劉海婷 陸宇

2019年全球新發(fā)1000萬例結(jié)核病患者，我國仍是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一[1]。雖然我國藥物敏感結(jié)核病的治愈率達(dá)93%[2]，但在耐藥結(jié)核病患者不斷增多的情況下，結(jié)核病的臨床治療變得越來越復(fù)雜。為降低單藥治療對細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的風(fēng)險，增大臨床治愈的可能性，臨床迫切需要有新作用機(jī)制的抗結(jié)核藥物和高效的藥物組合方案來最大限度地減少細(xì)菌負(fù)荷，提高治療效果，縮短療程。盡管普遍認(rèn)為抗結(jié)核藥物組合是治療結(jié)核病的一個潛在工具[3]，但并不是任意的藥物組合都對結(jié)核病的治療有效，這需要通過體內(nèi)外篩選實驗來獲得具有高活性的藥物組合。筆者對近年來抗結(jié)核藥物組合及體內(nèi)外篩選方法進(jìn)行綜述，以期為Ⅱb期臨床新方案的選擇提供參考。

一、體外篩選法

體外篩選法在抗結(jié)核藥物組合的研究中極其重要，常見的有棋盤法和時間-殺傷動力學(xué)分析法?？捎糜谠u估多種不同作用機(jī)制藥物組合的體外抗結(jié)核活性，為更復(fù)雜的表型研究或體內(nèi)實驗的后續(xù)評估提供依據(jù)[4]。

(一)棋盤法

棋盤法是一種基于肉湯培養(yǎng)基中藥物最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)測定的方法，可以用來評估藥物對細(xì)菌的抑制作用[5]，適合2種或3種藥物組合的活性篩選，應(yīng)用非常廣泛。棋盤法包括瓊脂棋盤稀釋法、試管棋盤稀釋法和微量棋盤稀釋法，又以后者為最常見的聯(lián)合藥物敏感性試驗方法[6]，該方法在96孔板內(nèi)進(jìn)行，各藥物的二倍稀釋液分別加入到棋盤的水平方向和垂直方向，一般取6～8個濃度梯度[7]，并設(shè)置陽性對照孔和陰性對照孔，通過觀察還原(顏色從藍(lán)色變?yōu)樽仙蚍凵?，表示有?xì)菌生長)或不還原(藍(lán)色，表示由于藥物的抑制而沒有細(xì)菌生長)的顏色變化直觀地讀取細(xì)菌生長情況，進(jìn)而確定聯(lián)合用藥中每種藥物的MIC[8]。組合作用是通過計算部分抑制濃度(fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC)來確定的。目前，較為公認(rèn)的FIC法是通過計算棋盤中藥物阻止孔的顏色從藍(lán)色變?yōu)樽仙蛘叻奂t色時的最低FIC值[9]。

對于二維棋盤法，F(xiàn)IC=(MICA+B/MICA)+(MICB+A/MICB)，其中，MICA和MICB分別表示A藥和B藥單獨作用于結(jié)核分枝桿菌時的MIC，MICA+B和MICB+A分別表示A藥和B藥聯(lián)合作用后，達(dá)到相同藥效時對應(yīng)的A藥和B藥的MIC。當(dāng)FIC≤0.5時，兩藥為協(xié)同作用(定義為兩藥聯(lián)合用藥的MIC比單獨用藥降低4倍或更大)；當(dāng)0.5

(二)時間-殺傷動力學(xué)分析法

時間-殺傷動力學(xué)分析法被認(rèn)為是確定抗菌劑間藥物協(xié)同作用的標(biāo)準(zhǔn)參考方法，分為靜態(tài)時間殺傷法模型和動態(tài)藥動學(xué)/藥效學(xué)(PK/PD)模型。該方法可以通過在包含各種抗菌劑的肉湯中添加標(biāo)準(zhǔn)接種物來實現(xiàn)，從含有抗菌劑的肉湯中以不同的時間間隔進(jìn)行傳代培養(yǎng)，通過連續(xù)采樣來量化細(xì)菌負(fù)荷隨時間的變化。藥物的協(xié)同作用定義為：與單一藥物最好的療效相比，聯(lián)合用藥作用后活菌數(shù)減少量≥2 log10菌落形成單位(CFU)/ml被認(rèn)為是協(xié)同作用，1 log10 CFU/ml≤減少量≤2 log10 CFU/ml被認(rèn)為是加性的，減少量≤1 log10 CFU/ml被認(rèn)為是無關(guān)作用，而活菌數(shù)增加量≥2 log10 CFU/ml被認(rèn)為是拮抗作用[12]。

