董雪，姚兆群，曹小蕾，田芳，趙思峰

(新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點實驗室/石河子大學農(nóng)學院，新疆 石河子 832003)

分枝列當(PhelipancheaegyptiacaPers) 屬列當科的全寄生性雜草，可寄生葫蘆科、茄科、豆科、菊科、傘形科、土字花科等多種植物，可對甜瓜、籽瓜、番茄、馬鈴薯、煙草、扁豆和胡蘿卜等重要經(jīng)濟作物產(chǎn)量造成嚴重損失[1-3]。分枝列當缺少葉綠素只能通過吸器與寄主維管束連接獲得營養(yǎng)，使得難以篩選出有效殺滅分枝列當而對寄主安全的除草劑，同時分枝列當寄生過程主要發(fā)生在寄主根部，待其從地下長出后再進行化學防治或者人工拔除，已對寄主造成嚴重損失。分枝列當?shù)倪@些生物學特性使其防治極其困難，導致發(fā)生嚴重地區(qū)的農(nóng)民不得不改種經(jīng)濟效益低的作物，甚至棄耕土地[4-6]。了解分枝列當?shù)募纳^程對制定合理的防控策略具有重要意義，已有轉(zhuǎn)錄組、基因組數(shù)據(jù)分析揭示了一些基因與分枝列當種子萌發(fā)、吸器形成及與寄主建立寄生關(guān)系相關(guān)[7-9]，但由于分枝列當是全寄生性雜草，缺乏成熟的轉(zhuǎn)化與再生體系，導致相關(guān)基因的功能驗證存在困難[10]。

對全寄生種子植物的組織培養(yǎng)研究主要集中于列當科的肉蓯蓉上，已從荒漠肉蓯蓉的莖、幼芽、鱗片、花瓣、子房、雄蕊和種子等多種組織和器官中誘導得到了愈傷組織，但沒有培養(yǎng)出組培苗[11-13]。目前已有采用B5培養(yǎng)基誘導出Phelipancheramosa和用MS培養(yǎng)基誘導出分枝列當愈傷組織的報道，但缺乏進一步的研究[14-15]。本研究的目的是優(yōu)化一種能夠產(chǎn)生大量高效再生的分枝列當愈傷組織的方法，通過優(yōu)化培養(yǎng)基和不同激素的組合去誘導愈傷組織的產(chǎn)生，并進一步通過激素調(diào)節(jié)誘導愈傷組織使其分化，最終為采用遺傳轉(zhuǎn)化研究分枝列當侵入寄主以及寄主植物抗性之間的相互作用機制提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2018年7月從新疆維吾爾自治區(qū)昌吉回族自治州軍戶農(nóng)場加工番茄上采集成熟的分枝列當植株和種子，經(jīng)形態(tài)學和分子生物學鑒定將其鑒定為分枝列當，去除雜質(zhì)并在常溫黑暗條件下保存于實驗室備用。

1.2 種子消毒

稱取分枝列當種子0.4 g于10 mL離心管中，并在超凈工作臺上用75%的酒精消毒處理5 min，然后再用含有0.02%(V/V)Tween-20的2%(V/V)次氯酸鈉溶液中處理20 min，最后用滅菌的去離子水沖洗5至8次直至上清液變?yōu)榍宄簾o色，對種子進行消毒殺菌。

1.3 種子預培養(yǎng)

將1 mL吸頭剪去0.5 cm，用洗頭吸取消毒處理后的分枝列當種子，均勻點放在鋪有2層玻璃纖維濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，并加入2 mL無菌水潤濕。所使用的玻璃纖維濾紙、培養(yǎng)皿及吸頭均需提前在高溫高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，并用錫箔紙包裹培養(yǎng)皿保持黑暗條件。

再將處理好的種子置于24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行種子預培養(yǎng)。預培養(yǎng)4 d后，加入10-7mol/L GR24(人工合成的獨腳金內(nèi)酯類似物)溶液以刺激分枝列當種子萌發(fā)，其中所使用的GR24需過濾除菌(在沒有種子萌發(fā)刺激物的作用下，列當種子不萌發(fā))。

1.4 誘導愈傷組織外植體的篩選

分枝列當種子在預培養(yǎng)4天后，分別選擇用GR24處理1、2、3、4、5、6、7 d的種子轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基中，每個處理設(shè)3個重復，4周后統(tǒng)計愈傷組織的誘導率。

1.5 愈傷組織誘導

以MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂+600 mg/L水解酪蛋白和B5+3%蔗糖+0.7%瓊脂+600 mg/mL水解酪蛋白(pH5.8)為基本培養(yǎng)基，分別添加1 mg/L 2，4-D、1 mg/L IAA、8 mg/L GA3三種激素的相互組合作為愈傷組織的誘導培養(yǎng)基，所用的激素和培養(yǎng)基見表1。

將萌發(fā)的分枝列當種子接種于上述培養(yǎng)基上進行黑暗培養(yǎng)，每個培養(yǎng)皿放入約0.03 g分枝列當萌發(fā)的種子，每個處理設(shè)10個重復，24 ℃暗培養(yǎng)4周后觀察并統(tǒng)計所形成愈傷組織顏色，平均直徑大小及質(zhì)地情況，篩選出最適分枝列當愈傷組織生長的條件。

1.6 蔗糖含量對列當組織培樣的影響

以B5+0.7%瓊脂+600 mg/L酸水解酪蛋白(pH5.8)和B5+0.7%瓊脂+600 mg/L水解酪蛋白+1 mg/L IAA+8 mg/L GA3(pH5.8)為基本培養(yǎng)基，分別添加1%、2%、3%的蔗糖，24 ℃暗培養(yǎng)，第4周觀察愈傷組織并統(tǒng)計所形成愈傷組織顏色，平均直徑大小及質(zhì)地情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子處理時間對愈傷組織誘導的影響

