李曉梅，羅 清

遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腫瘤研究室，遵義 563003

目前針對乳腺癌的早期監(jiān)測及治療體系日趨成熟，但乳腺癌患者的死亡率仍然位居女性惡性腫瘤死亡率的首位。復發(fā)與轉移是引起乳腺癌患者死亡率升高的主要原因。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)乳腺癌的復發(fā)和轉移與腫瘤內存在一群數(shù)量極少，但有腫瘤起始能力的腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)密切相關[1]，CSCs較多的乳腺癌患者生存率普遍較低[2]。更重要的是，CSCs可引起患者對現(xiàn)有治療方法的耐藥，導致乳腺癌患者面臨“少藥”甚至“無藥”的難題[3]。鑒于CSCs在乳腺癌復發(fā)、轉移、耐藥中具有重要的作用，進一步認識CSCs并開發(fā)靶向CSCs的治療藥物對乳腺癌治療具有重要的臨床意義。本文對乳腺癌干細胞在乳腺癌復發(fā)、轉移、耐藥以及治療方面的最新研究進行了總結，旨在為消滅乳腺癌干細胞，抑制乳腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展提供依據(jù)。

1 乳腺癌干細胞的分離和鑒定

乳腺癌干細胞(breast cancer stem cells，BCSCs)是乳腺癌腫瘤內極少數(shù)具有自我更新與多向分化能力的干細胞亞群，它的分離和鑒定是基于獨特的細胞表面標志物，目前公認且最常用的是CD44/CD24和乙醛脫氫酶1(ALDH1)。CD44+CD24-和(或)ALDH1+細胞構成的乳腺癌干細胞樣群體，可以通過流式細胞儀[4]、免疫磁珠[5]以及無血清微球體懸浮培養(yǎng)[6]等方式富集。在乳腺癌組織的原代培養(yǎng)細胞中CD44+CD24-、ALDH1+、CD44+CD24-ALDH1+細胞比例分別為7.2%、4.6%、1.5%，其自我更新、增殖、侵襲及成瘤能力依次由弱至強[7]。此外，以CD44+CD24-為特征的間充質樣BCSCs主要是靜止的，定位于腫瘤浸潤前端，而上皮樣BCSCs表達ALDH，具有增生性，且位于更中心位置[8]?？捎昧魇郊毎麅x對分選和富集的細胞進行鑒定與CSCs陽性率的統(tǒng)計[9]，用于下游功能研究。

2 乳腺癌干細胞對乳腺癌發(fā)生發(fā)展的影響

2.1 乳腺癌干細胞與乳腺癌復發(fā)

復發(fā)是指腫瘤經(jīng)過放化療或手術等治療后腫瘤再次出現(xiàn)的現(xiàn)象。盡管乳腺癌的治療取得了突飛猛進的進展，但乳腺癌的復發(fā)轉移率仍然高達23.4%，其原因與BCSCs密切相關[10-12]。常規(guī)的放化療只能針對增殖活躍的BCSCs，但對靜息狀態(tài)BCSCs無殺滅作用。因此可能不足以完全根除BCSCs，而殘留的BCSCs在被適當?shù)男盘柤せ詈笸鶗鹉[瘤復發(fā)。

BCSCs可在某些轉錄因子以及炎癥因子刺激下促進乳腺癌的復發(fā)。Hong等[13]研究表明，轉錄因子RUNX1通過抑制BCSCs活性以及直接下調ZEB1轉錄因子的表達，抑制小鼠乳腺脂肪墊內腫瘤細胞的生長。另外，慢性炎癥在乳腺癌復發(fā)的發(fā)展中起著至關重要的作用[14]。Segatto等[15]發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者手術后傷口排出的液體富含細胞因子和生長因子，它們可通過STAT3信號通路誘導具有干細胞樣表型的BCSCs富集，進而引起術后腫瘤的復發(fā)。

