何夢雪，張 彥，崔夢君，郭 壯，熊建文，王玉榮*

（1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；2.湖北文理學院 乳酸菌生物技術與工程襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽 441053；3.安琪紐特股份有限公司 酵母功能湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443003；4.柳州工學院 柳州市螺螄粉植物源性配料重點實驗室，廣西 柳州 545616）

青檸（Citrus aurantiifolia）隸屬于蕓香科柑橘屬，在我國云南和廣西等地均有栽培，年產量可達3.5～4.0 t，是世界柑橘類水果中的四大主要栽培種之一[1]。青檸中富含豐富的檸檬酸和維生素C，具有助消化、預防感冒以及其他抗疾病的功效[2]。酸檸檬是以青檸為原料，并添加食鹽等輔料，經過曬干、混合和密封發(fā)酵等過程加工而成的[3]。酸檸檬，既保留了青檸原本的清香與大部分營養(yǎng)，又賦予了成品咸爽的口感，能夠生津健胃，消食解乏[4]。廣西地處亞熱帶，具有四周多山和高原、氣候溫暖、降雨量大等特征，果蔬品類較多，因此獨具特色的“酸嘢”進入廣西人民的餐桌上，當?shù)馗骷叶加须缰茩幟实牧晳T，并常將其用作烹飪肉禽魚類等的輔料，其中尤以檸檬鴨最為出名，這種制作方式不僅可以降低原料的腥膻味，還能保留酸檸檬酸鮮口感[5-6]。酸檸檬加工工藝簡單，整個制作過程一般都在常溫常壓下進行，成品品質易受多種因素影響，尤其是參與發(fā)酵的微生物。目前，對于酸檸檬的研究主要集中在酸檸檬食品的烹飪[7]和生產工藝的研究[8]等方面，而對于酸檸檬中微生物多樣性的研究尚少。

隨著測序技術的迅猛發(fā)展，Illumina MiSeq高通量測序技術以其快速高效的特點，成為微生物群落多樣性解析的重要工具，目前已在發(fā)酵食品領域得到廣泛應用[9]。王成等[10]通過高通量測序技術對Back-slopping發(fā)酵酸粥研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacteria）為優(yōu)勢細菌屬；安飛宇等[11]通過高通量測序技術對自然發(fā)酵豆醬研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬和四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）為優(yōu)勢細菌屬，青霉菌屬（Penicillium）和異常威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces anomalus）為優(yōu)勢真菌屬；賈晶晶等[12]通過高通量測序技術發(fā)現(xiàn)，腌漬白菜液中，變形菌門（Proteobacteria）和普羅威登斯菌屬（Providencia）分別為優(yōu)勢細菌門和優(yōu)勢細菌屬。高通量測序技術的發(fā)展及在發(fā)酵食品領域的應用為解析酸檸檬中微生物群落結構組成提供了重要的技術支撐。

本研究從廣西壯族自治區(qū)南寧市農貿市場共采集酸檸檬樣品7份，采用Illumina MiSeq高通量測序技術對其微生物群落多樣性進行了解析，同時采用PICRUSt軟件對酸檸檬樣品中微生物的基因功能進行預測，以期為后續(xù)南寧地區(qū)酸檸檬產品品質的提升提供理論依據和數(shù)據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

從廣西自治區(qū)南寧市秀廂農貿市場和淡村農貿市場共采集酸檸檬樣品7份，編號為NM1～NM7，放置于含有冰袋的采樣箱中運回實驗室后進行分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTPs）Mix、FastPfu Fly DNA Polymerase（酶活500 U/g）、5×Trans StartTMFastPfu Buffer：北京全式金生物技術有限公司；瓊脂糖（生化試劑）：索來寶生物技術有限公司；克隆載體pMD18-T：大連寶生物工程有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒：Axygen生物技術（杭州）有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；VeritiFAST梯度PCR儀：美國ABI公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國ProteinSimple公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司；R920機架式服務器：美國Dell公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酸檸檬樣品中微生物宏基因組DNA提取

