孫 科，耿鳳英，于秋菊，馮希勇

（徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥品食品學(xué)院，江蘇 徐州 221006）

牛蒡（Arctium lappcL.）屬菊科（Compositae）牛蒡?qū)僦参铮且环N典型的藥食同源植物[1]，具有降血壓、降血脂、抗病毒、抗腫瘤等作用[2]。牛蒡口味獨(dú)特，是東南亞特別是日本人喜愛的餐桌佳品，甚至有“東洋參”之說(shuō)[3]。牛蒡主要分布在溫?zé)釒У貐^(qū)，我國(guó)大部分地區(qū)都可種植[4]，目前，江蘇省徐州市種植面積最多，大約占全國(guó)種植面積的70%。隨著牛蒡產(chǎn)量增加，化學(xué)肥料和農(nóng)藥大規(guī)模使用，造成牛蒡品質(zhì)下降、土壤板結(jié)、生態(tài)環(huán)境破壞[5]。生物有機(jī)肥可以改變上述弊端，其中含有固氮菌、解磷菌、解鉀菌、生防菌等，由于大量的益生菌的存在既能促進(jìn)牛蒡?qū)、P、K等營(yíng)養(yǎng)的吸收又能抵御病蟲害的侵襲，提高了產(chǎn)品品質(zhì)，改善了環(huán)境。近年來(lái)，生物有機(jī)肥成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的研究熱點(diǎn)之一[6]。

植物內(nèi)生固氮菌是指定植于宿主植物體內(nèi)，與宿主聯(lián)合固定空氣中氮素，為宿主植物提供氮素的微生物[7]。根據(jù)固氮菌是否定植于植物體內(nèi)，可將固氮菌分為內(nèi)生固氮菌和根際固氮菌。目前，內(nèi)生固氮菌在禾本科植物中發(fā)現(xiàn)較多，小麥、玉米、水稻、甘蔗等體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)固氮能力較強(qiáng)的固氮菌[8]。但是，到目前為止很少發(fā)現(xiàn)牛蒡內(nèi)生固氮菌的研究報(bào)道。本研究利用無(wú)氮培養(yǎng)基從牛蒡根內(nèi)分離、篩選具有固氮能力可人工培養(yǎng)的體內(nèi)固氮菌，通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化特性測(cè)定和16S rDNA鑒定對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，并對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為用于牛蒡根內(nèi)固氮菌的資源開發(fā)和牛蒡?qū)Ｓ蒙镉袡C(jī)肥的制備提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

在徐州市豐縣牛蒡標(biāo)準(zhǔn)化種植基地采集牛蒡的根，采集后裝入無(wú)菌塑料袋密封。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良阿斯貝（Ashby）無(wú)氮培養(yǎng)基[9]：MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaSO40.1 g/L、KH2PO40.2 g/L、CaCO35.0 g/L、NaCl 0.2 g/L、葡萄糖10.0 g/L、瓊脂18 g/L、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 試劑

MgSO4·7H2O、CaCO3、KH2PO4、CaSO4、葡萄糖（均為分析純）：格里斯醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司；檸檬酸、甘露醇、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-亮氨酸（均為分析純）：北京市津同樂(lè)泰化工產(chǎn)品有限公司；細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京Solarbio公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

BX43/53生物顯微鏡：北京瑞科中儀科技有限公司；VD-850臺(tái)式超凈工作臺(tái)：杭州旭清科技有限公司；HZ-124/85S半微量電子天平：上海諾宣科學(xué)儀器有限公司；XW-80A旋渦混合儀：廣森實(shí)驗(yàn)器材有限公司；LH-PYX3M生化培養(yǎng)箱：常州金南儀器制造有限公司；HNY-200B恒溫?fù)u床：上海喬躍電子科技有限公司；TDZ24離心機(jī)：青島諾凱達(dá)機(jī)械制造有限公司；UV2800S紫外分光光度計(jì)：上海力辰儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛蒡根預(yù)處理及消毒

