葉望娟，雷文平，周杏榮，周佳豪，汪鎮(zhèn)南，劉成國(guó)，周 輝*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南科賽安生物科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410014）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是指一類能在可利用的碳水化合物發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌。目前發(fā)現(xiàn)LAB主要有包括乳桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、歧桿菌屬及片球菌屬等[1]。益生菌在拉丁文中指“對(duì)生命有益”，而LAB是益生菌的一個(gè)重要來源[2]。益生菌具有如下特點(diǎn)：抗逆性強(qiáng)[3-4]，數(shù)量多，黏附能力強(qiáng)[5]，能發(fā)揮理化作用和生物學(xué)作用來抑制致病菌生長(zhǎng)[6]，具有安全性[7]，具有促進(jìn)健康的作用，如免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、降膽固醇等[8-10]。當(dāng)給予足夠量的益生菌時(shí)，其會(huì)以足夠的數(shù)量到達(dá)腸道，從而為宿主帶來健康益處[11]。

益生菌發(fā)揮抗氧化作用主要通過以下幾種方式：清除細(xì)胞周圍活性氧自由基、鰲合金屬離子以緩解脂質(zhì)過氧化、自身抗氧化防御系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化作用、下調(diào)產(chǎn)生活性氧的酶活性、上調(diào)宿主的抗氧化酶活性、益生菌產(chǎn)生抗氧化代謝物、調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路、增加了宿主的抗氧化代謝物水平、調(diào)節(jié)腸道微生物群[12]。WANG B G等[13]的研究表明，口服雙歧桿菌ATCC 29521對(duì)小鼠有顯著影響，能顯著提高小鼠谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性和丙二醛水平。CUEVAS-GONZáLE P F等[14]研究表明，特定乳桿菌菌株具有抗氧化特性的代謝物，這可能有助于減輕丙烯酰胺誘導(dǎo)的人紅細(xì)胞的氧化應(yīng)激。

本研究選用實(shí)驗(yàn)室從鮮乳中分離保存的5株乳桿菌，通過對(duì)菌株的抗逆性、抗生素敏感性、抑菌能力、黏附性進(jìn)行測(cè)定評(píng)估其益生菌潛力；并通過體外抗氧化測(cè)定，篩選出具高抗氧化活性的菌株，以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）12E、植物乳桿菌（L.plantarum）15E、短乳桿菌（L.brevis）24E、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）260、干酪乳桿菌（L.casei）83：由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院乳品加工實(shí)驗(yàn)室分離保存；大腸桿菌（Escherichiacoli）CGMCC9181、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）LGG（ATCC 53103）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19115：本實(shí)驗(yàn)室保存；Caco-2細(xì)胞（ATCC HTB-37）：長(zhǎng)沙隆和化玻實(shí)驗(yàn)用品有限公司。

1.1.2 試劑

胰蛋白酶（酶活50 000 U/g）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶（3 000～3 500 U/g）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測(cè)試劑盒、羥自由基清除能力檢測(cè)試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；抗生素試劑盒（20種）：杭州微生物試劑有限公司；胎牛血清、磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）：以色列貝特哈梅克生物工業(yè)公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS（Man Rogosa Sharpe）肉湯培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM）：以色列貝特哈梅克生物工業(yè)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GZ-400-S恒溫培養(yǎng)箱：韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；HR/T16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱：力康生物醫(yī)療科技控股有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)和樣品制備

受試菌株在-80 ℃保藏于甘油管中，試驗(yàn)開始前，將甘油管中的菌種接種于1 mL的MRS肉湯中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，活化兩代后待用。

菌懸液的制備：活化兩代后的菌株以106CFU/mL接種量接種至5 mL新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，于4 ℃、10 000 r/min條件下離心2 min，棄上清，將菌體沉淀用無菌生理鹽水洗滌兩次后重懸，調(diào)整菌體濃度為1×108CFU/mL。

菌株發(fā)酵上清液：發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液，轉(zhuǎn)移至新離心管中。

1.3.2 耐酸能力測(cè)定

根據(jù)AZHAR M A等[15]的方法稍作修改，將菌株以106CFU/mL接種量分別接種至pH 2和3的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0 h和6 h時(shí)測(cè)定菌液在波長(zhǎng)600 nm處的OD600nm值，并計(jì)算ΔOD600nm。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。公式如下：

