劉海港，孫立棟，宋檀婧

華中科技大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，武漢 430030

組蛋白賴氨酸去甲基化酶1A[lysine(K)-specific demethylase 1A，KDM1A或LSD1]是最早被發(fā)現的催化組蛋白賴氨酸去甲基化的酶類[1]。在此之前人們普遍對組蛋白賴氨酸是否存在去甲基化修飾存在爭議，該酶的發(fā)現揭示了組蛋白賴氨酸去甲基化修飾機制的存在，同時也佐證了組蛋白的甲基化修飾是動態(tài)的，而非不可逆的。目前已經有約20種組蛋白去甲基化酶被發(fā)現，能夠催化包括H3K4，H3K9，H3K27，H3K36和H4K20等多種位點在內的組蛋白去甲基化。

1 LSD1的結構和生理功能

Nagase等[2]于1998年最早克隆出了KDM1A基因，該基因位于1號染色體短臂上，全長64249 bp，包含19個外顯子和18個內含子，能夠編碼886個氨基酸。RT-PCR結果顯示，除了胰腺和脾臟外，LSD1在全身幾乎所有組織中均有表達，并且在腎臟和睪丸組織中表達最高。

LSD1是黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴的胺氧化酶家族的一員，可以通過輔基FAD催化氧化反應特異性脫去組蛋白H3第4位的賴氨酸(H3K4)和H3第9位賴氨酸(H3K9)的一甲基化和二甲基化的甲基，但不能脫去三甲基化的甲基[1]。LSD1主要由3個結構域構成，N端的SWIRM結構域、C端的AOL結構域以及中央伸出的Tower結構域(圖1)。SWIRM有利于維持LSD1的穩(wěn)定性，并且和AOL結構域存在廣泛的相互作用，形成大約1600 nm2的接觸面。Tower結構域是從AOL結構域中央伸出的兩個反向平行的α螺旋，將AOL結構域分成兩個部分。AOL結構域也包含兩個子域，分別是底物結合域和FAD結合域[3]。

圖1 LSD1的晶體結構(PDB ID：2HKO)Fig.1 The crystal structure of LSD1(PDB ID：2HKO)

LSD1在細胞內通常和CoREST、BHC80以及HDAC1/2等LSD1相關蛋白構成轉錄共抑制復合物。這些LSD1相關蛋白參與調節(jié)LSD1的活性，其中CoREST的SANT2結構域和LSD1的Tower結構域相互結合使得LSD1更穩(wěn)定，同時CoREST也能通過SANT2結構域結合核小體上的DNA，從而使LSD1能夠催化以核小體為底物的去甲基化反應[4]。Wang等[5]發(fā)現LSD1還存在于核小體重塑和去乙酰化酶(NuRD)復合體內。在復合體內，LSD1的Tower結構域可以與NuRD復合體內的轉移性腫瘤抗原1-3(MTA1-3)直接結合，而MTA1-3上也存在SANT結構域，可以協(xié)助LSD1錨定在核小體上，從而發(fā)揮與CoREST類似的作用。

作為特異性催化H3K4me1/2和H3K9me1/2的組蛋白賴氨酸去甲基化酶，LSD1對組蛋白H3去甲基化修飾后引起的下游生物學效應取決于組蛋白賴氨酸的甲基化修飾對基因轉錄的作用是激活還是抑制，其中H3K4甲基化多數情況下會激活相關基因轉錄，而H3K9的甲基化修飾則一般會抑制基因轉錄[6]。例如，使用胺氧化酶抑制劑Pargyline抑制LSD1的去甲基化酶活性，可以觀察到前列腺特異抗原(prostate-specific antigen，PSA)基因啟動子區(qū)域H3K9甲基化水平升高以及PSA表達量降低[7]。對秀麗隱桿線蟲的研究也表明，H3K4去甲基化會導致細胞衰老的相關基因沉默[8]。

LSD1還能與雄激素受體(androgen receptor，AR)結合，促進雄激素受體依賴的基因表達。首先，雄激素(配體)和AR的結合導致AR發(fā)生細胞核轉位，定位到AR靶基因的雄激素反應元件上。在細胞核內，LSD1與AR共同構成染色質相關功能復合物來催化位于靶基因啟動子區(qū)域的H3K9一甲基化和二甲基化的脫甲基化反應[9]。

此外，LSD1能使DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，Dnmt)去甲基化，同時起到穩(wěn)定Dnmt1的作用[10]。Dnmt1是一種重要的DNA甲基轉移酶，具有催化DNA甲基化的作用。因而LSD1有利于DNA的甲基化，從而導致基因轉錄抑制。