清洗：采集來(lái)的牛蒡根首先用流水沖洗掉根表面的泥土，然后再用流水沖洗30 min，最后用無(wú)菌水清洗3～5次。

表面消毒[10]：先把牛蒡根放在體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中浸泡10 min，取出后用無(wú)菌水沖洗3次，接著用0.1%升汞浸泡1 min，取出后再用無(wú)菌水沖洗3～5次。

1.3.2 牛蒡根內(nèi)生固氮菌分離、篩選

在超凈工作臺(tái)上，將表面消毒完的牛蒡根用無(wú)菌剪刀剪碎，放入滅過(guò)菌的研缽中，加入適量的磷酸緩沖鹽溶液，研磨30 min。取0.1 mL研磨的汁液均勻的涂布在改良的阿斯貝（Ashby）無(wú)氮培養(yǎng)基上，28 ℃倒置黑暗培養(yǎng)，12 h后每6 h觀察1次。根據(jù)觀察，選擇生長(zhǎng)速度快、菌落飽滿的不同菌落，在新的固體培養(yǎng)基上劃線分離純化。

1.3.3 菌株的鑒定

形態(tài)觀察：借助顯微鏡進(jìn)行菌株的形態(tài)特征觀察。

生理生化特性鑒定：主要進(jìn)行了V-P試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、甲基紅反應(yīng)試驗(yàn)、吲哚反應(yīng)試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、產(chǎn)氨試驗(yàn)、產(chǎn)H2S試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)等，具體方法參考文獻(xiàn)[11-14]。

16S rDNA序列分析[15-17]：利用細(xì)菌基因組提取DNA試劑盒提取純化菌株的DNA。使用通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polynerase chain reaction，PCR）克隆菌株基因組DNA的16S rDNA基因。PCR擴(kuò)增體系20 μL：10×PCR緩沖液2 μL，模板DNA 20 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）（10 mmol/L）0.45 μL，20 μg/L上、下游引物各0.25 μL，TaqDNA聚合酶0.4 μL（濃度5 U/μL），加雙蒸水（ddH2O）至終體積。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min?；厥窄傊悄zPCR克隆片段鏈接到T載體，送至南京世和基因生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果和美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行序列相似性比對(duì)分析，利用Mega 6軟件進(jìn)行發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建，分析固氮菌株的分類學(xué)地位。

1.3.4 乙炔還原活性的測(cè)定[18-20]

將分離得到的純種菌株培養(yǎng)在液態(tài)改良阿斯貝（Ashby）無(wú)氮培養(yǎng)基中，把對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株培養(yǎng)液加入到密封的100 mL的培養(yǎng)容器中，接著將容器中10%空氣置換成高純乙炔氣體，28 ℃、240 r/min培養(yǎng)24 h后用氣相色譜檢測(cè)容器中乙烯的濃度[12]，計(jì)算乙烯生成速率[nmol/（mL·min）]，來(lái)反映乙烯還原活性。

1.3.5 固氮菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化

將分離篩選鑒定后的固氮菌株接種到液態(tài)改良阿斯貝（Ashby）無(wú)氮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1，以菌種生長(zhǎng)量OD600nm值為響應(yīng)值，以培養(yǎng)溫度、初始pH值、培養(yǎng)時(shí)間、接種量、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量（250 mL搖瓶）、葡萄糖添加量、混菌培養(yǎng)檸檬酸廢棄物添加量8個(gè)因素為因變量。接著進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)[21]，從而得出固氮菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件。

表1 固氮菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Plackett-burman tests design for culture conditions optimization of nitrogen-fixing becteria

2 結(jié)果與分析

2.1 牛蒡根內(nèi)生固氮菌的分離、篩選及鑒定

2.1.1 固氮菌株乙炔還原活性測(cè)定結(jié)果

表征菌株固氮能力強(qiáng)弱的最重要的指標(biāo)之一就是乙炔還原活性，牛蒡根經(jīng)過(guò)表面消毒、研磨、分離和篩選，最終在改良阿斯貝（Ashby）無(wú)氮固體培養(yǎng)基上得到116個(gè)純菌落，其培養(yǎng)24 h時(shí)的乙炔還原活性見圖1。由圖1可知，菌株NF-008、NF-024、NF-072、NF-096、NF-112的乙炔還原活性較高，其中菌株NF-112還原活性最高，乙烯生成速率為682.27 nmol/（mL·min）。

