趙 璐，徐 凡，易僑祺，張?zhí)依颍跫t剛

廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006

長(zhǎng)葉紫珠(CallicarpalongifoliaLamk.)，為馬鞭草科紫珠屬植物，產(chǎn)于我國(guó)臺(tái)灣、廣東、云南，生于海拔1 400 m下的山坡疏林中，在印度尼西亞、菲律賓、馬來(lái)西亞、越南、緬甸、印度也有分布[1]。長(zhǎng)葉紫珠別名老哈眼，在我國(guó)福建地區(qū)其常被當(dāng)作民間草藥使用，應(yīng)用歷史悠久且有較好的療效。據(jù)《福建民間草藥》和《閩南民間草藥》記載，長(zhǎng)葉紫珠又名山枇杷、牛舌癀，《中國(guó)藥植圖鑒》中又稱其為野枇杷，味苦辛，性溫，有微毒。具有祛風(fēng)除濕、活血止血、清痰鎮(zhèn)咳、解毒殺蟲(chóng)的功效，常用作治療風(fēng)濕痛、吐血、風(fēng)寒咳嗽、蟲(chóng)證等癥。紫珠屬植物當(dāng)中的許多植物在古代民間的常用草藥以及各地民族藥書(shū)籍中都有所記載，該屬在國(guó)內(nèi)共46種植物，其中20多種植物的清熱、祛風(fēng)濕、止血等藥效效果十分明顯，現(xiàn)代研究報(bào)道紫珠屬植物具有抗炎[2-6]、止血[7]、鎮(zhèn)痛[8,9]、抗氧化[10-12]、改善記憶障礙[13,14]等藥理作用。

作為一種民間用藥，長(zhǎng)葉紫珠應(yīng)用歷史悠久、療效顯著，但一直以來(lái)有關(guān)長(zhǎng)葉紫珠的研究報(bào)道卻很稀少。本文選取紫珠屬植物長(zhǎng)葉紫珠作為研究對(duì)象，在紫珠屬植物的研究基礎(chǔ)上，以期從長(zhǎng)葉紫珠中尋找出具有良好抗炎效果的活性成分，為抗炎藥物的開(kāi)發(fā)提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

核磁共振儀(AVANCE III 500MHz，瑞士布魯克拜厄斯賓有限公司)、高分辨質(zhì)譜(maXis impact，德國(guó)Bruker公司)、半制備高效液相色譜儀(北京賽譜銳思科技有限公司)。

硅膠(100～200、200～300目，青島海洋化工有限公司)；MCI(三菱化學(xué)公司)；ODS(日本YMC公司)；Sephadex LH-20(北京賽譜銳思科技有限公司)；石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純)；甲醇(瑞典歐普森試劑公司，色譜級(jí))；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(美國(guó)Gibco)；二甲基亞砜(美國(guó)Mpbio)；CCK8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(美國(guó)APExBIO)；地塞米松、脂多糖(LPS)(美國(guó)Sigma)；Griess試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

長(zhǎng)葉紫珠CallicarpalongifoliaLamk.采集于廣東藥科大學(xué)大學(xué)城校區(qū)中藥學(xué)院藥用植物園，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院華南植物園葉華谷教授鑒定為馬鞭草科紫珠屬植物長(zhǎng)葉紫珠(CallicarpalongifoliaLamk.)的枝葉。憑證標(biāo)本(標(biāo)本號(hào)201980723)存放于廣東藥科大學(xué)中藥標(biāo)本館。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取與分離

長(zhǎng)葉紫珠干燥枝葉5.5 kg，粉碎成粗粉，以甲醇冷浸方式提取5次(前3次冷浸提取48 h，后2次冷浸提取72 h)，每次約20 L，合并甲醇提取液，減壓濃縮，回收溶劑后得甲醇浸膏888.65 g。將甲醇浸膏用溫水進(jìn)行分散(浸膏∶水 ≈ 1∶1，V/V)后，分別用石油醚(6×1.2 L)、乙酸乙酯(6×1.2 L)、正丁醇(6×1.2 L)依次萃取，再分別合并有機(jī)層并減壓濃縮，最終得石油醚浸膏222.15 g，乙酸乙酯浸膏271.02 g，正丁醇浸膏182.12 g。