2 人體胚胎干細胞介紹

胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)分離于囊胚期的內細胞團，具有多潛能性和自我更新的能力。在一定條件下，人ESC能分化為體內三胚層來源的任何細胞。ESC自我更新能力和多能性的維持依賴于復雜的信號轉導通路和轉錄因子構成的轉錄調控網絡，其中Oct4、Sox2和Nanog等轉錄因子在轉錄調控網絡中處于核心地位[11]。研究表明，表觀遺傳調控在胚胎干細胞的自我更新和分化過程中也發(fā)揮著重要的功能，胚胎干細胞分化過程中的表觀遺傳學機制已成為干細胞領域一個新的研究熱點[12]。

3 表觀遺傳修飾與胚胎干細胞分化

表觀遺傳修飾是指DNA序列保持不變而基因表達發(fā)生可遺傳的變異的現象。表觀遺傳變化主要包括DNA的修飾、組蛋白的修飾、非編碼RNA作用和染色質重塑等。表觀遺傳變化的產生是環(huán)境和細胞內遺傳物質相互作用的結果，最終體現在基因表達的變化上，產生基因沉默、休眠轉座子激活、基因印記和核仁顯性等生物學效應[13]。眾多研究表明，腫瘤發(fā)生發(fā)展、衰老以及胚胎發(fā)育等生命過程都受到表觀遺傳的調控[14-16]。

3.1 DNA甲基化與胚胎干細胞分化

DNA甲基化是目前研究得最深入的DNA共價修飾類型。DNA甲基化是在Dnmt的作用下，由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基共價結合到DNA胞嘧啶的第5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶的過程，常于CpG島處發(fā)生。DNA甲基化能直接遏制轉錄因子與靶基因的結合，抑制基因轉錄；除此之外甲基化結合蛋白會通過甲基化DNA結合結構域結合在DNA上，這些蛋白同時是轉錄抑制因子，能誘導染色體狀態(tài)的改變，從而抑制基因的轉錄[17]。

DNA甲基化在胚胎干細胞分化中起重要的調控作用，基因組甲基化的異常會導致嚴重的胚胎發(fā)育障礙[18]。在生殖細胞形成和早期胚胎形成期，生殖細胞和胚胎細胞基因組分別發(fā)生一次整體水平的去甲基化后重新甲基化，稱為DNA甲基化重編程。發(fā)生于配子形成期的DNA甲基化重編程的目的是使親代印跡基因被去除再重新確立；發(fā)生于早期胚胎形成時期的DNA甲基化重編程對受精卵獲得全能性并產生新個體是至關重要的[19]。Shen等[20]研究發(fā)現，在胚胎干細胞向神經祖細胞分化的過程中，大約有1.4%的CpG島區(qū)域發(fā)生了顯著的DNA重新甲基化過程。胚胎干細胞的定向分化過程也受到DNA甲基化水平的調控。Singh等[21]在造血干細胞分化過程中檢測到珠蛋白基因啟動子區(qū)域發(fā)生去甲基化。Yoon等[22]發(fā)現用具有強烈甲基化酶抑制效應的試劑可以誘導人胚胎干細胞向心肌細胞分化。

3.2 組蛋白甲基化與胚胎干細胞分化

組蛋白修飾常發(fā)生在組蛋白尾部的賴氨酸和精氨酸殘基上，包括乙?；⒓谆?、磷酸化、泛素化等多種共價修飾類型。乙酰化和甲基化是最主要、最常見的組蛋白修飾類型，參與組蛋白甲基化和乙?；揎椀拿阜謩e是組蛋白甲基轉移酶(histone methyltransferase，HMT)和組蛋白乙酰基轉移酶(histone acetyltransferase，HAT)。組蛋白N端特異性殘基的乙?；梢韵魅鮀NA和組蛋白之間的相互作用，使?jié)饪s的染色質結構變得松散，基因轉錄活性增強。組蛋白甲基化主要發(fā)生在組蛋白H3、H4的N端賴氨酸和精氨酸殘基上，其中組蛋白賴氨酸的甲基化殘基總共有6種(H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79、H4K20)，且均能被單甲基化、二甲基化和三甲基化。組蛋白賴氨酸甲基化的生物學效應比較復雜，取決于發(fā)生甲基化的位點和甲基化的程度，可以是轉錄激活，也可以是轉錄抑制。

