雪雨田，王亞琴，姜向陽

（西安醫(yī)學(xué)院研究生處，陜西 西安 710000）

1 hWAPL基因的概述

WAPL是在黑腹果蠅體內(nèi)于1977年第一次所發(fā)現(xiàn)，位于果蠅體內(nèi)的X染色體上2D5-2D5[2]，以增加連接蛋白分離。WAPL基因在人類中的同源基因被稱作半翼基因（human wings apart-like，hWAPL），hWAPL基因位于染色體10q23.2位點(diǎn)，長約86528bp，含有17個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，其所編碼的hWAPL蛋白與WAPL蛋白在保守區(qū)域具有高度同源性，同時(shí)二者具有極為相似的功能作用，其調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，維持姐妹染色單體的穩(wěn)定性[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)hWAPL僅在宮頸癌患者的宮頸組織中具有較高的表達(dá)特異性，與宮頸癌的發(fā)生具有密切的相關(guān)性，日本學(xué)者Oikawa等[4]應(yīng)用Northern印跡雜交實(shí)驗(yàn)對(duì)宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌及其相應(yīng)的正常組織中的hWAPL基因中mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與其他癌組織及其相應(yīng)的正常組織進(jìn)行比較，只有在宮頸癌組織中hWAPL基因的mRNA表達(dá)具有明顯的高表達(dá)。對(duì)于癌細(xì)胞系的研究也發(fā)現(xiàn)，hWAPL在宮頸癌細(xì)胞系表達(dá)的程度更高。證明宮頸癌特異性高表達(dá)的基因是hWAPL基因。國內(nèi)魯笑欽等[5]采用免疫組化方法檢測27例正常宮頸、47例宮頸癌及238例其他8種癌組織中hWAPL基因的表達(dá)，hWAPL基因在正常宮頸和宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率分別為33.70%和97.87%。研究表明，在正常宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌組織中，隨宮頸病變程度的加深，hWAPL的免疫積分及陽性表達(dá)率逐步升高，hWAPL基因在正常宮頸上皮細(xì)胞中不表達(dá)或表達(dá)僅局限于少量基底層細(xì)胞及基底旁細(xì)胞。hWAPL在CINⅠ和CINⅡ的樣本中的表達(dá)占上皮厚度的50%～70%，而在hWAPL的表達(dá)在CINⅢ和浸潤性鱗狀上皮癌中整個(gè)病變上皮。此外，隨著病變程度增加，hWAPL的表達(dá)水平也隨之升高，證明hWAPL與宮頸病變的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。由于檢測到hWAPL在腫瘤組織中高水平的表達(dá)，為了明確在腫瘤的發(fā)生中是否hWAPL的過度表達(dá)有促進(jìn)作用，在體外實(shí)驗(yàn)中，Oikawa等[6]將血凝素(HA)標(biāo)記的hWAPL表達(dá)載體(HA-hWAPL 3T3)或HA表達(dá)載體 (HA-3T3)轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別注射到裸鼠體內(nèi)，觀察經(jīng)注射后的裸鼠的成瘤情況，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染HA表達(dá)載體的裸鼠未發(fā)生腫瘤，而HA-hWAPL 3T3的裸鼠幾乎都有發(fā)生腫瘤。這證明hWAPL是致瘤性的。在正常小鼠睪丸組織中含有大量的WAPL蛋白，在人類各正常組織的檢測也發(fā)現(xiàn)相似的情況，人睪丸組織中顯示出大量hWAPL mRNA，而其他正常的人類組織中也檢測出表達(dá)微量的hWAPL mRNA。哺乳動(dòng)物的WAPL基因?qū)Χ庞⒑苊舾?，可以降低使hWAPL蛋白的表達(dá)，從而影響精子的發(fā)育。在小鼠體內(nèi)hWAPL基因還與胚胎的發(fā)育有關(guān)。抑制SiHa細(xì)胞中 hWAPL基因表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。HPV或其他因素導(dǎo)致的hWAPL異常表達(dá)可導(dǎo)致DNA斷裂或不準(zhǔn)確修復(fù)，存活細(xì)胞中的基因重排或多倍體形成，基因組不穩(wěn)定性從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和胚胎發(fā)生缺陷。