圖1 固氮菌株的乙炔還原性Fig.1 Acetylene reducibility of nitrogen-fixation strains

2.1.2 固氮菌株形態(tài)觀察及生理生化特性測(cè)定結(jié)果

（1）菌株形態(tài)學(xué)觀察

菌株NF-112的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)見圖2。由圖2可知，菌株NF-112的革蘭氏染色呈陰性，顯微鏡下呈棒狀，大小約（0.6～1.0）μm×（1.2～2.0）μm，單生或成對(duì)、成短鏈存在，菌株有莢膜、菌毛，無(wú)鞭毛，無(wú)芽孢。

圖2 菌株NF-112的菌落（A）及細(xì)胞（B）形態(tài)Fig.2 Colony (A) and cell (B) morphology of strain NF-112

（2）生理生化試驗(yàn)

菌株NF-112的生理生化特性特性見表2。

表2 菌株NF-112生理生化特性Table 2 Physiological-biochemical characteristics of strain NF-112

由表2可知，菌株NF-112可以以葡萄糖、乳糖、半乳糖、蔗糖作碳源，以L-酪氨酸作氮源，但不能以淀粉、檸檬酸、甘露醇作為碳源，不能以L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-亮氨酸作為氮源；V-P試驗(yàn)不顯示紅色，表明菌株NF-112不具有丙酮酸脫羧酶；脲酶試驗(yàn)顯示紅色為陽(yáng)性，表明菌株NF-112代謝過(guò)程中產(chǎn)丙酮酸脫羧酶；甲基紅反應(yīng)不顯紅色，呈陰性；吲哚反應(yīng)顯紅色，呈陽(yáng)性，表明菌株NF-112代謝過(guò)程中能產(chǎn)生色氨酸酶。接觸酶試驗(yàn)無(wú)氣泡產(chǎn)生，呈陰性；氧化酶試驗(yàn)不變色，呈陰性；產(chǎn)氨試驗(yàn)出現(xiàn)黃色沉淀，呈陽(yáng)性；產(chǎn)H2S試驗(yàn)不變色，呈陰性；硝酸鹽還原試驗(yàn)無(wú)顏色改變，呈陰性。

2.1.3 菌株NF-112的16S rDNA基因鑒定結(jié)果

菌株NF-112的16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖見圖3。從圖3可以看出，菌株NF-112的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5 kbp處有一條明亮的條帶，說(shuō)明基因片段純度較高，DNA長(zhǎng)度大約是1.5 kbp。經(jīng)檢測(cè)，菌株NF-112的16S rDNA長(zhǎng)度為1 488 bp。將測(cè)序結(jié)果和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選取與菌種NF-112同源性大約95%作為模式菌種，通過(guò)鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，菌株NF-112與克雷伯菌屬（Klebsiella）的親緣關(guān)系最近，相似性都＞99%。根據(jù)菌株NF-112的菌落特征、顯微觀察特征、生理生化特性以及16S rDNA序列分析結(jié)果，將菌株NF-112鑒定為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae）。

圖3 菌株NF-112的16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis electrophoretogram of 16S rDNA gene of strain NF-112 by PCR amplification

圖4 菌株NF-112的16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 16S rDNA phylogenetic tree of strain NF-112

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化菌株NF-112培養(yǎng)條件

2.2.1 影響菌株NF-112培養(yǎng)關(guān)鍵因素的確定

對(duì)影響菌株NF-112培養(yǎng)的8個(gè)因素進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用軟件Minitab 15對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，試驗(yàn)分析的結(jié)果見表3，顯著性分析結(jié)果見表4。從表3和表4可以看出，影響菌種NF-112培養(yǎng)生產(chǎn)8個(gè)因素的順序?yàn)椋築（培養(yǎng)溫度）＞C（初始pH值）＞H（葡萄糖添加量）＞D（培養(yǎng)時(shí)間）＞G（搖床轉(zhuǎn)速）＞F（裝液量）＞E（接種量）＞I（廢棄物添加量），其中對(duì)培養(yǎng)過(guò)程影響較顯著的因素有3個(gè)，分別為B（培養(yǎng)溫度）、C（初始pH值）、H（葡萄糖添加量）。