1.靜態(tài)時間殺傷法：是將細(xì)菌在含藥物組合的液體培養(yǎng)管中進(jìn)行培養(yǎng)，在間隔時間點從每個試管中取出一定量的液體進(jìn)行菌落計數(shù)的方法。其模型是評估細(xì)菌對藥物濃度隨時間固定的反應(yīng)，且能同時對多種藥物的抗菌效果進(jìn)行評估。衡量標(biāo)準(zhǔn)包括CFU計數(shù)或替代物。

2.動態(tài)PK/PD模型法：動態(tài)PK/PD模型又稱中空纖維系統(tǒng)(hollow fibersystem，HFS)模型，是一種常用的擴(kuò)散模型，于1972年由Knazek等[13]提出。因其可承受更高的細(xì)菌負(fù)荷，已成為一種動態(tài)評估藥物對細(xì)菌作用的方法[14]，并被歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)鑒定為一種用于支持抗結(jié)核治療方案選擇和開發(fā)的方法[15]。該模型以不同時間間隔從外圍隔室進(jìn)行采樣的方式，獲得量化的藥物濃度和細(xì)菌計數(shù)。雖然HFS模型在抗結(jié)核藥物的研究中應(yīng)用很廣，但也具有一定的局限性，如HFS-TB不能解釋藥物與血漿蛋白的潛在結(jié)合，也不能在宿主的防御下或其他可能出現(xiàn)的復(fù)雜結(jié)節(jié)性病變的情況下解釋抗菌功效[16-17]。

二、體內(nèi)篩選法

經(jīng)體外篩選獲得的有效抗結(jié)核藥物組合方案通常要在機(jī)體內(nèi)進(jìn)行藥物組合療效的進(jìn)一步驗證，通常包括動物模型法和臨床試驗法。

(一)動物模型法

在抗結(jié)核新藥和疫苗的研發(fā)過程中，動物模型一直是其關(guān)鍵組成部分[18-20]?？菇Y(jié)核新藥的研究可以在豚鼠、小鼠、兔子和非人靈長類等不同動物模型中展開，但進(jìn)行藥效評價的方法有所差異。例如，鼠和兔作為動物模型時，主要通過菌落計數(shù)的下降和停止治療后沒有復(fù)發(fā)來判定治療有效[21]；而對于非人靈長類動物來說，不僅可以采用菌落計數(shù)，還可以根據(jù)氟代脫氧葡萄糖正電子發(fā)射計算機(jī)斷層掃描顯像技術(shù)(FDG PET-CT)的方法來判定藥物的療效[22]。但由于遺傳性、安全性和倫理學(xué)的限制，近年來抗結(jié)核藥物組合療效的研究模型主要為小鼠和豚鼠模型。

小鼠是抗結(jié)核藥物組合研究中最常用的動物模型，具有體積相對較小和成本較低的優(yōu)點，是藥物組合研究中的最佳選擇。在常用的小鼠模型(如BALB/c和C57BL/6)中，結(jié)核分枝桿菌主要侵襲小鼠肺部，但僅發(fā)展為肺部炎性而非壞死性病變，與人類結(jié)核病和其他動物模型相反；而C3HeB/FeJ小鼠模型感染結(jié)核分枝桿菌后，其肺部發(fā)生病變的病理與人類接近。有研究發(fā)現(xiàn)，肺部病理的不同可能會影響藥物的分布，從而影響藥物的療效，如Irwin等[23]在BALB/c和C3HeB/FeJ小鼠模型中檢測了貝達(dá)喹啉和吡嗪酰胺單獨和聯(lián)合給藥時的治療反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠對兩種藥品均表現(xiàn)出高度一致的治療反應(yīng)，而C3HeB/FeJ小鼠則表現(xiàn)出對藥品敏感和不敏感的雙峰反應(yīng)結(jié)果。

豚鼠是結(jié)核病研究中另一個重要的動物模型。與小鼠不同，豚鼠對結(jié)核分枝桿菌具有高度的敏感性，在其感染結(jié)核分枝桿菌后會發(fā)生與人類結(jié)核病病理相似的干酪樣壞死。雖然豚鼠已成為證明鏈霉素、異煙肼和乙胺丁醇抗結(jié)核活性的實驗性化療動物模型的較優(yōu)選擇，但其作為實驗性化療模型的特性仍然很差，且成本較高，仍然不是藥物組合研究中的最佳選擇。從臨床菌株中觀察到，某些新出現(xiàn)的臨床分離株在小鼠體內(nèi)的生長要好于豚鼠，因而，結(jié)核病模型的建立在小鼠中容易實現(xiàn)；其次，盡管豚鼠的肺部有大面積壞死病變，但它們?nèi)阅艽婊詈荛L一段時間[24]，這將影響藥物療效的評估。