稱取2.0 g酸檸檬樣品，采用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA對樣品中微生物宏基因組DNA進行提取，將瓊脂糖凝膠電泳檢測合格的宏基因組DNA放置于-20 ℃保存，備用。

1.3.2 細菌16S rRNA的PCR擴增

使用加入核苷酸標簽（barcode）的成對引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），參照文獻[13]中的PCR擴增體系和條件對酸檸檬樣品中細菌的16S rRNA V3-V4區(qū)基因序列進行PCR擴增。PCR擴增體系：5×PCR緩沖液4 μL，dNTPs Mix（2.5 mmol/L）2 μL，正反向引物（5 μmol/L）各0.8 μL，DNA聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，DNA模板10 ng，補充無菌雙蒸水（ddH2O）至20 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30次；72 ℃再延伸10 min。

1.3.3 高通量測序及生物信息學分析

將經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格的PCR擴增產物，通過Illumina MiSeq PE300高通量測序平臺進行測序。將返回序列拼接后進行質控。參照沈馨等[14]的方法，通過QIIME（v1.90）平臺對質控合格的序列進行生物學信息分析，將使用PyNAST軟件進行對齊后的序列，按照100%和97%相似度進行兩步UCLUST法構建操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）矩陣；通過ChimeraSlayer軟件對含有嵌合體的OTU進行選取與去除，其后選取代表性OTU序列在核糖體核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）數(shù)據庫RDP、SILVA和Greengenes數(shù)據庫中進行同源性比對，確定其不同分類學地位；計算超1指數(shù)和香農指數(shù)從而對樣品中微生物的豐度和多樣性進行評價。

1.3.4 PICRUSt功能預測

將通過Greengenes數(shù)據庫比對后的高質量序列進行UCLUST劃分與注釋，通過PICRUSt軟件對酸檸檬樣品中微生物的基因功能進行預測[15]，并依照直系同源蛋白數(shù)據庫（clusters of orthologous groups of proteins，COG）進行功能注釋[16]。

1.3.5 多元統(tǒng)計學分析

使用R軟件進行氣泡圖與瀑布圖的繪制；使用Origin 2017軟件進行柱狀圖的繪制；使用MEGA 5.0軟件的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 酸檸檬細菌序列豐度和多樣性分析

對本研究采集的7份酸檸檬樣品進行Illumina MiSeq高通量測序，其16S rRNA V3-V4區(qū)基因序列測序結果、各分類地位數(shù)量統(tǒng)計及α-多樣性分析結果見表1。

表1 基于測序結果酸檸檬樣品細菌不同分類學地位數(shù)量統(tǒng)計及α-多樣性分析結果Table 1 Results of quantitative statistics of different taxonomic status and α-diversity analysis of bacteria in acidic lemon samples based on sequencing results

由表1可知，7個酸檸檬樣品共產生312 150條高質量16S rRNA序列，平均每個樣品產生44 593條。按照97%和100%的相似度對所得序列進行劃分且去除嵌合體后共得到8 958條代表性序列和5 223個細菌OTU。由表1亦可知，當測序量達到33010時，樣品NM3的超1指數(shù)最高，為1116.79，樣品NM5的香農指數(shù)最高，為4.13。有研究報道，超1指數(shù)越大，樣本菌群豐富度越高；香農指數(shù)越小，群落多樣性越高[17]。由此可見，樣品NM3的物種豐富度最高，樣品NM5的群落多樣性最高。

2.2 基于微生物分類學地位酸檸檬樣品細菌菌群多樣性分析

本研究進一步從質控合格的序列中挑選代表性序列與數(shù)據庫進行比對，共注釋到32個門、87個綱、122個目、198個科和356個屬，僅有0.076%和5.63%的合格序列無法注釋到門和屬水平。將7份酸檸檬樣品中平均相對含量＞1.0%的門和屬定義為優(yōu)勢細菌門和優(yōu)勢細菌屬，將相對含量＜1.0%的細菌門和屬定義為others，細菌門種類及平均相對含量氣泡圖見圖1。

