涂 軻，凌欣華，徐國寶

(梅州市農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，廣東 梅州 514000)

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雷州山羊1只，體重25 kg。由廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院從附近農(nóng)戶家購買。實(shí)驗(yàn)前由廣東海洋大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)員飼予青草、玉米粉，飼養(yǎng)一段時(shí)間臨床檢查健康后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)期間自由攝食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

手術(shù)盤、手術(shù)刀柄、手術(shù)刀片、手術(shù)剪、剪毛剪、止血鉗、握式持針器、鑷子、彎三棱縫針、10號縫線、一次性注射器(5 mL、10 mL、20 mL)、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基、接種環(huán)、載玻片、蓋玻片、試管、試管架、酒精棉球、碘酊棉球、脫脂棉、紗布等。(以上器材均由廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院臨床獸醫(yī)分室提供)

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)藥物及配置

3%雙氧水：取100 mL 30%的過氧化氫，置于1 000 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容至1 000 mL。

10%硫酸鈉來蘇兒：取50 g硫酸鈉做溶質(zhì)，溶解于400 mL 2%來蘇兒中，混勻，用2%來蘇兒定容至500 mL。

硫酸鈉活性炭等量混合粉末：用電子天平稱量等量的硫酸銅粉末與活性炭粉末，在干凈的培養(yǎng)皿中研磨混勻，備用。

2.2 人造化膿創(chuàng)

在山羊放牧的草坪中隨機(jī)選取5個(gè)土壤取樣點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)取土壤20 g左右，取得的土壤樣品置于干凈托盤中，混勻后備用。用1:1 000～1：2 000濃度新潔爾滅溶液對手術(shù)器械進(jìn)行浸泡消毒。選取頸部下1/3處，剪毛，剃毛，用酒精棉球、碘酊消毒后，用0.5%普魯卡因于所選定的術(shù)部作局部浸潤麻醉。沿血管走向，在距離頸背部約3指寬處避開血管作2～3 cm切口。以手術(shù)刀柄向下擴(kuò)張切口，形成囊狀，填充草地土壤。對側(cè)頸部以同樣方法處理。以左側(cè)傷口為對照組，右側(cè)傷口為治療組。造病后，每天觀察并記錄創(chuàng)口的變化、體溫、呼吸、脈搏及全身的其他變化。

2.3 臨床診斷

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造病后，每天觀察、判斷污染創(chuàng)口的發(fā)展轉(zhuǎn)歸情況，每2 d對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體溫、脈搏、呼吸進(jìn)行1次測量，以監(jiān)測動(dòng)物機(jī)體變化情況，直到治療結(jié)束。

3 細(xì)菌的分離鑒定

3.1 器具清毒準(zhǔn)備

將實(shí)驗(yàn)所需消毒滅菌的器械、培養(yǎng)皿、燒杯等物品進(jìn)行流水清洗，置于烘干箱烘干后用牛皮紙包裹扎好，整齊地平放入蒸汽滅菌高壓鍋的內(nèi)筒中，在121.3℃高溫下滅菌30 min。超凈工作臺在使用前清理干凈，紫外線照射1 h后，打開抽風(fēng)設(shè)備，保持無菌環(huán)境，即可使用。

3.2 細(xì)菌的分離

在傷口化膿明顯時(shí)，無菌操作，用無針頭的無菌注射器從化膿創(chuàng)中抽取膿液，置于經(jīng)滅菌的離心管中做好標(biāo)記，及時(shí)進(jìn)行劃板培養(yǎng)，每個(gè)膿汁樣分別在普通營養(yǎng)瓊脂平板、血液瓊脂平板做2個(gè)劃線培養(yǎng)。

3.3 細(xì)菌培養(yǎng)

在超凈工作臺無菌的環(huán)境下，右手取針尖稍彎的接種環(huán)，火焰滅菌并冷卻后，挑取少量膿液用三區(qū)劃線的方法劃線，左手取瓊脂平板，在酒精燈火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中雜菌落入，右手將已沾膿汁的接種環(huán)在瓊脂表面密集而不重疊的來回劃線，面積約占整個(gè)平板的1/5～1/6，此為第一區(qū)。劃線時(shí)接種環(huán)與瓊脂呈30°～40°輕輕接觸，利用腕力滑動(dòng)，切忌劃破瓊脂。劃完第一區(qū)后接種環(huán)上經(jīng)火焰滅菌，待冷后，在劃線末端重復(fù)2～3根線后，再劃下一區(qū)域(約占1/4面積)，此為第二區(qū)。第二區(qū)劃完后可不燒灼接種環(huán)，用同樣方法劃第三區(qū)，劃滿整個(gè)平皿。劃線完畢，將平板扣入皿蓋并作好標(biāo)記，置于37℃溫箱孵育18～24 h，觀察瓊脂表面菌落分布情況，注意是否分離出單個(gè)菌落，并記錄菌落特征(如大小、形狀、透明度、色素等)。

