結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界第三大常見惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)每年大約有80萬人死于CRC[1]，嚴重威脅人類的健康。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與補體調(diào)節(jié)蛋白(complement regulatory protein，CRP)參與的免疫逃逸機制有著十分密切的關(guān)系[2]。在腫瘤組織上高表達的CRP與腫瘤抵抗補體介導(dǎo)的腫瘤殺傷機制有關(guān)，并且可使腫瘤逃避機體免疫攻擊[3]。衰變加速因子(decay-accelerating factor，DAF)作為重要的CRP，在多種腫瘤中高表達[4-5]，且與不良預(yù)后有關(guān)[6]。核苷酸多態(tài)性不僅是影響人群腫瘤易感性的重要因素，也是揭示腫瘤異質(zhì)性的原因之一。鑒于DAF在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，本研究通過檢測可能影響DAF基因表達和功能的單核苷酸多態(tài)性在CRC病人和正常對照組中的分布情況，探討DAF遺傳變異與老年CRC發(fā)病風險的關(guān)系，為CRC病因探索提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究經(jīng)華北理工大學倫理委員會批準并與所有入組病人簽署知情同意書。入選華北理工大學附屬唐山市工人醫(yī)院及華北理工大學附屬唐山市人民醫(yī)院于2008年4月至2012年12月收集的病理診斷為CRC的外周血標本，其中結(jié)腸癌病人380例，直腸癌病人450例，排除有其他惡性腫瘤病史的人群；入選同一時期在該院進行體檢的健康人群作為對照組，按年齡和性別分別與病例組進行成組設(shè)計，隨機選取380例健康人外周血作為結(jié)腸癌對照組，隨機選取450例健康人外周血作為直腸癌對照組，排除既往腫瘤史或與病例組有血緣關(guān)系的人群。

1.2 DAF基因位點選擇 通過Ensembl數(shù)據(jù)庫篩選DAF基因多態(tài)性位點，篩選條件：在亞洲人群次要等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)>0.05，最終確定rs150046210，遺傳變異點插入21個堿基，命名為Ⅱ基因型，缺失21堿基命名為DD基因型。

1.3 研究方法 EDTA抗凝管收集每個志愿者清晨空腹靜脈血5 mL。使用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒(DP318)提取外周血DNA，嚴格按試劑盒說明書操作并將提取產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱儲存。采用primer 5.0軟件設(shè)計DAF rs150046210 PCR引物，正向引物序列：5′-TCGTAAATAAGGAGAACCCG-3′，反向引物序列：5′-TACTGGGAGGTCTGTCAAAG-3′。PCR反應(yīng)體系包括2×Ftax PCR Mix混合液3μL，基因組DNA約1～20 ng，10μmol/μL的上下游引物各0.1μL，后補足去離子水至6μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸3 min。使用3.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DD基因型為一個196 bp的片段，DI基因型為196 bp和217 bp的兩個片段，Ⅱ基因型為一個217 bp的片段。每次PCR實驗均設(shè)置空白對照孔以避免實驗出現(xiàn)假陽性結(jié)果。為保證本研究基因分型的可靠性，隨機抽取10% DNA標本進行重復(fù)實驗，且重復(fù)結(jié)果與原結(jié)果一致。

1.4 統(tǒng)計學分析 將資料整理后用Excel錄入數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。使用χ2檢驗比較病例組與對照組基本信息(性別、年齡、吸煙和飲酒狀況)及基因型的分布是否有差異。應(yīng)用非條件Logistic回歸分析經(jīng)性別、年齡、吸煙和飲酒狀況調(diào)整后的OR及95%CI，分析比較不同基因型與CRC易感性之間的關(guān)系。所有的統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象人口特征情況 本研究納入結(jié)腸癌男205例(53.9%)，女175例(46.1%)，其對照組男220例(57.9%)，女160例(42.1%)。直腸癌病例男298例(66.2%)，女152例(33.8%)，其對照組男308例(68.4%)，女142例(31.6%)。結(jié)腸癌組、直腸癌組病例分別與對照組比較，性別、年齡、吸煙和飲酒狀態(tài)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表示病例組與對照組間具有良好的可比性。見表1。

表1 研究對象基本特征(n，%)

2.2 DAF rs150046210多態(tài)性與CRC發(fā)病風險的關(guān)系 在結(jié)腸癌和直腸癌的對照組中，基因型的分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(HWE)，研究對象具有良好的代表性。非條件Logistic回歸分析顯示，與DAF rs150046210 DD基因型攜帶者相比，Ⅱ基因型攜帶者結(jié)、直腸癌發(fā)病風險均明顯升高(OR=1.764，95%CI：1.763～2.675，P=0.008；OR=1.789，95%CI：1.227～2.608，P=0.003)。見表2。