圖1 基于門水平酸檸檬樣品中細菌菌群結構分析結果Fig.1 Analysis results of bacterial community structure in acidic lemon samples based on phylum level

由圖1可知，7份酸檸檬樣品在門的分類水平上，平均相對含量＞1%的細菌門有4個，分別為變形菌門（Proteobacteria）（80.61%）、硬壁菌門（Firmicutes）（9.24%）、放線菌門（Actinobacteria）（4.25%）和擬桿菌門（Bacteroidetes）（4.13%）。由圖1亦可知，變形菌門在所有樣品中均存在且相對含量均＞70%，為酸檸檬中的絕對優(yōu)勢菌門，不同酸檸檬樣品優(yōu)勢細菌門的組成與含量無明顯差異。葛東穎等[18]同樣采用MiSeq高通量測序技術對與酸檸檬制作工藝相似的來鳳地區(qū)鹽漬藠頭鹽水中細菌多樣性進行了解析，結果表明，優(yōu)勢細菌門為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），與本研究結果相似。

本研究進一步對酸檸檬樣品中優(yōu)勢細菌屬的種類及平均相對含量進行統(tǒng)計，結果見圖2。

圖2 基于屬水平酸檸檬樣品中細菌菌群結構分析結果Fig.2 Analysis results of bacterial community structure in acidic lemon samples based on genus level

由圖2可知，7份酸檸檬樣品在屬分類水平上，平均相對含量＞1%的細菌屬有5個，分別為勞爾氏菌屬（Ralstonia）（66.13%）、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）（8.18%）、諾卡氏菌屬（Nocardia）（2.87%）、假單胞菌屬（Pelomonas）（1.27%）和別樣桿菌屬（Alistipes）（1.01%）。值得一提的是勞爾氏菌屬在樣品NM1和NM2中含量較高，分別為71.14%和72.22%，遠高于其他細菌屬，為絕對優(yōu)勢細菌屬。然而隸屬于上述5個屬的部分菌種為條件致病菌，如勞爾氏菌屬中大部分菌種都具有將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的能力，從而引起人體中毒乃至死亡，有的則是植物病原菌，從而導致煙草青枯病[19-20]；伯克霍爾德菌屬對多種抗菌藥物具有耐藥性，其中洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）是引起囊性纖維化及慢性肉芽腫患者感染的最重要條件致病菌[21]。由此可知，自制的酸檸檬樣品存在一定安全隱患。究其原因，可能與原料特性或農戶制作酸檸檬開放的發(fā)酵條件有關，因此在后續(xù)對酸檸檬樣品的研究中，應該在改善加工條件的基礎上篩選出更優(yōu)良的菌株，從而提高產品的安全性；或是采用純培養(yǎng)技術收集菌株，發(fā)掘其潛在價值，如大多數(shù)伯克霍爾德氏菌屬物種已證明對多種作物的不同植物病原體具有良好的生物防治作用；同時該屬的部分菌株顯示出巨大的生物技術潛力，可以作為新型抗生素和生物活性次生代謝物的來源[22]。

2.3 OTU統(tǒng)計分析

本研究進一步統(tǒng)計了樣品中平均相對含量＞1%的核心OTU構成及平均相對含量，結果見圖3。

圖3 細菌核心OTUs平均相對含量分析結果Fig.3 Analysis results of average relative content of bacterial core OTUs

由圖3可知，7份酸檸檬樣品中核心細菌OTU有6個，僅占總OTU數(shù)的0.11%，其中有2個隸屬于僅鑒定到科的瘤胃菌科（Ruminococcaceae），4個分別隸屬于瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、諾卡氏菌屬、Reyranella和伯克霍爾德菌屬?；?個核心OUT序列及其模式菌株進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，結果見圖4。