目前已有較多的研究表明組蛋白的甲基化在胚胎干細胞多潛能特性的維持中發(fā)揮著重要的作用[23]。ESC為了維持其多潛能性必須抑制分化基因表達，二價染色體區(qū)域的建立有助于這一過程。胚胎干細胞細胞核內的二價染色體區(qū)域是指抑制基因表達的H3K27me3修飾和激活基因表達的H3K4me3共同存在的區(qū)域。分化相關基因的H3K27me3修飾丟失和H3K4me3修飾保留會促進分化基因轉錄激活從而導致胚胎干細胞沿一定方向分化。當分化方向確定后，其他分化基因H3K27me3修飾的保留和H3K4me3修飾丟失則會抑制這些基因表達，胚胎干細胞向其他方向的分化也被關閉[24-25]。通常情況下，在二價染色體區(qū)域H3K27me3的抑制效應要強于H3K4me3的激活效應，所以二價染色體區(qū)域的作用是沉默分化相關基因[24]。

4 LSD1在胚胎干細胞分化中的作用

胚胎干細胞的分化過程依賴于兩類基因表達的協(xié)同調節(jié)，分別是譜系特異基因表達的激活和多潛能性基因(pluripotency genes，PpGs)表達的抑制。Lsd1-Mi2/NuRD復合物能沉默PpGs的增強子從而抑制多潛能性基因的表達、調控胚胎干細胞的分化過程。Petell等[26]深入研究了Lsd1-Mi2/NuRD復合物作為胚胎干細胞分化的動態(tài)調節(jié)開關在誘導組蛋白尾部和Dnmt3的ADD結構域局部相互作用導致PpGs啟動子區(qū)域DNA甲基化的機制。組蛋白尾部未甲基化的H3K4與Dnmt3a ADD結構域的相互作用能激活Dnmt3a的催化活性，引起PpGs增強子區(qū)域DNA的甲基化。這種相互作用能夠被H3K4一甲基化和組蛋白乙?；钄郲27]。因此，LSD1與Mi2/NuRD去乙?；瘡秃衔锏南嗷プ饔脤е铝薍3K4me1的去甲基化和H3K27ac的去乙?；?，引起Dnmt3a的激活，從而提高了PpG基因增強子區(qū)域的DNA甲基化水平，抑制PpG基因的增強子活化和轉錄激活。

除此之外，一種組蛋白甲基轉移酶Mll4能夠被特異性募集到目標染色質的增強子區(qū)域，這種募集過程在胚胎干細胞由原始態(tài)多能性向始發(fā)態(tài)多能性的轉換中發(fā)揮著必不可少的作用[28]。研究表明，LSD1與Mll4共定位于染色質上相同的增強子區(qū)域，并且在Mll4敲除的胚胎干細胞內，LSD1能夠結合到基因的增強子上，引起H3K4me1去甲基化，解除增強子的功能，從而導致基因轉錄抑制和胚胎干細胞多能性狀態(tài)轉換失敗[28]。而靶向LSD1的基因敲低在很大程度上恢復了Mll4敲除的胚胎干細胞中的轉錄失調，表明Mll4缺失引起的多能性轉變中的轉錄缺陷依賴于LSD1的組蛋白表觀遺傳修飾功能。

Guo等[29]研究發(fā)現LSD1通過介導GATA-2轉錄因子的抑制在胚胎干細胞和造血干(祖)細胞紅系分化中發(fā)揮著至關重要的作用。GATA-1和GATA-2是調節(jié)造血譜系分化的重要轉錄因子，尤其是在紅系分化中起關鍵性的作用。在干細胞紅系分化過程中，LSD1被TAL1募集到GATA-2基因座位上并發(fā)揮去甲基化酶活性引起GATA-2基因座附近H3K4me2水平降低，從而抑制了GATA-2基因的轉錄。研究者們在胚胎干細胞內用shRNA介導的基因沉默技術敲低LSD1，然后用促紅細胞生成素誘導其分化。隨后的檢測結果顯示，和對照組相比，LSD1敲低的胚胎干細胞出現了紅系造血分化被抑制的現象。

曾經有文獻報道LSD1在干細胞發(fā)育的多個階段的表型轉換點都是不可或缺的，其中就包括脂肪組織的形成[30]。Xiong等[31]為了深入探究LSD1在人類胚胎干細胞向脂肪組織分化中的作用，用不同濃度的LSD1的抑制劑CBB1007處理人類胚胎干細胞，觀察胚胎干細胞被誘導因子誘導向脂肪組織分化的情況。研究者在實驗中檢測到隨著LSD1抑制劑CBB1007濃度的增加，胚胎干細胞脂肪分化的效率也會提升。這說明在胚胎干細胞脂肪分化的過程中，LSD1的抑制能夠促進脂肪組織的生成。研究者們還發(fā)現LSD1的抑制導致了組蛋白H3K4me2水平和PPARγ和C/EBPα表達水平的升高。PPARγ和C/EBPα是調控人類胚胎干細胞向脂肪組織分化的主要轉錄因子，它們的啟動子區(qū)域存在H3K4me2[32]。這些結果表明LSD1的抑制可能通過增加PPARγ和C/EBPα啟動子區(qū)域H3K4me2水平，促進PPARγ和C/EBPα基因的表達，從而導致脂肪組織形成。