2 HPV與宮頸癌的關(guān)系

人乳頭瘤病毒（HPV）是一種常見的嗜黏膜、皮膚的微小DNA病毒，無包膜，在分化狀態(tài)的細(xì)胞中復(fù)制，其分子為雙鏈環(huán)狀，并呈現(xiàn)以共價(jià)閉合的高度螺旋化，病毒基因組含有8000左右堿基(bp),由早期區(qū)（early region，E)、晚期區(qū)(late region，L)、長控制區(qū)（long control region，LCR)。早期區(qū)含有E1、E2、E4、E5、E6、E7共6個(gè)基因，是維持病毒復(fù)制，編碼病毒蛋白，是維持細(xì)胞內(nèi)病毒的高拷貝數(shù)基因[7]。其中E2基因的丟失或滅，導(dǎo)致E6、E7編碼的蛋白持續(xù)表達(dá)和過度表達(dá)。高危型HPV最為典型的特點(diǎn)是由E6、E7原癌蛋白來實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)終末分化細(xì)胞中DNA的合成；E6、E7區(qū)為多數(shù)HPV亞型的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，協(xié)助參與病毒細(xì)胞轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)錄激活，可分別與p53、pRb抑癌基因結(jié)合形成復(fù)合體，使p53、pRb抑癌作用消失，細(xì)胞永生化，與HPV的致癌作用密切相關(guān)[8]。病毒基因主要通過染色體易位、缺失、重排和非染色體損害等方式整合到宿主細(xì)胞染色體中。染色體突變可激活癌基因和抑癌基因失活。持續(xù)感染HPV病毒的人群是高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的高危人群。其原因可能與病毒整合后逃脫機(jī)體細(xì)胞識(shí)別清除、E2負(fù)調(diào)節(jié)蛋白缺失的腫瘤抑制因子[9]。HPV-DNA 在宮頸上皮細(xì)胞內(nèi)的形態(tài)主要分為三種：游離型、整合型和二者兼有的混合型。研究發(fā)現(xiàn)，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(CINⅠ)的HPV-DNA呈游離狀態(tài)，高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(CINII-Ⅲ)與宮頸癌中HPV-DNA多呈整合狀態(tài)，且整合率隨病變加重而顯著增加[10]。在過去的幾年里，為篩查宮頸癌，人類開發(fā)了大量的檢測高危型HPV的新方法，目前用于檢測HPV整合的方法有：熒光原位雜交法(fluorescence insitu hybridization，F(xiàn)ISH)、雜 交 捕 獲 法(hybridcapture method，HC)、 Southern 印跡雜交法、連接-介導(dǎo)-PCR 法、多重實(shí)時(shí)熒光PCR 法、多重連接依賴式探針擴(kuò)增法 (mult-i junction dependent probe amplification，MLPA)及致癌基因轉(zhuǎn)錄子擴(kuò)增法(amplification of papillomavirus oncogene transcript test，APOT)等。多重實(shí)時(shí)熒光PCR法是應(yīng)用最為廣泛的方法，該方法是利用不同的熒光基因簇，標(biāo)記E6和E2基因探針，收集 E2/E6 的不同基因拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)病毒的定量。其原理主要為HPV病毒整合后使E2破壞、缺失，E6/E7過度表達(dá)，E2的缺失和宮頸病變程度呈正相關(guān)，E6/ E7與p53及pRb結(jié)合，抑癌作用消失或減弱，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。多重實(shí)時(shí)熒光 PCR法具有高通量和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，可避免一定的重組樣本誤差，因此目前得到了廣泛的應(yīng)用[11]。HPV感染可分為單一亞型感染和多重亞型感染，其中多重亞型感染者發(fā)生宮頸癌的概率要高于單一亞型感染者。感染亞型也存在地區(qū)和民族差異，在世界范圍內(nèi) HPVl6和HPVl8為最主要的人群感染亞型，而中國人當(dāng)中HPVl6、HPVl8、HPV52、HPV58、HPV31、HPV33為最常見的亞型，并且中國南方地區(qū) HPV52、HPV58亞型的感染率較北方地區(qū)要高[12]。HPV感染以單一感染為主，感染率隨感染亞型增多而下降，一般無四重及四重以上感染，而在多重感染中HPVl6合并型高達(dá)41.3%。HPV感染率隨宮頸病 變程度加深而增加，有研究顯示HPV感染率在宮頸炎中為51.2%，CINⅠ級(jí)為77.8%，cIN2級(jí)為 92.3%，CIN3級(jí)為100%，浸潤癌為100%[13]。Leyendecker 等[14]研究發(fā)現(xiàn) HPV1 6-DNA的整合狀態(tài)與宮頸癌臨床分期、病理類型、組織學(xué)分化及預(yù)后無明顯相關(guān)性。Gargiulo等[15]研究結(jié)果表明，高危型HPV多重感染發(fā)展為高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)是高危型HPV單一感染的4倍。另有研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV多重感染可增加宮頸上皮內(nèi)瘤變的風(fēng)險(xiǎn)，但與宮頸癌發(fā)生相關(guān)性低，在宮頸癌中更常表現(xiàn)為高危型HPV單一感染而非高危型HPV多重感染[16]。Cheung等[17]在HPV16、18雙重感染的宮頸癌中發(fā)現(xiàn)，HPV-DNA多為混合型，較HPV16或HPV18單一感染的整合率低。