ΔOD600nm=OD600nm（6 h）-OD600nm（0 h）

1.3.3 耐膽鹽能力測(cè)定

將菌株以106CFU/mL接種量，接種至牛膽鹽含量分別為0、0.1%、0.3%、0.5%的MRS液體培養(yǎng)基中，調(diào)整培養(yǎng)基pH至6.8，37 ℃恒溫培養(yǎng)，分別在0 h和6 h測(cè)定菌液在波長(zhǎng)600 nm處OD600nm值的變化，并計(jì)算ΔOD600nm。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。公式同1.3.2。

1.3.4 模擬胃腸液耐受能力測(cè)定

0.5 mL菌懸液加入4.5 mL模擬胃液或腸液[16]中，混合均勻，于37 ℃條件下孵育3 h，分別計(jì)數(shù)0 h及3 h時(shí)混合液中的活菌數(shù)量，以菌株存活率評(píng)估菌株對(duì)模擬胃腸液的耐受能力（以鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）LGG為陽(yáng)性對(duì)照）。菌株存活率計(jì)算公式如下：

1.3.5 抑菌活性測(cè)定

將指示菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌）活化3代后，以105CFU/mL接種量接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，傾注平板待其凝固后放置牛津杯，將試驗(yàn)菌株發(fā)酵上清液200 μL加至牛津杯中，4 ℃靜置4 h后在37 ℃條件下培養(yǎng)10 h，量取抑菌圈直徑。

1.3.6 抗生素敏感性測(cè)定

菌株以106CFU/mL接種量接種于無菌MRS瓊脂培養(yǎng)基中，混勻后傾注平板。待凝后將20種抗生素藥敏試紙貼于平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)，2 d后測(cè)定其抑制圈直徑。

1.3.7 表面特性研究

根據(jù)SOPHATHA B等[17]的方法稍作修改。取2 mL菌懸液，分別加入等體積的正十六烷或乙酸乙酯，渦旋振蕩2 min，37 ℃靜置30 min后取水相測(cè)其波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值，以鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）LGG為陽(yáng)性對(duì)照菌。通過以下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：A1為靜置30 min后水相的吸光度值；A0為初始菌懸液的吸光度值。

1.3.8 黏附性測(cè)定

根據(jù)ZIELIN′SKA D[18]稍作修改。細(xì)胞培養(yǎng)：將復(fù)蘇后Caco-2轉(zhuǎn)入細(xì)胞瓶中，使用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，每2 d換液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)為單層細(xì)胞后進(jìn)行傳代，傳代5次后進(jìn)行試驗(yàn)。黏附試驗(yàn)前細(xì)胞傳代，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106CFU/mL并接種1 mL至6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)為單層細(xì)胞后用于黏附試驗(yàn)研究。菌懸液制備：菌株經(jīng)無菌PBS洗滌兩次后，重懸于10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，并調(diào)整菌懸液的濃度為1×108CFU/mL（V0）。

乳酸菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附計(jì)數(shù)：向6孔板中添加菌懸液之前，用無菌PBS緩沖液洗滌6孔板中單層Caco-2細(xì)胞兩次，向每孔加入1 mL濃度為1×108CFU/mL的菌懸液，將6孔板轉(zhuǎn)移至5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后；用PBS溶液洗滌3次，去除未黏附的菌體；然后加入1 mL PBS，用細(xì)胞刮獲取細(xì)胞，平板計(jì)數(shù)法計(jì)算黏附細(xì)菌數(shù)（V1）。計(jì)算公式如下：

1.3.9 抗氧化活性測(cè)定

菌株總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-TOC）與羥自由基清除能力：根據(jù)檢測(cè)試劑盒的說明書進(jìn)行；1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力：參照張香美等[19]的方法并稍作修改，將發(fā)酵上清液用無水乙醇稀釋適應(yīng)倍數(shù)后取0.5 mL，加入1 mL的濃度為0.2 mmol/L的DPPH自由基無水乙醇溶液，混勻后在室溫條件下避光反應(yīng)30 min，并10 000 r/min 離心1 min，取上清液在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值?？瞻捉M以等體積無水乙醇代替DPPH溶液，對(duì)照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液。