(二)臨床試驗法

臨床試驗法在抗結(jié)核藥物組合的篩選中占據(jù)了重要的地位，許多藥物組合方案經(jīng)過一系列的體外抗結(jié)核活性篩選，即可作為臨床前推進(jìn)藥物在動物體內(nèi)進(jìn)行藥效評估。然而，任何一種體外模型和動物模型都不能真實反映藥物對人體的作用，還需進(jìn)行藥物在人體中安全性和有效性的評估。

抗結(jié)核藥物臨床試驗分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期，其中Ⅰ期試驗主要是評價藥物的安全性；Ⅱ期試驗旨在研究抗結(jié)核藥物的早期殺菌活性(early bactericidal activity，EBA)?？菇Y(jié)核藥物早期殺菌活性的測定是一種快速評估抗結(jié)核新藥和藥物組合有效性的方法[25-26]，通過檢測患者抗結(jié)核治療早期痰中活的結(jié)核分枝桿菌CFU的下降，來確定藥物殺死涂陽肺結(jié)核患者痰中活菌的能力，通常計算治療前14 d CFU計數(shù)的下降率[27]。但EBA的臨床研究也有其局限性，既無法評估藥物對休眠結(jié)核分枝桿菌的活性，也無法確定單一藥物對其聯(lián)合作用的相對貢獻(xiàn)[28]。關(guān)鍵Ⅲ期臨床試驗的主要評價終點是治療6個月后痰培養(yǎng)陽性患者的比例和2年隨訪期內(nèi)復(fù)發(fā)患者的比例，其中治療2個月后的痰培養(yǎng)狀態(tài)(“陽性”或“陰性”)被認(rèn)為是結(jié)核病終點主要療效的潛在替代指標(biāo)。

三、抗結(jié)核藥物組合新方案

目前，有14種抗結(jié)核新藥處于臨床試驗階段，已有8種抗結(jié)核藥品用于治療藥物敏感結(jié)核病，18種用于耐藥結(jié)核病，還有8種用于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(LTBI)者的預(yù)防性治療方案處于臨床試驗階段[29]。

(一)藥物敏感結(jié)核病

隨著新藥的開發(fā)及藥物的重新使用，一些新的藥物方案逐步走向臨床，旨在縮短和簡化藥物敏感結(jié)核病的治療方案，以提高患者依從性。

在小鼠結(jié)核病模型研究中發(fā)現(xiàn)含大劑量利福平的方案可明顯縮短藥物敏感結(jié)核病的治療時間[30-31]，在BALB/c小鼠結(jié)核病模型中，增加利福霉素類藥物的暴露，特別是用每日高劑量利福噴丁代替利福平，可以明顯縮短無復(fù)發(fā)和治愈所需的治療時間[32-34]。而在藥物敏感結(jié)核病治療的Ⅱ期臨床試驗(NCT00694629)中發(fā)現(xiàn)，較高的利福噴丁暴露與較高的殺菌活性密切相關(guān)，且目前正在進(jìn)行一項確定高劑量的利福噴丁替代利福平是否可以將藥物敏感結(jié)核病的治療時間縮短至4個月的Ⅲ期臨床試驗(NCT02410772)。而在前期對BALB/c小鼠模型的研究中，比較了在6個月的標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核方案中加入氯法齊明與6個月的標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核方案的抗結(jié)核活性，發(fā)現(xiàn)含有氯法齊明的方案具有顯著的抗結(jié)核活性，且可將治愈患者的療程縮短2個月[35-36]。目前Ⅱ/Ⅲ期 TRUNCATE-TB研究(NCT03474198)正在評估將氯法齊明添加到一線抗結(jié)核方案中的療效。關(guān)于優(yōu)化使用經(jīng)批準(zhǔn)的藥品并改進(jìn)配方和藥片數(shù)量的研究也在進(jìn)行中。在一個多臂多階段(multi-arm multi-stage，MAMS)試驗PanACEA (NCT01785186)研究中，調(diào)查了利福平(分別為20 mg/kg和35 mg/kg)聯(lián)合莫西沙星和SQ109與含10 mg/kg 利福平的標(biāo)準(zhǔn)方案對肺結(jié)核患者的療效，發(fā)現(xiàn)含35 mg/kg 的利福平是安全的，且在8周培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)的時間短于含20 mg/kg 和10 mg/kg 利福平的方案，可能縮短結(jié)核病的治療時間[37]。