3 hWAPL與HPV的關(guān)系

大量研究普遍認(rèn)為，HPV感染是宮頸癌和大部分CIN的主要原因，hWAPL基因的表達(dá)受HPV早期蛋白的影響，HPV E6、E7可分別引起hWAPL表達(dá)的升高，也可以聯(lián)合引起hWAPL表達(dá)的升高，但E6和E7聯(lián)合作用與E6、E7單獨(dú)作用對(duì)hWAPL表達(dá)的生高水平無明顯區(qū)別。因HPV E2蛋白可與HPV早期啟動(dòng)子結(jié)合抑制E6、E7的表達(dá)，為了證明hWAPL的表達(dá)是由E6和E7引起的，Kuroda[18]等分析了E2對(duì)hWAPL表達(dá)的影響，用編碼E2的逆轉(zhuǎn)錄病毒去轉(zhuǎn)染表達(dá)HPVE6、E7宮頸癌細(xì)胞株如與HPV陰性的宮頸癌細(xì)胞株C33A，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CaSki和SiHa細(xì)胞株中hWAPL的表達(dá)水平顯著降低，而在C33A細(xì)胞株中hWAPL的表達(dá)沒有明顯改變。這些結(jié)果表明hWAPL的表達(dá)可能是對(duì)HPVE6和E7所引起特殊癌前細(xì)胞周期的一種反應(yīng)。在HPV陽性的正常宮頸組織中hWAPL的表達(dá)較低，但無論在HPV陽性還是陰性的宮頸癌細(xì)胞中，hWAPL均表達(dá)較強(qiáng)，同時(shí)也可推測出相比HPV，hWAPL基因的過表達(dá)也許是宮頸癌發(fā)生的直接原因。有研究發(fā)現(xiàn)[19]，在宮頸癌病變中hWAPL蛋白可明顯高表達(dá)，提示宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展可能有hWAPL蛋白的參與，可能通過影響以下因素導(dǎo)致相關(guān)指標(biāo)的異常表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)臨床病理特征的進(jìn)展(1)通過hWAPL蛋白的表達(dá)可以增加早期宮頸柱狀上皮細(xì)胞分裂的異常，增加癌細(xì)胞的分化和誘導(dǎo)凋亡障礙，減少癌細(xì)胞的凋亡，顯著提高生長速度；(2)通過維持腫瘤干細(xì)胞的特性，hWAPL蛋白可以提高癌細(xì)胞的浸潤和侵襲能力。ShruthiPS等研究者在探討不同臨床病情的宮頸癌患者發(fā)病機(jī)制的過程中，發(fā)現(xiàn)hWAPL蛋白的平均表達(dá)陽性率可平均可提高25%以上，發(fā)現(xiàn)治療敏感性較差、治療后緩解率低的患者，hWAPL表達(dá)率更明顯[20,21]。同時(shí)免疫組化分表明：hWAPL蛋白主要位于癌細(xì)胞包質(zhì)中及其周邊，表明hWAPL蛋白可能影響癌細(xì)胞之間的信號(hào)通路，同時(shí)干擾細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等，從而促進(jìn)了宮頸癌的發(fā)生。蔣文琛等[19]探討hWAPL蛋白與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系過程中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞分化程度較差、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者臨床分期較晚的患者中，hWAP蛋白的表達(dá)陽性率較高，這可以從下列幾個(gè)方面進(jìn)行理解：(1)hWAPL蛋白上調(diào)淋巴結(jié)內(nèi)皮粘附分子adherin1的表達(dá)，能夠增加宮頸癌細(xì)胞通過宮旁、閉孔淋巴結(jié)等轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)；(2)hWAPL浸潤?quán)徑鼘m旁組織的浸潤，或陰道壁可能會(huì)增加宮頸癌患者的臨床分期。在宮頸癌浸潤脈管組織的患者中，hWAPL蛋白的表達(dá)陽性率可進(jìn)一步提升，這可能與hWAPL蛋白對(duì)于癌細(xì)胞的變形、擴(kuò)散及滲透作用的促進(jìn)作用有關(guān)。