將乙酸乙酯浸膏(271.02 g)以硅膠為固定相，以二氯甲烷-甲醇(200∶1、100∶1、50∶1、30∶1、15∶1、9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1，V/V)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢查后合并相同部分，得到16個(gè)組分(Y1～Y16)。Y3組分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇(1∶1，V/V)洗脫，得到13個(gè)組分(Y3.1～Y3.13)；Y3.4組分經(jīng)MCI及數(shù)次Sephadex LH-20凝膠柱分離純化后，得到化合物9(99.2 mg)。Y4組分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離后，得到5個(gè)組分(Y4.1～Y4.5)；Y4.5組分再次經(jīng)硅膠、MCI柱分離純化后，得到化合物3(7.0 mg)。Y5組分經(jīng)硅膠柱層析分離，使用石油醚-乙酸乙酯(200∶1、100∶1、50∶1、30∶1、15∶1、9∶1、7∶1，V/V)以及純甲醇洗脫，得8個(gè)組分(Y5.1～Y5.8)。Y5.3組分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離后，得到6個(gè)組分(Y5.3.1～Y5.3.6)；Y5.3.3組分經(jīng)半制備高效液相色譜純化后，得到化合物2(85%甲醇-水，tR=12.032 min，5.0 mg)；Y5.4組分經(jīng)MCI、Sephadex LH-20凝膠柱分離純化后，得化合物4(2.3 mg)。Y7組分經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚-乙酸乙酯(200∶1、100∶1、50∶1、30∶1、15∶1、9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1，V/V)以及純甲醇洗脫后，得到8個(gè)組分(Y7.1～Y7.8)； Y7.3組分經(jīng)重結(jié)晶純化后得到化合物5(111.9 mg)；Y7.4組分經(jīng)MCI、凝膠柱色譜，以及半制備高效液相色譜分離純化后，得到化合物10(80%甲醇-水，tR=15.408 min，3.1 mg)；Y7.6組分經(jīng)MCI柱色譜分離后得到12個(gè)組分(Y7.6.1～Y7.6.12)。其中Y7.7組分經(jīng)MCI、硅膠和多次凝膠柱色譜分離后，得到化合物1(205.4 mg)和6(5.0 mg)。Y10組分則經(jīng)重結(jié)晶純化后得到化合物7(92.6 mg)。

正丁醇浸膏(182.12 g)，以MCI為固定相，以甲醇-水(10%→100%)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢查，合并相同部分后，得到4個(gè)組分Fr.W1～Fr.W4。Fr.W 2組分經(jīng)半制備液HPLC分離純化后，得到化合物8(42%甲醇水，tR=17.036 min，25.0 mg)。

1.2.2 抗炎活性研究

用CCK8法測(cè)定RAW 264.7細(xì)胞在不同濃度化合物環(huán)境下的存活率來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)應(yīng)化合物的細(xì)胞毒性作用。根據(jù)細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果對(duì)本實(shí)驗(yàn)化合物的給藥濃度進(jìn)行設(shè)計(jì)。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7稀釋并接種于96孔板，每孔100 μL，細(xì)胞密度4×104個(gè)/孔，孔板邊緣加入100 μL PBS，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。將不做處理的完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為空白對(duì)照，將僅加入100 ng/mL LPS的細(xì)胞設(shè)為模型組。以100 ng/mL LPS及0.5 μmol/L地塞米松作為陽(yáng)性組，以不同濃度化合物及100 ng/mL LPS作為實(shí)驗(yàn)組。加入藥物后，培養(yǎng)18 h。分別取各組細(xì)胞上清液用Griess法檢測(cè)NO釋放量水平。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色棒狀結(jié)晶；HR-EI-MS：m/z303.233 0 [M+H]+(calcd for C20H31O2，303.231 9)。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：2.24(1H，m，H-1a)，1.34(1H，m，H-1b)，1.67(2H，m，H-2)，1.56(1H，m，H-3a)，1.37(1H，m，H-3b)，1.67(1H，m，H-5)，1.85(2H，m，H-6)，2.79(2H，m，H-7)，3.20(1H，p，J= 6.9 Hz，H-15)，1.19(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)，1.20(3H，d，J= 6.9 Hz，H-17)，3.46(1H，d，J= 11.1 Hz，H-18a)，3.13(1H，d，J= 11.1 Hz，H-19b);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：39.9(C-1)，19.8(C-2)，36.3(C-3)，38.4(C-4)，45.0(C-5)，20.1(C-6)，30.4(C-7)，127.0(C-8)，149.2(C-9)，38.9(C-10)，111.1(C-11)，153.2(C-12)，133.3(C-13)，127.2(C-14)，27.2(C-15)，23.2(C-16、17)，72.0(C-18)，18.0(C-19)，25.7(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)進(jìn)行對(duì)照，同時(shí)經(jīng)二維核磁譜圖進(jìn)行驗(yàn)證，確定為文獻(xiàn)[15]報(bào)道的化合物18-hydroxyferruginol 。