以不同GR24處理天數(shù)的萌發(fā)的列當種子作為外植體對列當愈傷組織的形成具有一定的影響。在GR24處理4～5 d時為誘導愈傷組織最佳處理時間，更長或更短時間的GR24處理天數(shù)都不利于分枝列當愈傷組組織的形成，在GR24處理1～2 d時，種子萌發(fā)率較低，導致愈傷組織產(chǎn)生率較低，盡管在GR24處理5天以上有種子萌發(fā)率較高，但形成芽管較長，且外植體與空氣接觸面積變大，容易污染，因此，也不利于愈傷組織的形成。

圖1 GR24不同處理天數(shù)對分枝列當愈傷組織誘導的影響

2.2 培養(yǎng)基及激素對分枝列當愈傷組織誘導的影響

將GR24處理過的萌發(fā)的分枝列當種子接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，1周左右可在培養(yǎng)基中觀察到白色的列當愈傷組織，4周后可觀察到愈傷組織形成，直徑約1.8 cm 左右，且呈現(xiàn)絲狀突起的白色團狀物(圖2)。在MS培養(yǎng)基上，形成的團狀愈傷組織較B5培養(yǎng)基所誘導的愈傷組織小(直徑為0.3～0.6 cm)，幾乎無絲狀突起。說明MS中的營養(yǎng)物質(zhì)不適合分枝列當?shù)纳L發(fā)育。

添加生長素與細胞分裂素對植物的愈傷組織誘導有很重要的作用。從表1可知：當培養(yǎng)基中加入2，4-D時，形成的愈傷組織較小，含水量較高，極軟易碎，不易成形。GA3的加入有打破種子休眠作用，增加了種子的萌發(fā)率，有利于分枝列當愈傷組織的形成。因此，處理5所形成的愈傷組織平均直徑最大，且無褐化現(xiàn)象。所以篩選出誘導分枝列當愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基，所添加激素為IAA為1 mg/L，GA3為8 mg/L。

表1 培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)劑對分枝列當愈傷組織形成的影響

圖2 分枝列當四周齡愈傷組織

2.3 蔗糖含量對分枝列當分化的影響

蔗糖含量對分枝列當花芽的發(fā)育有著非常顯著的影響。從表2可知：在無激素添加條件下，隨著蔗糖濃度的增加，其質(zhì)地由疏松逐漸發(fā)育為致密。在1%蔗糖處理中，幾乎看不到花芽的形成；2%蔗糖含量處理中，分枝列當由愈傷組織繼續(xù)分化出花芽的數(shù)量極少。含量在3%的蔗糖濃度中，1周后已長出較長的芽管(圖3A)，2至3周時，出現(xiàn)質(zhì)地較為致密的愈傷組織圖(圖3B、C)，4至5周后可以觀察到分枝列當?shù)挠鷤M織質(zhì)地較為堅硬，隨后分化出淡黃色的花芽(圖3D、E)。但是在無寄主的情況下，可以明顯觀察到分化出花芽的單個個體至少由2個列當種子萌發(fā)后形成的，它們可能會通過相互寄生來繼續(xù)生長(圖3F)。

從表2可以看出：處理4和處理5所形成愈傷組織平均直徑相同，均為1.8 cm，但在處理5中分枝列當?shù)幕ㄑ啃纬陕首罡撸覠o褐化現(xiàn)象。因此，分枝列當愈傷組織分化出花芽的最佳培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基，其蔗糖含量為3%，并且無任何激素的添加。

表2 蔗糖含量對分枝列當愈傷組織花芽分化形成的影響

3 討論

對寄生性種子植物組織培養(yǎng)和分枝列當同科的全寄生植物肉蓯蓉的研究較多，已從荒漠肉蓯蓉的莖、幼芽、鱗片、花瓣、子房、雄蕊和種子等多種組織和器官中誘導得到愈傷組織，同時溫度、培養(yǎng)基、激素配比、pH值、光照和誘導子等對愈傷組織的培養(yǎng)和PhGs的合成都有影響[11]。朱永華等[12]以肉蓯蓉花器、肉質(zhì)莖、幼芽、鱗片、子房等作為外植體的研究發(fā)現(xiàn)，以子房、莖塊作為外植體的愈傷組織的誘導率高、時間短，且愈傷組織的質(zhì)地較好，最適培養(yǎng)條件為B5+1 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA。吳新等[13]用添加BA、IBA和GA3的B5培養(yǎng)基，用肉蓯蓉肉質(zhì)莖誘導出了愈傷組織。然而，所有的組織培養(yǎng)僅僅停留在誘導出愈傷組織，未有進一步的研究文獻，這可能與肉蓯蓉寄生生長的遺傳特性有關(guān)。

由于全寄生種子植物分枝列當?shù)纳L發(fā)育相比其他植物較為特殊，其組織培養(yǎng)得到的分化的花芽寄生能力較弱，因此，后續(xù)還需要對誘導出的列當如何與甜瓜根部進一步共培養(yǎng)進行深入研究。

4 結(jié)論

以萌發(fā)的分枝列當種子為外植體，誘導分枝列當愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為B5+1 mg/L IAA+8 mg/L GA3+600 mg/L水解絡(luò)蛋白+2%蔗糖+0.7%瓊脂；在無寄主的條件下，通過添加適量的蔗糖，可以由愈傷組織分化出淡黃色的花芽，這對于寄生植物組織培養(yǎng)的研究來說是一個大的進步。