式中：A0為對(duì)照吸光度值；A1為樣品組吸光度值；A2為空白組吸光度值。

1.3.10 活菌數(shù)的測(cè)定

菌株的活菌數(shù)參照GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》進(jìn)行測(cè)定。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析利用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計(jì)分析，以SPSSStatistics21進(jìn)行方差分析（analysisofvariance，ANOVA）和LSD多重比較，顯著水平P≤0.05；使用Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐酸能力測(cè)定

由圖1可知，所有菌株均能在pH=2、pH=3環(huán)境下生長(zhǎng)。其中菌株12E在pH=3時(shí)對(duì)酸的耐受性顯著高于其他菌株（P＜0.05）；在pH=2時(shí)對(duì)酸的耐受性與其他菌株差異不顯著（P＞0.05）。菌株15E在pH=3時(shí)對(duì)酸的耐受性顯著高于菌株83、260、24E（P＜0.05），顯著低于菌株12E（P＜0.05），與對(duì)照菌株LGG差異不顯著（P＞0.05）；在pH=2時(shí)對(duì)酸的耐受性顯著高于菌株24E（P＜0.05），與其他菌株差異不顯著（P＞0.05）。在耐酸能力上菌株12E、15E優(yōu)于其他試驗(yàn)菌株，這可能是由于植物乳桿菌與其他菌相比，生長(zhǎng)快并且活菌數(shù)比較高，同時(shí)產(chǎn)酸能力更強(qiáng)的原因。因此，對(duì)酸脅迫抵抗能力更強(qiáng)[20]。

圖1 不同乳酸菌對(duì)酸性環(huán)境的耐受性Fig.1 Tolerance of different lactic acid bacteria to acidic environment

2.2 耐膽鹽能力測(cè)定

由表1可知，隨著膽鹽含量的增加，對(duì)菌株生長(zhǎng)抑制作用增加，但所有菌株在不同膽鹽含量環(huán)境中均能生長(zhǎng)。且所有菌株ΔOD600nm均顯著高于對(duì)照菌株LGG（P＜0.05），表明菌株83、260、12E、15E和24E對(duì)膽鹽耐受性均優(yōu)于對(duì)照菌株LGG。

表1 不同乳酸菌對(duì)膽鹽的耐受性Table 1 Tolerance of different lactic acid bacteria to bile salts

2.3 模擬胃腸液耐受能力測(cè)定

由圖2可知，經(jīng)模擬胃液與腸液消化3 h后，除在模擬腸液中菌株12E（70.56±0.07）%和15E（59.38±0.88）%存活率較低以外，其他菌株存活率均高于90%。說明試驗(yàn)菌株均具有一定在腸液和胃液中存活的能力，使其以活菌形式進(jìn)入腸道并且定殖發(fā)揮益生功效成為可能。

圖2 不同乳酸菌對(duì)模擬胃腸液的耐受性Fig.2 Tolerance of different lactic acid bacteria to simulated gastrointestinal fluid

2.4 抗生素敏感性測(cè)定

由表2可知，所有菌株對(duì)青霉素類、頭孢類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類均具有敏感性，大部分對(duì)氨基糖苷類抗生素不敏感，這是由于氨基糖苷類抗生素對(duì)大多數(shù)厭氧菌以及兼性厭氧菌無效且在酸性環(huán)境中抗菌活性較弱[21-22]。菌株12E、15E和24E對(duì)于青霉素類抗生素敏感性要略高于對(duì)照菌株LGG，其他菌株對(duì)于青霉素類抗生素敏感性與對(duì)照菌株LGG差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同乳酸菌抗生素敏感性比較Table 2 Comparison of antibiotic sensitivity of different lactic acid bacteria

2.5 抑菌活性測(cè)定

由圖3可知，所有菌株發(fā)酵上清液均具有一定的抑菌能力，抑菌圈直徑均＞10 mm。對(duì)于大腸桿菌抑菌效果較好的菌株為15E（17±0.71）mm、12E（15.5±1.41）mm；所有菌株對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑均＞20 mm，所有菌株對(duì)單增李斯特菌抑菌圈直徑均＞13 mm。

圖3 不同乳酸菌對(duì)大腸桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌抑菌活性Fig.3 Antibacterial activity of different lactic acid bacteria against Escherichia coli, Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus

2.6 表面特性研究

由圖4可知，所有菌株對(duì)不同溶劑均表現(xiàn)出一定的表面疏水性。十六烷試驗(yàn)結(jié)果主要體現(xiàn)菌株表面疏水性，而乙酸乙酯試驗(yàn)結(jié)果反應(yīng)的是菌株表面的Lewis酸堿性[22]。其中在十六烷中表現(xiàn)出疏水性最高的為菌株83（87.88±0.25）%，其次為菌株24E（80.52±2.06）%。而所有菌株均與乙酸乙酯結(jié)合率較低，說明菌株細(xì)胞表面都具有良好的電子供體特性，這一結(jié)果與早先的報(bào)告一致[24-25]。

圖4 不同乳酸菌的疏水性比較Fig.4 Comparison of hydrophobicity of different lactic acid bacteria

2.7 黏附能力

由圖5可知，菌株黏附能力因菌株和種類的不同而不同，其中菌株24E黏附率最高（9.71±0.44）%，其次是菌株260（4.16±0.27）%，二者均高于對(duì)照菌株LGG（2±0.39）%；菌株12E和15E黏附能力較差，均低于1%。據(jù)報(bào)道，不同的乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附率在1%～14%之間，具有菌株特異性[18，24]。疏水性可以促進(jìn)微生物與宿主細(xì)胞的首次接觸。然而，這種非特異性的相互作用較弱，許多研究證明疏水性與細(xì)菌粘附之間沒有相關(guān)性[12，17]。有研究表明，除了表面電荷之外，其他乳桿菌菌株可能通過不同的機(jī)制，如特定的粘附素，與相應(yīng)的特異性受體相結(jié)合形成特異性黏附。這將需要進(jìn)一步的研究來研究粘附素介導(dǎo)的特定相互作用的粘附機(jī)制。

圖5 不同乳酸菌的黏附能力比較Fig.5 Comparison of adhesion ability of different lactic acid bacteria

2.8 抗氧化能力

由表3可知，菌株對(duì)DPPH自由基、羥自由基的清除能力及總抗氧化能力三者之間并沒有必然聯(lián)系，這說明菌株抗氧化能力是多種機(jī)制的綜合作用。所有菌株發(fā)酵上清液均對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力，均在49%以上，與對(duì)照菌株LGG（55.32±2.55）%差異不顯著（P＞0.05）；菌株83、24E羥自由基清除率顯著低于對(duì)照菌株LGG（P＜0.05），菌株260、12E、15E羥自由基清除率與對(duì)照菌株LGG（31.34±9.83）%差異不顯著（P＞0.05）；所有菌株發(fā)酵上清液總抗氧化能力均顯著高于對(duì)照菌株LGG（4.67±1.17）μmol/mL（P＜0.05）。

表3 不同乳酸菌發(fā)酵上清液抗氧化能力比較Table 3 Comparison of fermentation supernatant antioxidant capacity of different lactic acid bacteria

綜合黏附能力與抗氧化能力來看，鼠李糖乳桿菌260益生特性較優(yōu)，黏附能力較強(qiáng)，黏附率為4.16%；DPPH自由基清除能力56.36%、羥自由基的清除能力23.09%、總抗氧化能力（T-AOC）為5.26 μmol/mL。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)5株乳源性乳酸菌益生特性以及發(fā)酵上清液抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，5株乳桿菌均可在pH2、pH3，牛膽鹽含量0.1%～0.5%環(huán)境中生長(zhǎng)，經(jīng)模擬胃液與腸液消化3 h后，除菌株12E和15E在模擬腸液中存活率較低以外，其他菌株存活率均高于90%，對(duì)青霉素類、頭孢類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均具有敏感性；對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌具有一定的抑制能力，抑菌圈直徑均分別大于10 mm、20 mm、13 mm；其中鼠李糖乳桿菌260益生特性較優(yōu)，黏附能力較強(qiáng)，黏附率為4.16%，DPPH自由基清除能力56.36%、羥自由基的清除能力23.09%、總抗氧化能力（T-AOC）為5.26 μmol/mL，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。由于抗氧化活性體外化學(xué)評(píng)價(jià)方法存在一定的局限性，不能全面的體現(xiàn)菌株的抗氧化活性和菌株在機(jī)體內(nèi)的抗氧化作用。因此，還需要進(jìn)一步對(duì)乳酸菌體內(nèi)抗氧化活性進(jìn)行探究。