鄭靜鈴 漳州市云霄縣東廈鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 福建漳州 363300

肺炎克雷伯菌是重要的人畜共患條件致病菌，被認(rèn)為是抗生素耐藥性傳播的關(guān)鍵[1-3]。喹諾酮類抗生素是養(yǎng)殖上運(yùn)用廣泛的一類抗菌藥物[4]。由于過(guò)度使用，對(duì)喹諾酮類抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌不斷增加[3]。本研究通過(guò)分離規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)、大型農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)以及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)周邊社區(qū)的肺炎克雷伯菌，了解喹諾酮類抗生素耐藥現(xiàn)狀，并進(jìn)一步檢測(cè)喹諾酮類抗生素耐藥基因，旨在探討豬源性肺炎克雷伯菌在喹諾酮類抗生素的耐藥表型與耐藥基因型的相關(guān)性，為養(yǎng)豬業(yè)臨床了解肺炎克雷伯菌耐藥性的發(fā)生及傳播提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 20 株喹諾酮類抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌，均分離自福建省內(nèi)規(guī)模化豬場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PCR 鑒定與擴(kuò)增 用PCR 法篩查20 株喹諾酮類抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌耐藥基因攜帶情況[5-6]。檢測(cè)基因分別為質(zhì)粒介導(dǎo)的qnrS 基因，aac(6′)-Ib 基因和oqxA/B 外排系統(tǒng)[7]，以及由染色體介導(dǎo)的gyrA/B 和parC/E 基因[8]。

1.2.2 測(cè)序及序列分析 對(duì)攜帶gyrA/B 和parC/E基因的菌株，取有目的條帶的PCR 產(chǎn)物外送測(cè)序。于NCBI 上下載gyrA/B 和parC/E 基因序列，采用SnapGene 3.2.1 軟件對(duì)基因突變位點(diǎn)進(jìn)行分析[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 鑒定結(jié)果 用特異性引物對(duì)喹諾酮類耐藥的肺炎克雷伯菌進(jìn)行g(shù)yrA/B、parC/E、qnrS、aac(6′)-Ib 和oqxA/B 的PCR 鑒定。本試驗(yàn)檢測(cè)出gyrA 突變，而未測(cè)到gyrB、parE 和parC 突變。gyrA 擴(kuò)增出814 bp 的條帶，分離率40.0%（8/20）；qnrS 擴(kuò)增出492 bp 的條帶，分離率35%（7/20）；aac(6′)-Ib 擴(kuò)增出481 bp 的條帶，分離率30%（6/20）；oqxA/B 擴(kuò)增出310 bp 和513 bp 的條帶，分離率分別為45%（9/20）、40%（8/20）。

2.2 gyrA/B 和parC/E 基因序列突變分析 gyrA83位絲氨酸突變檢出率為40%（8/20），其中g(shù)yrA83 位絲氨酸突變成為了亮氨酸、異亮氨酸和酪氨酸，檢出率分別為30%（6/20）、5%（1/20）和5%（1/20）。gyrA87 位天冬氨酸的突變檢出率25%（5/20），分別突變?yōu)樘於０泛捅彼?，檢出率分別為20%（4/20）和5%（1/20），見表1。說(shuō)明gyrA 突變是肺炎克雷伯菌產(chǎn)生喹諾酮類耐藥的重要機(jī)制。

表1 gyrA/B 和parC/E 基因序列突變情況

2.3 質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因檢出情況 在12 株未發(fā)生gyrA 突變的喹諾酮類抗生素耐藥肺炎克雷伯菌中，檢測(cè)出9 株菌分別攜帶數(shù)種質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因。aac(6′)-Ib 檢出率為50%（6/12），qnrS 檢出率為58%（7/12），oqxA/B 檢出率分別為75%（9/12）和67%（8/12），見表2。說(shuō)明質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類抗性基因在單獨(dú)作用時(shí)也能使細(xì)菌產(chǎn)生高水平耐藥。

表2 質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因檢出情況

3 結(jié)論

規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)以及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)周邊社區(qū)構(gòu)成了肺炎克雷伯菌傳播鏈，在該傳播鏈中分離的肺炎克雷伯菌都是與豬場(chǎng)相關(guān)聯(lián)的[10]。豬源性肺炎克雷伯菌對(duì)喹諾酮類抗生素耐藥的主因是由染色體介導(dǎo)的gyrA 基因突變所致。未發(fā)生gyrA 突變的耐藥菌檢出攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因，說(shuō)明質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因作用于菌株時(shí)也能產(chǎn)生不同程度耐藥。