表3 菌株NF-112培養(yǎng)條件優(yōu)化的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Plackett-Burman tests design and results for culture conditions optimization of strain NF-112

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)顯著性分析Table 4 Significance analysis of Plackett-Burman experiments

2.2.2 菌株NF-112培養(yǎng)條件的優(yōu)化

以培養(yǎng)溫度、初始pH值和葡萄糖添加量為自變量，以O(shè)D600nm值為響應(yīng)值，進(jìn)行菌株NF-112培養(yǎng)條件優(yōu)化3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[22]，結(jié)果見表5。

使用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert 8.0.6對(duì)表5結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合[23-26]，所得二次多項(xiàng)式回歸方程為：

表5 菌株NF-112培養(yǎng)條件優(yōu)化Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Benhnken tests for culture conditions optimization of strain NF-112

續(xù)表

2.2.3 回歸模型方差分析

回歸模型的方差分析結(jié)果見表6。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

由表6可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明回歸模型的擬合度較好。模型的決定系數(shù)R2=0.924 6，校正決定系數(shù)R2adj=0.911 6，表明所建模型和實(shí)際情況擬合程度高，可以真實(shí)反映3個(gè)因素對(duì)OD600nm值的影響。一次項(xiàng)B、C，交互項(xiàng)BC和二次項(xiàng)B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；二次項(xiàng)H2對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）；其他項(xiàng)相對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

2.2.4 響應(yīng)面圖的分析

初始pH值、培養(yǎng)溫度、葡萄糖添加量交互作用對(duì)菌株NF-112培養(yǎng)液OD600nm值影響的響應(yīng)面及等高線見圖6。

從圖6可以看出，B（培養(yǎng)溫度）和C（初始pH值）2個(gè)因素交互作用對(duì)菌株NF-112培養(yǎng)的OD600nm值影響極顯著（P＜0.01），其余兩組間交互作用不顯著（P＞0.05），這和回歸模型方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用對(duì)菌株NF-112 OD600nm值影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on OD600 nm value of strain NF-112

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

使用軟件Design Expert 8.0.6對(duì)二次多項(xiàng)式回歸方程求解，求得菌株NF-112培養(yǎng)最優(yōu)條件為：初始pH值5.32、培養(yǎng)溫度27.7 ℃、葡萄糖添加量26.2 g/L，預(yù)測(cè)OD600nm值為1.68?？紤]實(shí)際成本及技術(shù)情況，最終確定最優(yōu)處理?xiàng)l件為：初始pH值5.3、培養(yǎng)溫度28 ℃、葡萄糖添加量26 g/L。在此最優(yōu)培養(yǎng)條件下，OD600nm值為1.76，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明回歸模型和實(shí)際情況可以較好的擬合。

3 結(jié)論

固氮菌能通過(guò)自身的代謝系統(tǒng)把空氣中無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮，可以為植物的生長(zhǎng)提供氮素。該研究利用改良阿斯貝（Ashby）無(wú)氮選擇培養(yǎng)基初篩和乙炔還原法復(fù)篩從牛蒡的根系中篩選出固氮能力較強(qiáng)的菌株NF-112，通過(guò)菌落特征和顯微特性觀察、生理生化特性測(cè)定及16S rDNA序列分析，初步鑒定為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）。并且利用響應(yīng)面方法研究了菌株NF-112的最優(yōu)培養(yǎng)條件，最終確定最優(yōu)培養(yǎng)條件為：初始pH值5.3、培養(yǎng)溫度28 ℃、葡萄糖添加量26 g/L。在此最佳培養(yǎng)條件下，OD600nm值可達(dá)到1.76。本研究說(shuō)明除了豆科和禾本科植物之外，其他植物體內(nèi)也存在固氮微生物，為固氮微生物的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論和技術(shù)支撐，也為下一步牛蒡?qū)Ｓ蒙镉袡C(jī)肥的制備提供固氮菌劑。