圖4 酸檸檬樣品中核心OTUs的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of core OTUs in acidic lemon samples

由圖4可知，6個核心OTU共分為2大分支，其中OTU2529和OTU4497與纖維素分解瘤胃梭菌（Ruminiclostridium cel lulolyticum）聚為一類，OTU7750與扭鏈瘤胃球菌（Ruminococcustorques）聚為一類，OTU6193和產腔諾卡氏菌（Nocardia coeliaca）聚為一類，OTU1885與胰島素伯克霍爾德氏菌（Burkholderia insulsa）聚為一類，OTU2043與馬西里雷拉菌（Reyranella massiliensis）聚為一類。此外，6個核心OTU累計平均相對含量達到了89.24%，尤其是OTU4497（隸屬于Ruminococcaceae）在7份酸檸檬樣品中含量分別為76.06%、78.60%、72.80%、77.41%、69.82%、77.75%、72.93和75.05%，由此可見，OTU4497為絕對優(yōu)勢核心OTU。

由圖4亦可知，OTU4497和OTU2529與R.cellulolyticum的相似度≥99%，由此可見，這2個核心OTU可能具有與R.cellulolyticum相似的功能。許多研究學者發(fā)現(xiàn)，R.cellulolyticum一方面與其他厭氧纖維素分解的微生物一樣，能產生胞外多酶復合物，其中包含Cel9V和Cel9E等家族9糖苷水解酶，從而使纖維素分解，釋放纖維二糖和纖維糊精，進一步降解后，為細胞提供能量[23-24]；另一方面因其可以分解纖維素的特點，會對未來生物物質轉化成為生物燃料提供菌株支持[25]。由此可知，酸檸檬中亦可能存在大量有利于生物燃料合成的菌株，從而對其工業(yè)化的發(fā)展起到積極作用。

2.4 PICRUSt功能預測

本研究進一步使用PICRUSt軟件對酸檸檬樣品中細菌菌群的基因功能進行預測，在此基礎上，根據蛋白質直系同源簇數(shù)據庫對樣品預測到的功能類別進行注釋，結果見圖5。

圖5 酸檸檬樣品中細菌功能類別分析結果Fig.5 Analysis results of functional categories of bacteria in acidic lemon samples

7份酸檸檬樣品中細菌序列注釋到的COG有4 173個，分別隸屬于23個功能類別。由圖5可知，有關氨基酸轉運與代謝、能量生產和轉換功能的序列在酸檸檬細菌序列中占比分別為7.19%和9.04%，而細胞周期控制、細胞分裂、染色體分割、細胞運動、RNA的加工與修飾、染色質結構與動力學和細胞骨架的潛在表達則相對較低。由圖5亦可知，7份酸檸檬樣品共分為2大類，樣品NM1、NM2、NM3、NM5、NM6和NM7中細菌功能之間存在一定的相似性，而樣品NM4與其他樣品之間細菌功能存在較大的差異。高秀芝等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在豆醬發(fā)酵過程中，蛋白質被分解成氨基酸，從而產生獨特的風味與優(yōu)良的品質。由此推測，氨基酸轉運與代謝功能在酸檸檬樣品中的高表達，會對其品質與風味產生一定的積極作用。

3 結論

本研究利用Illumina MiSeq高通量測序技術對7份廣西南寧地區(qū)酸檸檬樣品的細菌多樣性進行分析。結果表明，酸檸檬樣品的細菌優(yōu)勢菌群組間差異不顯著，且分布較為均勻。優(yōu)勢細菌門為Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria和Bacteroidetes；優(yōu)勢細菌屬為Ralstonia、Burkholderia、Nocardia、Pelomonas和Alistipes。基因功能及表型預測結果表明，酸檸檬中具有氨基酸轉運與代謝、能量生產和轉換功能的細菌序列占比較高。此外，潛在致病菌的檢出指示，應該改善發(fā)酵條件或篩選出更優(yōu)良的菌株控制發(fā)酵進程以提高產品的安全性。