近年來研究也表明BCSCs參與乳腺癌復發(fā)往往離不開一些信號通路的調控。Baker等[16]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者經(jīng)長期曲妥珠單抗治療后，乳腺癌耐藥株中BCSCs數(shù)量明顯增多，這一結果是通過Notch-1-PTEN-ERK1/2信號通路的激活導致的。其研究顯示，當敲除Notch-1基因后，BCSCs成球能力隨之降低，而這種效應在敲除PTEN基因時，被一定程度的抑制。進一步實驗發(fā)現(xiàn)MEK1/2抑制劑可完全抑制轉染Notch-1、PTEN或Notch-1和PTEN siRNA細胞的成球能力，表明Notch-1通過PTEN抑制使ERK1/2過度激活，進一步激活體內外BCSCs，導致腫瘤復發(fā)[16]。另外，Wnt信號通路與BCSCs介導的乳腺癌復發(fā)有關。Choi等[17]發(fā)現(xiàn)，CSCs調節(jié)因子CDK12的高表達可激活Wnt或ErbB-PI3K-AKT信號通路，進而誘導BCSCs的自我更新和激活腫瘤形成能力，導致乳腺癌的復發(fā)。

2.2 乳腺癌干細胞與乳腺癌轉移

轉移是惡性腫瘤的標志，也是導致乳腺癌患者及其他癌癥患者死亡的主要原因之一[18]。BCSCs可能是腫瘤侵襲轉移的基礎，當特殊的干性標志物高表達或在腫瘤微環(huán)境(趨化因子、轉錄因子以及蛋白)作用下可促進乳腺癌的轉移。

CD44和ALDH的表達與乳腺癌的轉移正相關。研究表明，在異種移植模型中，來自肺轉移的乳腺癌腫瘤細胞CD44表達明顯升高，且與ALDH-細胞相比，ALDH+細胞具有更高的轉移能力。此外，CD44+CD24-細胞的數(shù)量與遠處轉移也顯著相關。研究表明，有淋巴結轉移的三陰性乳腺癌患者中有69.0%檢測到CD44+CD24-表型，而無淋巴結轉移的三陰性乳腺癌患者中有51.7%檢測到CD44+CD24-[19-20]。同樣，與非轉移性乳腺癌組織相比，轉移性乳腺癌組織中CD44高表達，而CD24的表達水平較低[21]?？梢姡珺CSCs可能是腫瘤侵襲轉移的基礎，當CD44和ALDH等干性標志物高表達時，可促進乳腺癌的轉移。

此外，BCSCs在一些特定的腫瘤微環(huán)境作用下可發(fā)生上皮-間質轉化(EMT)，這一轉變使BCSCs獲得某些特性從而促進了乳腺癌的轉移。在腫瘤微環(huán)境中，TGF-β信號轉導是促進腫瘤細胞EMT與侵襲遷移的主要誘因[22-23]。Katsuno等[24]發(fā)現(xiàn)，BCSCs生成和治療抗性的增加，與TGF-β促進乳腺上皮和癌細胞中穩(wěn)定的EMT有關。相反，抑制TGF-β能抑制巨噬細胞誘導的乳腺癌細胞EMT和BCSCs形成；從而降低乳腺癌肺轉移[25]。

值得注意的是，BCSCs發(fā)生增殖與轉移也可直接由某些趨化因子、轉錄因子及蛋白調控。研究顯示，在BCSCs亞群中趨化因子受體CXCR3B明顯上調，異位表達CXCR3B可增加ALDH活性或CD44+CD24-的BCSCs數(shù)量，并增加細胞克隆形成能力，促進癌細胞的遷移與侵襲[26]。此外，Sirkisoon等[27]研究顯示，BCSCs中CD44、Nanog、Sox2和OCT4等干性基因可被轉錄因子TGLI1轉錄激活，導致BCSCs的更新，促進轉移起始部位BCSCs發(fā)生腦轉移。另有研究發(fā)現(xiàn)，休眠BCSCs在自噬相關蛋白7(ATG7)、ATG3或p62/sequestosome-1低表達時，調控BCSCs中6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶3異常表達，從而導致增殖程序和轉移性生長的重新激活，促進乳腺癌轉移[28]。