表2 DAF rs150046210多態(tài)性與CRC發(fā)病風險的關(guān)系

2.3 DAF rs150046210遺傳變異與CRC發(fā)病風險分層分析 為了進一步分析DAF rs150046210遺傳變異與CRC發(fā)病風險的關(guān)系，對與CRC相關(guān)的多種因素(性別、年齡、吸煙和飲酒)進行分層分析。性別分層分析顯示，女性中Ⅱ基因型攜帶者結(jié)腸癌的發(fā)病風險增加(OR=2.015，95%CI:1.085～3.742)；男性中Ⅱ基因型攜帶者直腸癌的發(fā)病風險增加(OR=2.041，95%CI:1.290～3.228)。年齡分層分析顯示，低年齡組Ⅱ基因型攜帶者結(jié)腸癌的發(fā)病風險增加(OR=2.355，95%CI:1.273～4.356)；高年齡組Ⅱ、DI基因型攜帶者直腸癌的發(fā)病風險增加(OR=2.313，95%CI:1.334～4.012；OR=1.757，95%CI:1.106～2.789)。吸煙分層分析顯示，Ⅱ基因型可以增加不吸煙病人結(jié)腸癌、直腸癌的發(fā)病風險(OR=1.791，95%CI:1.106～2.900；OR=2.395，95%CI:1.514～3.788)。飲酒分層分析顯示，Ⅱ基因型增加不飲酒病人結(jié)腸癌、直腸癌的發(fā)病風險(OR=1.714，95%CI：1.086～2.704；OR=1.923，95%CI:1.221-3.030)，見表3，4。

表3 DAF rs150046210多態(tài)性與結(jié)腸癌發(fā)病風險分層分析

表4 DAF rs150046210與直腸癌發(fā)病風險分層分析

3 討論

DAF位于1號染色體長臂的補體調(diào)控位置[7]，作為重要的CRP，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，被認為是癌癥治療的重要分子靶標。DAF屬于膜結(jié)合型補體調(diào)節(jié)蛋白，通過抑制補體攻膜復(fù)合物的形成，從而使腫瘤細胞逃脫補體攻擊。有研究認為,過表達DAF是CRC預(yù)后不良標志之一[8]。惡性腫瘤相關(guān)基因遺傳多態(tài)性是影響人群腫瘤易感性的重要因素之一，探討CRC相關(guān)基因與其遺傳特征的關(guān)系對降低腫瘤的發(fā)生率和死亡率具有非常重要的意義。

之前有研究表明，DAF基因編碼區(qū)遺傳變異可增加個體罹患胃癌[9]和非小細胞肺癌[10]的風險。但是關(guān)于DAF非編碼區(qū)的遺傳變異是否影響老年人患CRC的發(fā)生風險還鮮有報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)DAF rs150046210顯著增加了老年個體罹患CRC的發(fā)病風險。

吸煙和飲酒是CRC發(fā)病的危險因素，但本研究以吸煙、飲酒狀況對CRC組和對照組進行分層分析后發(fā)現(xiàn)，DAF基因rs150046210變異只增加不吸煙、不飲酒病人CRC的發(fā)病風險，并未發(fā)現(xiàn)吸煙、飲酒與攜帶Ⅱ等位基因?qū)RC發(fā)病風險有交互作用。這可能是因為吸煙、飲酒作為CRC的危險因素所產(chǎn)生的主效應(yīng)掩蓋了DAF基因多態(tài)性在CRC發(fā)病過程中所起的作用，所以只有在不吸煙、不飲酒人群中才能觀察到DAF基因多態(tài)位點對CRC的影響；也可能是因為進行分層分析后的吸煙、飲酒組樣本量較小導(dǎo)致結(jié)果的偶然性。因此，對于DAF基因非編碼區(qū)基因多態(tài)性僅影響不吸煙、不飲酒者CRC發(fā)病風險的確切機制還有待進一步探索。

本研究以60歲為標準對CRC組和對照組進行年齡分層分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于DAF rs150046210 ID/DD基因型攜帶者，在年齡≤60歲亞組及女性亞組中，Ⅱ基因型攜帶者罹患結(jié)腸癌的風險分別增加了1.355倍和1.015倍；相對于DAF rs150046210 ID/DD基因型攜帶者，在年齡>60歲亞組及男性亞組中，Ⅱ基因型攜帶者罹患直腸癌的風險分別增加了1.313倍和0.257倍。表明DAF rs150046210變異使低年齡組和女性罹患結(jié)腸癌發(fā)病風險增高，也會增加高年齡組男性患直腸癌的發(fā)病風險。所以，DAF rs150046210變異對CRC易感性有影響，此外，環(huán)境等其他因素長期的協(xié)同作用也可能會增加患病風險。

綜上所述，本研究結(jié)果表明DAF rs150046210變異影響老年人患CRC的遺傳易感性，進一步為探索補體系統(tǒng)在惡性腫瘤中的作用提供了理論依據(jù)。