有研究表明LSD1的減少會導致Sox2，Oct4等在胚胎干細胞自我更新和全能性的維持中起重要作用的轉錄因子的轉錄水平下調，從而抑制具有全能性的胚胎干細胞的自我更新[33-34]。在鼠胚胎干細胞內，SET7甲基轉移酶催化Sox2第119位的賴氨酸的單甲基化修飾過程，引發(fā)了泛素依賴的Sox2蛋白水解作用[35]。Zhang等[36]研究表明LSD1作為去甲基化酶能夠去除Sox2蛋白上的多種甲基化基團，從而抑制Sox2甲基化引起的泛素依賴的蛋白水解過程。研究者們進一步的實驗發(fā)現LSD1的下調會促進Sox2蛋白水解，但是這種作用會被SET7的失活所阻斷。這項結果證實了SET7和LSD1可以通過催化Sox2蛋白特異位點發(fā)生甲基化或者去甲基化，從而影響Sox2的穩(wěn)定性，并進而在胚胎干細胞自我更新和全能性的維持中發(fā)揮調節(jié)作用。

Vinckier等[37]的研究表明，在胚胎干細胞向組織細胞分化發(fā)育的過程中會受到很多分化信號的誘導和調節(jié)，每一種分化信號作用一段時間后就必須終止，否則會影響細胞下一個階段的誘導分化。例如，在胰腺內分泌細胞分化的過程中需要視黃酸這一信號的誘導，從而引起相關基因增強子激活和表達水平升高。而LSD1則能通過解除增強子的功能使得被視黃酸信號誘導激活的基因沉默，從而及時終止視黃酸信號對細胞分化的誘導作用，促進細胞轉換到下一個分化階段。研究者觀察到，當LSD1活性被抑制后，被視黃酸誘導激活的基因不能被沉默，即使此時去除視黃酸這一誘導信號，細胞仍然不能過渡到下一個分化階段。這證明了LSD1在調控分化信號誘導的細胞轉錄水平改變中的重要作用。

He等[38]研究發(fā)現LSD1的抑制能促進胚胎干細胞向胰島素生成細胞(insulin producing cell，IPC)分化并幫助IPC成熟。該研究采用適當的誘導技術從人胚胎干細胞H9細胞系中誘導產生IPC，并且通過慢病毒載體介導的shRNA技術降低LSD1表達水平。接下來研究者們觀察到LSD1的mRNA水平降低以及LSD1蛋白表達量在干細胞向IPC分化的過程中逐漸減少。為了探究LSD1調控人胚胎干細胞向IPC分化的具體機制，研究者們用Western blot檢測了分化過程各時期關鍵的信號通路蛋白表達水平的改變。其中，ERK信號通路在分化過程中持續(xù)激活。并且在用shRNA敲低LSD1的分化細胞中，總的ERK表達水平被檢測到劇烈減少，而磷酸化ERK水平明顯升高。在用LSD1的抑制劑TCP處理的細胞中也觀察到了這樣的結果。許多文獻報道ERK/MAPK信號通路對胚胎干細胞的分化調控十分關鍵[39-40]。例如，Kim等[39]曾證明ERK介導的Nanog磷酸化通過影響Nanog蛋白的穩(wěn)定性在胚胎干細胞的自我更新中發(fā)揮著重要作用?？傊?，研究者還通過后續(xù)一系列實驗證實了LSD1的抑制通過引起ERK信號通路激活促進人胚胎干細胞向IPC分化的機制。

5 總結和展望

綜合以上所述不難發(fā)現，LSD1調控胚胎干細胞分化的一般模式是通過影響分化關鍵基因啟動子區(qū)域的甲基化水平，繼而調節(jié)轉錄水平，最終導致分化的增強或是抑制?？傊?，LSD1在胚胎發(fā)育尤其是胚胎干細胞的分化發(fā)育中發(fā)揮著重要的調控作用。胚胎干細胞未分化狀態(tài)的維持、分化方向的決定都有賴于LSD1的脫甲基化機制。對LSD1的研究，將有助于進一步闡明表觀遺傳學在胚胎干細胞自我更新和分化中的調控機制，為胚胎干細胞臨床應用奠定基礎。

然而，目前的研究成果主要集中在LSD1通過催化H3K4的去甲基化調控胚胎干細胞分化，對于LSD1催化H3K9去甲基化對胚胎干細胞發(fā)育的影響很少述及。除此之外，其他非組蛋白如p53等也能作為LSD1的去甲基化底物。非組蛋白底物的甲基化水平改變是否會影響胚胎干細胞分化進程仍有待進一步的研究。