2.3 乳腺癌干細胞與乳腺癌耐藥

耐藥仍然是癌癥治療中的持續(xù)挑戰(zhàn)，常常導致抗癌療效的減低。BCSCs本身對新輔助化療具有內在抗性[29]。研究發(fā)現(xiàn)，高表達ALDHs或CD44細胞群的乳腺癌患者對化療具有更高的耐受性，因為該細胞具有BCSCs的特征，對常規(guī)化療具有耐藥性[30]。Ryoo等[31]發(fā)現(xiàn)，高表達CD44導致CD44+的BCSCs中p62相關的NRF2激活，進一步促進了CD44+BCSCs的耐藥。ALDH1活性的增加與介導多藥耐藥相關，抑制ALDH1能增加乳腺癌患者對紫杉醇的敏感性[32]。同樣，ALDH1+的BCSCs在化療藥物順鉑治療抵抗中也起重要作用，當減少ALDH+的BCSCs時，順鉑的化療效果顯著增強[33]。此外，BCSCs中ABC家族轉運蛋白的表達增高可能會導致腫瘤的多藥耐藥[34]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，乳腺癌組織中ABCC1與ABCC3轉錄水平較高；并且在化療或抗癌藥物治療后兩種蛋白的轉錄水平進一步增加，當將ABCC1或ABCC3兩個蛋白敲除后，BCSCs干性基因的表達降低，化療敏感性明顯增加。而ABCC3敲除還降低了CD44+CD24-的BCSCs亞群，增加了異種移植小鼠模型體內阿霉素的敏感性。ABCG2轉運蛋白基因的高表達可將治療藥物從細胞中外排，導致BCSCs治療抵抗，通過抑制ABCG2可促進BCSCs死亡，減少治療耐藥[35]。可見，BCSCs中ABC家族轉運蛋白的表達增高會導致腫瘤治療的多藥耐藥，反之，抑制BCSCs中ABC家族轉運蛋白的表達可減少治療腫瘤時多藥耐藥的發(fā)生。

長期以來，活性氧(ROS)的產(chǎn)生一直被認為是化療耐藥的重要介質。近年來研究發(fā)現(xiàn)，BCSCs可能通過增強ROS促進乳腺癌患者的耐藥[36]。Yang等[33]研究發(fā)現(xiàn)，ALDH+的BCSCs和ALDH-的癌細胞具有不同水平的ROS，通過調節(jié)細胞內ROS的生成可增加順鉑的化療敏感性。同樣，Lee等[37]發(fā)現(xiàn)化療后，BCSCs中MYC和MCL1過表達，MYC和MCL1可促進線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ROS，導致BCSCs耐藥性增加。

3 乳腺癌干細胞的靶向治療策略

BCSCs在介導乳腺癌復發(fā)、轉移以及化療耐藥中具有關鍵作用，目前BCSCs靶向治療策略主要有：細胞靶向治療、基因靶向治療以及納米靶向治療等。靶向清除BCSCs可能是克服乳腺癌患者治療失敗和提高患者預后的有效策略。

例如，在細胞靶向治療中，間充質干細胞(MSCs)已成為一種有前景的靶向CSCs治療劑[38]。Mandal等[39]使用海藻酸鈉將圍產(chǎn)期組織沃頓膠(WJMSCs)中的MSCs封裝到微珠中，以研究其對BCSCs的影響。結果顯示，用封裝的WJMSCs(eWJMSCs)處理BCSCs降低了細胞活力，抑制遷移并發(fā)揮抗血管生成作用。進一步基因表達分析結果顯示，eWJMSCs能抑制BCSCs增殖標志物、藥物轉運蛋白、EMT相關標志物和血管生成相關基因的表達。此外，研究也發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(lncRNA)和microRNA(miRNA)可調控CSCs增殖，在靶向惡性腫瘤治療中具有重要的應用價值[40-42]。lncRNA CCAT2通過促進OCT4、Nanog和KLF4等干細胞標志物的表達，增加乳腺球的形成，誘導三陰性乳腺癌中ALDH+BCSCs數(shù)量[43]。miR-205在CD44+CD24-的BCSCs中低表達，過表達miR-205可降低乳腺癌細胞中CD44+CD24-群百分比與細胞活性[44]。在HER2+乳腺癌中，miR-200c的高表達可導致CD44+CD24-的BCSCs細胞數(shù)量明顯減少[45]。分析BCSCs和患者轉移性腫瘤組織發(fā)現(xiàn)，在BCSCs中miR-200c的表達水平降低，而miR-30c的表達水平升高，這與接受新輔助治療的Ⅱ/Ⅲ期患者中分離出的乳腺腫瘤組織表達水平相似[46]。因此，針對miRNA可能有助于開發(fā)靶向BCSCs的治療藥物。