化合物2透明油狀液體；HR-EI-MS：m/z287.237 7 [M+H]+(calcd for C20H31O，287.236 9)；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.15(1H，d，J= 8.1 Hz，H-12)，6.94(1H，dd，J= 8.2，2.0 Hz，H-11)，6.85(1H，d，J= 2.0 Hz，H-14)，3.45(1H，d，J= 11.0 Hz，H-18a)，3.12(1H，d，J= 11.0 Hz，H-18b)，2.90～2.83(1H，m，H-6a)，2.83～2.76(1H，m，H-6b)，2.35～2.27(1H，m，H-15)，1.89～1.78(2H，m，H-7)，1.70～1.67(2H，m，H-2)，1.55(1H，m，H-5)，1.40～1.29(2H，m，H-3)，1.24～1.19(9H，m，H-16，17，20)，0.88(3H，d，H-19);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：148.6(C-9)，146.6(C-13)，135.9(C-8)，127.7(C-14)，125.2(C-12)，124.6(C-11)，72.0(C-18)，45.0(C-5)，39.8(C-1)，38.9(C-4)，38.4(C-10)，36.3(C-3)，34.8(C-15)，31.1(C-7)，25.8(C-20)，24.5(C-16，C-17)，19.9(C-2)，19.8(C-6)，18.0(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的dehydroabietanol數(shù)據(jù)一致。

化合物3白色羽狀結(jié)晶；HR-EI-MS：m/z427.380 2 [M+H]+(calcd for C30H51O，427.393 4)；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.15(1H，t，J= 3.7 Hz，H-12)，3.25(1H，dd，J= 11.1，5.2 Hz，H-3)，2.02～1.86(3H，m，H-11，H-18)，1.09，1.03，1.02，0.98，0.94，0.82(3H×6，s，H-22～27)，0.82(6H，s，H-2,30);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：139.8(C-13)，124.6(C-12)，79.2(C-3)，59.2(C-18)，55.4(C-5)，47.9(C-9)，42.3(C-14)，41.7(C-1)，40.2(C-8)，39.8(C-19)，39.8(C-20)，39.0(C-22)，38.9(C-17)，37.1(C-4)，33.9(C-10)，33.1(C-7)，31.4(C-21)，29.9(C-27)，28.9(C-23)，28.3(C-2)，27.4(C-16)，26.8(C-11)，23.5(C-15)，23.4(C-28)，21.6(C-29)，18.5(C-6)，17.6(C-26)，17.0(C-30)，15.8(C-24)，15.8(C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的neolupenol數(shù)據(jù)一致。

化合物4黃色針狀結(jié)晶；HR-EI-MS：m/z329.102 4 [M+H]+(calcd for C18H17O6，329.102 0)；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：12.65(1H，s，5-OH)，8.07(2H，d，J= 9.0 Hz，H-2′和H-6′)，7.02(2H，d，J= 9.0 Hz，H-3′和H-5′)，6.44(1H，d，J= 2.2 Hz，H-8)，6.35(1H，d，J= 2.2 Hz，H-6)，3.89(3H，s，-OCH3)，3.87(3H，s，-OCH3)，3.85(3H，s，-OCH3);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：178.9(C-4)，165.6(C-7)，162.2(C-4′)，161.8(C-5)，156.9(C-8a)，156.1(C-2)，139.0(C-3)，130.3(C-2′和C-6′)，123.0(C-1′)，114.2(C-3′和C-5′)，106.2(C-4a)，98.0(C-6)，92.3(C-8)，60.3(3-OCH3)，55.9，55.6 (4′，7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的kaempferol 3,4′,7-O-trimethylether數(shù)據(jù)一致。