3.4 細(xì)菌的鑒定

細(xì)菌涂片：取潔凈、透明、無油跡的載玻片，先用接種環(huán)取少量水于玻片上，再挑取少量菌落，在液滴中混合并均勻涂布，自然干燥，將抹片的抹面向上，以其背面在酒精燈外焰上來回拖過數(shù)次，略加熱(以不燙手為度)進(jìn)行固定。

細(xì)菌染色及鑒定：用革蘭氏染色法染色，將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1 min，水洗。滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。滴加脫色酒精，30s。水洗，滴加沙黃復(fù)染液，復(fù)染1 min。水洗，吸干或自然干燥，在光學(xué)顯微鏡下鏡檢，記錄細(xì)菌顏色、形態(tài)、大小等。

4 治療方法

1)清潔創(chuàng)圍： 先用數(shù)層滅菌紗布塊覆蓋創(chuàng)面，后用剪毛剪將創(chuàng)圍被毛剪去，剃干凈，剃毛面積以距創(chuàng)緣周圍10 cm左右為宜。離創(chuàng)緣較遠(yuǎn)的皮膚，可用肥皂水和消毒液洗刷干凈。用酒精棉球涂擦創(chuàng)圍皮膚，干后用5%的碘酊涂擦創(chuàng)圍皮膚2次。

2)沖洗創(chuàng)腔： 用3%過氧化氫溶液和0.5%高錳酸鉀交替反復(fù)沖洗創(chuàng)腔，直至膿汁排完。

3)清創(chuàng)術(shù)：擴(kuò)大創(chuàng)口，除去深部異物，切除壞死組織，消滅創(chuàng)囊，做輔助切口，小心別損傷膿膜。

4)創(chuàng)傷用藥：對照組側(cè)滅菌紗布蘸10%硫酸鈉來蘇兒(2%)填塞創(chuàng)腔引流。治療組側(cè)滅菌紗布蘸2%來蘇兒后，包裹硫酸鈉粉活性炭粉(體積比1：1混合)填塞創(chuàng)腔引流。

5)根據(jù)創(chuàng)傷轉(zhuǎn)歸情況，進(jìn)行治療和換藥。待傷口轉(zhuǎn)為肉芽創(chuàng)后，用生理鹽水沖洗創(chuàng)腔、創(chuàng)圍，創(chuàng)面涂抹蜂蜜，創(chuàng)口表面覆以隔離用紗布。如創(chuàng)腔較大可對傷口進(jìn)行縫合，加快傷口愈合。

5 結(jié)果

山羊頸部兩側(cè)的化膿創(chuàng)膿液中的致病菌經(jīng)分離純培養(yǎng)到2種不同形態(tài)的菌落，白色菌落和綠色菌落。

白色菌落致病菌在普通瓊脂平板上生長良好，形成圓形、濕潤、扁平、大小不等、灰白色的菌落。

白色菌落經(jīng)革蘭氏染色鏡檢結(jié)果：呈紅色，單個(gè)散在，革蘭氏染色陰性，短桿菌。

綠色菌落形成光滑，微隆起，邊緣整齊波狀，藍(lán)綠色的中等大小菌落。

綠色菌落經(jīng)革蘭氏染色鏡檢結(jié)果：呈紅色，單在、成對或偶爾成短鏈，革蘭氏染色陰性，短桿菌。

6 討論

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們對化膿創(chuàng)的研究、治療等不斷進(jìn)步，治療方法眾多，但對化膿創(chuàng)的致病菌的分離鑒定以及耐藥性研究依然重要，有人曾對傷口分泌物進(jìn)行分離鑒定及耐藥性的研究，革蘭陰性桿菌為化膿性感染的主要病原菌，但葡萄球菌也在逐年增加，多數(shù)病原菌為多重耐藥菌株。本次試驗(yàn)就針對草地土壤作為污染物致化膿創(chuàng)后，對其膿汁細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定以及藥敏試驗(yàn)，了解草地土壤可致化膿創(chuàng)致病菌的種類。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到經(jīng)草地土壤致化膿創(chuàng)致病菌是革蘭氏陰性菌，該菌群對脂肽類、青霉素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、頭孢類等幾大類抗菌藥物均具有耐藥性，對氟喹諾酮類抗生素敏感。提示該類化膿性感染治療時(shí)應(yīng)及時(shí)確定病原菌并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，合理使用抗生素有效控制感染，可在無藥敏試驗(yàn)的情況下優(yōu)先選用氟喹諾酮類抗生素作為治療用藥。