖2 異丙酚對(duì)fMLF作用下中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性及超氧化物釋放的影響

2.4 異丙酚抑制fMLF誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞MAPK信號(hào)通路蛋白磷酸化水平MAPK信號(hào)途徑參與了FPR1下游信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。Western blotting檢測結(jié)果示異丙酚顯著減少了fMLF誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞ERK、p38 MAPK和JNK磷酸化水平(均P<0.001,圖3)。

注：A. 各組人中性粒細(xì)胞ERK、p38 MAPK和JNK磷酸化蛋白表達(dá)的Western blotting分析圖；B. 各組人中性粒細(xì)胞ERK、p38 MAPK和JNK磷酸化水平的定量分析。與空白對(duì)照組相比，***P<0.001；與fMLF組相比，###P<0.001。圖3 Western blotting檢測異丙酚對(duì)fMLF誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞ERK、p38 MAPK和JNK磷酸化水平的影響

3 討論

異丙酚常用于危重癥患者的鎮(zhèn)靜治療。許多臨床試驗(yàn)表明，異丙酚具有良好的抗氧化、抑炎、抗自由基等生物學(xué)作用[3-4]。據(jù)報(bào)道，異丙酚能有效降低患者術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率，維持機(jī)體適當(dāng)?shù)难鲃?dòng)力學(xué)狀態(tài)，縮短患者重癥監(jiān)護(hù)病房的住院時(shí)間并提高大手術(shù)或心肺轉(zhuǎn)流術(shù)患者的肺順應(yīng)性[11-12]。然而，異丙酚保護(hù)作用的詳細(xì)分子機(jī)制仍不完全清楚。本研究中，異丙酚治療顯著改善了膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥反應(yīng)和組織病理學(xué)改變，減少了肺部FPR1蛋白水平及中性粒細(xì)胞浸潤。結(jié)果表明，異丙酚對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠肺部的保護(hù)作用可能與抑制FPR1上調(diào)有關(guān)。

越來越多的證據(jù)表明，中性粒細(xì)胞的積聚和活化是ALI的1個(gè)關(guān)鍵過程[13]。激活的人中性粒細(xì)胞可能通過增加炎癥介質(zhì)釋放加重肺組織損傷，從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙和氣道重塑[14]。多種炎性介質(zhì)，包括TNF-α、IL-1β和趨化因子，已被證明在ALI病程中參與上皮和內(nèi)皮屏障的破壞。TNF-α、IL-1β、IL-6和CXC趨化因子家族的釋放與中性粒細(xì)胞募集相關(guān)，并與ALI的嚴(yán)重程度和死亡率相關(guān)[15]。本研究中，異丙酚的應(yīng)用可顯著減少小鼠肺部炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，與其他顯示異丙酚在各種體內(nèi)外模型中具有抑炎作用的結(jié)論一致[16-17]。進(jìn)一步的研究中，筆者發(fā)現(xiàn)異丙酚減少了膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠肺部Ly6G蛋白水平，并且體外試驗(yàn)證明了其通過阻斷FPR1抑制了fMLF誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞激活。FPR1是G蛋白偶聯(lián)的7種跨膜受體之一，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[18]。N-甲酰肽由細(xì)菌產(chǎn)生，或釋放自損傷的線粒體，可通過與FPR1的結(jié)合刺激免疫細(xì)胞觸發(fā)炎癥反應(yīng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，來自肝細(xì)胞線粒體的N-甲酰化肽作用于FPR1以觸發(fā)趨化反應(yīng)并誘導(dǎo)呼吸爆發(fā)[19]。線粒體產(chǎn)生的N-甲?；目杉せ钪行粤＜?xì)胞，在Ca2+和ERK的作用下釋放基質(zhì)金屬蛋白酶9和IL-8，并在肺組織中誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[20]。fMLF是1種釋放自受損細(xì)胞線粒體的衍生的N-甲酰化肽，趨化FPR陽性白細(xì)胞向炎癥部位浸潤，參與誘導(dǎo)組織的早期損傷。本研究通過fMLF檢測FPR1相關(guān)的中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)情況。結(jié)果表明，異丙酚對(duì)fMLF激活的人中性粒細(xì)胞的超氧陰離子生成和彈性蛋白酶釋放均有明顯的抑制作用，表明異丙酚通過抑制中性粒細(xì)胞激活發(fā)揮抑炎作用。

此外，p38和ERK-MAPK是FPR1信號(hào)通路的下游介質(zhì)，它們在FPR1激動(dòng)劑作用于中性粒細(xì)胞時(shí)被強(qiáng)烈激活[21]。在小鼠膿毒癥模型中，p38激活促進(jìn)中性粒細(xì)胞的趨化性遷移；MAPK ERK/JNK激活誘發(fā)肺部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺損傷[18]。本研究通過Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，異丙酚降低了fMLF誘導(dǎo)的ERK、p38和JNK磷酸化水平。上述結(jié)果表明，異丙酚可直接干擾fMLF與FPR1的相互作用，阻斷下游信號(hào)通路，從而有效降低fMLF誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)水平。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，在以膿毒癥為特征的小鼠ALI模型中，異丙酚給藥改善了其肺功能，減輕了肺損傷，并下調(diào)了FPR1和Ly6G表達(dá)。進(jìn)一步體外試驗(yàn)證實(shí)，異丙酚對(duì)fMLF誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞活化的抑制作用是通過與FPR1結(jié)合介導(dǎo)的，具體是抑制了FPR1下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎癥反應(yīng)發(fā)生，如超氧化物和彈性蛋白酶的釋放。因此，異丙酚可能對(duì)治療患有膿毒癥和膿毒癥相關(guān)ALI的重癥患者有實(shí)用價(jià)值。