(二)耐藥結(jié)核病

目前，WHO推薦的常規(guī)耐多藥結(jié)核病的治療方案復(fù)雜、時間長(至少20個月)、費(fèi)用高、耐受性差。隨著人們對結(jié)核分枝桿菌耐藥性認(rèn)識的不斷加深，人們越來越認(rèn)識到重新利用藥物[如利奈唑胺(Lzd)和氯法齊明]和新藥[如貝達(dá)喹啉(Bdq)和德拉馬尼]有著重要的作用。

近年來，出現(xiàn)了許多旨在解決耐多藥結(jié)核病的新療法。2016年，WHO通過的一項為期9～11個月的Bangladesh方案[38][強(qiáng)化期為4～6個月的卡那霉素、加替沙星、丙硫異煙胺、氯法齊明、吡嗪酰胺(PZA)、高劑量異煙肼和乙胺丁醇，鞏固期為5個月的加替沙星、氯法齊明、吡嗪酰胺和乙胺丁醇]被證明對耐多藥結(jié)核病患者有效。在小鼠結(jié)核病模型研究中發(fā)現(xiàn)含普瑞瑪尼(PA-824)、莫西沙星(Mfx)和吡嗪酰胺的新方案(Pa-M-Z)具有優(yōu)于當(dāng)前一線R-H-Z方案(R：利福平，H：異煙肼，Z：吡嗪酰胺)的殺菌活性[39-40]，隨后的一項隨機(jī)對照Ⅱ期臨床研究NC-002試驗(NCT01498419)證實了Pa-M-Z方案的有效性，表明這種新方案的EBA不亞于標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核藥品[41]，之后在小鼠結(jié)核病模型中發(fā)現(xiàn)，將貝達(dá)喹啉和普瑞瑪尼與利奈唑胺(B-Pa-L方案)或莫西沙星和吡嗪酰胺(B-Pa-M-Z方案)聯(lián)合的新方案可明顯縮短抗結(jié)核療程，并在初步臨床試驗中取得了盡如所期的結(jié)果；且與標(biāo)準(zhǔn)方案相比，B-Pa-M-Z方案具有更好的殺菌活性，可將預(yù)防復(fù)發(fā)所需的治療持續(xù)時間縮短2.5～3.5個月[42]。在隨后的第2階段NC-005試驗(NCT02193776)中，接受B-Pa-M-Z方案治療的吡嗪酰胺易感的耐多藥結(jié)核病患者的痰培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)率明顯快于接受標(biāo)準(zhǔn)方案治療的藥物敏感結(jié)核病患者[43]；同樣，與小鼠結(jié)核病模型研究中的標(biāo)準(zhǔn)方案相比，B-Pa-L方案也具有較好的殺菌活性[44]，雖然B-Pa-L方案不能如B-Pa-M-Z方案那樣快速治愈小鼠，但其具有更廣的活性范圍。在隨后的NiX-TB試驗(NCT02333799)中評估了為期6個月的貝達(dá)喹啉聯(lián)合普瑞瑪尼和利奈唑胺(600 mg/次，2次/d)的方案，發(fā)現(xiàn)無復(fù)發(fā)患者的比例達(dá)到了87%[45]。最近，一項針對耐藥結(jié)核病的end TB試驗(NCT03259269)評估了含貝達(dá)喹啉和德拉馬尼新方案的安全性和有效性[46]。

四、總結(jié)與展望

新藥物組合方案需經(jīng)過體外和體內(nèi)篩選才能應(yīng)用于臨床，而評價藥物組合抗結(jié)核活性的實驗方法是將其應(yīng)用于臨床前的前期藥效篩選的一個重要手段，它不僅能實現(xiàn)大規(guī)模組合活性篩選的測定，還能節(jié)約大量的實驗時間和成本。目前，體外抗結(jié)核藥物組合藥效篩選方法多種多樣，但尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的評價標(biāo)準(zhǔn)，仍需進(jìn)一步完善。幸運(yùn)的是，隨著一些新技術(shù)的發(fā)展，尤其是計算機(jī)技術(shù)與數(shù)學(xué)模型的引入，為抗結(jié)核藥物的藥效篩選提供了新的方向。