化合物5黃色針狀結(jié)晶；HR-EI-MS：m/z389.123 3 [M+H]+(calcd for C20H21O8，389.123 1)；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：12.91(1H，s，5-OH)，8.02(1H，dd，J= 8.5，2.0 Hz，H-6′)，7.98(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，7.29(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，6.80(1H，s，H-8)，4.28(6H，s，3′，4′-OCH3)，4.26(3H，s，7-OCH3)，4.22(3H，s，6-OCH3)，4.17(3H，s，3-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：155.9(C-2)，138.9(C-3)，178.9(C-4)，152.9(C-5)，132.4(C-6)，158.8(C-7)，90.4(C-8)，152.3(C-9)，106.6(C-10)，123.0(C-1′)，111.4(C-2′)，148.9(C-3′)，151.5(C-4′)，111.0(C-5′)，122.2(C-6′)，60.2(3-OCH3)，60.9(6-OCH3)，56.4(7-OCH3)，56.1(3′-OCH3)，56.1(4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的artemein基本一致。

化合物6黃色針狀結(jié)晶；HR-EI-MS：m/z359.234 0 [M+H]+(calcd for C19H19O7，359.234 1)1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：12.61(1H，s，5-OH)，7.71(1H，J= 2.0 Hz，H-6′)，7.67(1H，dd，J= 8.4，2.0 Hz，H-2′)，7.05(1H，d，J= 8.4 Hz，H-5′)，6.50(1H，d，J= 1.7 Hz，H-3)，6.01(1H，s，H-6)，3.99(3H，s，-OCH3)，3.96(3H，s，-OCH3)，3.92(3H，s，-OCH3)，3.86(3H，s，OCH3);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：179.1(C-4)，158.9(C-2)，156.1(C-9)，152.9(C-7)，152.5(C-4′)，148.5(C-3′)，146.5(C-5′)，138.9(C-8)，132.5(C-1)，122.8(C-6′)，122.6(C-10)，114.7(C-2′)，111.1(C-5′)，106.7(C-3)，90.5(C-6)，61.0(7-OCH3)，60.3(8-OCH3)，56.5(3′-OCH3)，56.3(4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道的5-羥基-7,8,3′,4′-四甲氧基黃酮數(shù)據(jù)一致。

化合物7黃色針狀結(jié)晶；HR-EI-MS：m/z345.096 5 [M+H]+(calcd for C18H17O7，345.096 9)；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：12.72(1H，s，5-OH)，9.11(1H，s，-OH)，8.05(2H，d，J= 9.0 Hz，H-2′，H-6′)，7.02(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3′，H-5′)，6.80(1H，s，8-H)，3.98(3H，s，7-OCH3)，3.88(3H，s，3-OCH3)，3.80(3H，s，6-OCH3);13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：179.9(C-4)，161.0(C-42′)，160.2(C-7)，157.1(C-2)，153.7(C-5)，153.2(C-9)，139.2(C-3)，133.2(C-6)，131.3(C-22′)，129.4(C-62′)，122.7(C-12′)，116.9(C-32′)，116.5(C-52′)，107.1(C-10)，91.7(C-8)，60.6(6-OCH3)，60.2(3-OCH3)，56.8(7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道的penduleti數(shù)據(jù)一致。