近期一種靶向BCSCs的方法應用分子導向納米技術有效地控制藥物輸送和釋放，不但提高了CSCs對藥物的吸收，而且增加了藥物在細胞內的停留和釋放。Das等[47]研究發(fā)現(xiàn)，Wedelolactone-encapsulated納米可通過下調Sox2和ABCG2增強藥物的停留。此外，它能阻止EMT，抑制細胞遷移和侵襲，降低BCSCs比例,抑制腫瘤生長與轉移。當它與紫杉醇聯(lián)合應用時，可增加紫杉醇化療敏感性，降低ALDH+BCSCs比例。用載于納米金蛋白冠上的SAHA/Wnt-b Catenin拮抗劑能靶向BCSCs，抑制BCSCs數(shù)量[48]。此外，使用靶向干細胞標志物CD133的RNA納米顆粒遞送抗miRNA[49]，以及載有偶聯(lián)的DNA納米序列TA6NT-AKTin-DOX均對BCSCs治療具有靶向性[50]。因此，靶向納米技術治療可為清除BCSCs提供一種有效的藥物傳遞途徑。

值得注意的是，隨著系統(tǒng)生物學與分子生物的革命性進展，生物信息學與“組學”在研究腫瘤特性方面的作用越來越顯著，這將對BCSCs靶向治療提供重要的思路[51-52]。富集BCSCs，對細胞進行單細胞RNA測序，可研究BCSCs向多分化的細胞狀態(tài)轉變過程，并在人群BCSCs中篩選調控的差異基因[53]。另外，Cheng等[54]利用Hydro-Seq追蹤了21例乳腺癌患者組織中BCSCs的表達以及EMT標記的單個細胞，可見，基于“組學”平臺的最新研究可識別與篩選BCSCs耐藥性和轉移相關的不同細胞群、靶點以及基因，開啟了理解BCSCs的新視角，這對靶向BCSCs治療的研究尤為重要。

4 小結

乳腺癌是一種在世界范圍內女性中具有較高發(fā)病率和死亡率的腫瘤性疾病。盡管乳腺癌治療取得了長足的進步，但是由BCSCs引起的復發(fā)、轉移及耐藥仍然是目前治療所面臨的最大挑戰(zhàn)。因此尋求靶向BCSCs的治療策略對于乳腺癌治療顯得尤為關鍵。通過總結BCSCs在復發(fā)、轉移及耐藥中的研究，以及部分靶向BCSCs的主要策略，我們可以展望：①在大多數(shù)情況下，治療期間的活檢很難實施，因此必須開發(fā)新的策略來檢測BCSCs標記；②基于液體活檢中的癌癥標志物的發(fā)現(xiàn)，在血液/血清中鑒定BCSCs標記對于開發(fā)個性化BCSCs治療可能更有效，也對乳腺癌的早期診斷及治療有重要價值；③多種靶向治療策略聯(lián)合：生物信息學與“組學”基于“疾病-基因-靶標-藥物”的相互作用，與小分子靶向藥物“多成分、多靶點、多途徑”的特點不謀而合，這將為開發(fā)靶向BCSCs的小分子藥物提供新視角；④將全基因組轉錄分析轉化為藥物發(fā)現(xiàn)，從而在將來獲得更好的治療效果。因此，對BCSCs更為系統(tǒng)全面的認識，必將有助于提高乳腺癌的臨床治愈率。