4 展望

宮頸癌的發(fā)生是一個(gè)多因素，多機(jī)制，多階段的漫長過程，有研究發(fā)現(xiàn)大約30%的女性一生中可能感染一次HPV，主要集中在年輕、性生活活躍的女性中，20-30歲為高峰期，多數(shù)女性感染后一段時(shí)間后無需治療，靠自身免疫力會(huì)在1-2年內(nèi)自行消失。只有僅少數(shù)女性呈現(xiàn)出持續(xù)感染，通常需要8-15年發(fā)展為子宮浸潤癌。在這個(gè)漫長的過程中完全可以通過早期篩查來早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療[22]。目前在臨床上的宮頸癌的篩查項(xiàng)目主要為：HPV聯(lián)合TCT的檢測，TCT是一種細(xì)胞學(xué)檢查，檢測已發(fā)生細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的情況，其受主觀性影響比較大，容易出現(xiàn)假陰性。而HPV檢測，直接測定的是病毒DNA基因分型，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高[23]。據(jù)劉金鳳等人的調(diào)查發(fā)現(xiàn)[24]，中國相關(guān)文獻(xiàn)Meta分析中調(diào)整后宮頸癌HPV感染率82.7%。從而也說明在有些宮頸癌患者中，篩查HPV的結(jié)果為陰性。證明有一定的漏檢率，在一定程度上可造成宮頸癌患者漏診，但在HPV陰性的宮頸癌組織中hWAPL是高表達(dá)的，目前WAPL基因在宮頸癌組織中表達(dá)的研究尚不深入，但有學(xué)者認(rèn)為可將HPV與血清中hWAPL表達(dá)的蛋白產(chǎn)物聯(lián)合篩查，可提高宮頸癌的確診率，同時(shí)有助于宮頸癌的早發(fā)現(xiàn)，早診斷，早治療，早康復(fù)，可提高患者的五年生存率。綜上所述在惡性宮頸癌方面的診治是一個(gè)新興領(lǐng)域，有廣闊的應(yīng)用前景，可被推廣。