化合物8紅棕色粉末；HR-EI-MS：m/z625.213 9 [M+H]+(calcd for C29H37O15，625.212 7)；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.62(1H，d，J= 15.9 Hz，H-β′′′)，7.08(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′′′)，6.98(1H，dd，J= 8.2，2.1 Hz，H-6′′′)，6.80(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5′′′)，6.72(1H，d，J= 2.1 Hz，H-2)，6.70(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5)，6.59(1H，dd，J= 8.0，2.1 Hz，H-6)，6.30(1H，d，J= 15.9 Hz，H-α′′′)，5.21(1H，d，J= 1.8 Hz，H-1′′)，4.94(1H，t，J= 9.5 Hz，H-6′)，4.40(1H，d，J= 7.9 Hz，H-1′)，4.07～3.41(10H，m，H-α、2′、3′、4′、5′、2′′、3′′、4′′、5′′)，2.87～2.77(2H，m，H-β)，1.11(3H，d，J= 6.2 Hz，H-6′′);13C NMR(125 MHz，C5D5N)δ：167.6(C=O)，151.1(C-4′′′)，148.2(C-β′′′)，147.7(C-3′′′)，147.3(C-3)，146.1(C-4)，130.9(C-1)，127.5(C-1′′′)，122.8(C-6′′′)，121.0(C-6)，118.0(C-5)，117.3(C-5′′′)，117.0(C-2)，116.3(C-2′′′)，115.3(C-α′′′)，104.7(C-1′)，103.6(C-1′′)，81.1(C-3′)，76.9(C-4′)，76.4(C-2′)，74.5(C-4′′)，73.1(C-2′′)，73.1(C-3′′)，71.8(C-α)，70.8(C-5′)，70.7(C-5′′)，62.6(C-6′)，36.6(C-β)，19.7(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道的毛蕊花糖苷數(shù)據(jù)一致。

化合物9透明油狀物；C24H38O4，ESI-MS：m/z391.8 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.70(2H，dd，J= 5.7，3.3 Hz，H-2，5)，7.53(2H，dd，J= 5.7，3.3 Hz，H-3，4)，4.26～4.17(4H，m，3′，3′′)，1.68(2H，m，H-4′，4′′)，1.42(4H，m，H-5′，5′′)，1.37～1.23(12H，m，H-6′，6′′，7′，7′′，8′，8′′)，0.91～0.89(6H，m，H-12′，12′′);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：167.9(C-1′，1′′)，132.6(C-1，6)，131.0(C-3，4)，129.0(C-2，5)，68.3(3′，3′′)，38.9(4′，4′′)，30.5(C-11′，11′′)，29.8，29.1(C-9，9′)，23.9(C-5′，5′′)，23.1(C-6′，6′′)，14.2(C-10′，10′′)，11.1(12′，12′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道的鄰苯二甲酸-二-(2-乙基己基)酯數(shù)據(jù)基本一致。

化合物10透明油狀物；HR-EI-MS：m/z279.159 0 [M+H]+(calcd for C16H23O4，279.159 1)；1H NMR(500 MHz，CD3OD )δ：7.75(2H，dd，J= 5.7，3.3 Hz，H-3，6)，7.64(2H，dd，J= 5.7，3.3 Hz，H-4，5)，4.32(4H，t，J= 6.6 Hz，H-8，8′)，1.75(4H，m，H-9，9′)，1.53～1.44(4H，m，H-10，10′)，1.01(6H，t，J= 7.4 Hz，H-11，11′);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：169.3(C-7，7′)，133.6(C-1，2)，132.4(C-4，5)，129.9(C-3，6)，66.7(C-8，8′)，31.7(C-9，9′)，20.3(C-10，10′)，14.0(C-11，11′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道的鄰苯二甲酸二丁酯的數(shù)據(jù)一致。

2.2 抗炎活性結(jié)果

所述單體化合物的抗炎活性測(cè)定結(jié)果顯示，化合物1、2、4、10具有一定的抑制NO生成作用，其IC50值分別為25.2、34.6、109.6、104.8 μmol/L。其中，兩個(gè)松香烷型二萜(化合物1、2)較其他化合物有著更好的活性效果，而化合物5、8、9均未表現(xiàn)出顯著的抑制NO生成作用。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從長(zhǎng)葉紫珠中分離并鑒定出10個(gè)化合物，包括二萜類化合物、三萜類化合物、黃酮類化合物、苯乙醇苷類化合物、芳香族化合物。10個(gè)化合物均為首次從長(zhǎng)葉紫珠中分離得到。抗炎活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，部分化合物具有一定的抗炎活性，這提示我們長(zhǎng)葉紫珠具有較大的被開(kāi)發(fā)利用的潛能。通過(guò)對(duì)長(zhǎng)葉紫珠的化學(xué)成分及抗炎活性進(jìn)行研究，為明晰長(zhǎng)葉紫珠化學(xué)的成分構(gòu)成及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)，同時(shí)也為長(zhǎng)葉紫珠的開(kāi)發(fā)利用提供一定參考依據(jù)。