何順宇

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

0 引言

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是一種烈性的、具有高度接觸傳染性、死亡率高且傳染速度極快的動(dòng)物傳染疾病[1-2]。其病情傳播不受時(shí)間、地點(diǎn)的限制，能夠感染各種類及各生長(zhǎng)階段的豬群，致死率可達(dá)到100%。AFS是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的傳染病。該病在臨床上主要表示為最急性型、急性型、亞急性型和慢性型4種類型。一般特征為高熱和全身性皮下出血，死亡率高；有時(shí)會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、呼吸困難以共濟(jì)失調(diào)[3]。一旦暴發(fā)非洲豬瘟，會(huì)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大危害[4]。1921年首次在肯尼亞發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟。1957年在葡萄牙發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟，蔓延趨勢(shì)不斷擴(kuò)大至歐洲其他國(guó)家[5]。1971年傳入南美。2017年傳入俄羅斯并擴(kuò)散。2018年非洲豬瘟秘密傳入中國(guó)[6]。被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類疫病，目前無有效疫苗預(yù)防[7]。

ASFV是二十一面體雙鏈DNA病毒，其具有雙層囊膜結(jié)構(gòu)，基因組大小為170～190 kb[8]，并具有反轉(zhuǎn)重復(fù)區(qū)和末端交聯(lián)[9]。ASFV能夠編碼68種結(jié)構(gòu)蛋白和100多種非結(jié)構(gòu)蛋白，其中50多種為病毒結(jié)構(gòu)蛋白[10-11]。整個(gè)基因組有151～167個(gè)開放閱讀框(ORF)，可以編碼150～200個(gè)蛋白質(zhì)，而一半以上的功能未知[12]。ASFV編碼的蛋白質(zhì)與病毒的結(jié)構(gòu)、復(fù)制以及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和先天免疫等細(xì)胞有關(guān)[13]。本文主要從病毒編碼結(jié)構(gòu)蛋白及致病機(jī)理的最新研究進(jìn)行綜述。

1 非洲豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白

1.1 核殼蛋白

在非洲豬瘟病毒結(jié)構(gòu)體系中，ASFV的核衣殼部分，位于病毒的內(nèi)膜下方，具有保護(hù)支持的功能，將病毒DNA和核蛋白包裹濃縮形成類核結(jié)構(gòu)。在已知的110個(gè)ASFV高度保守的ORFs中，ORF CP2475L編碼多聚蛋白前體pp220[11]。核殼蛋白可以被蛋白酶水解成成熟的病毒蛋白，具有一定的生理生化功能，最后組裝到含DNA的擬核區(qū)域的核芯殼中。pp220位于病毒結(jié)構(gòu)外層核殼區(qū)域，進(jìn)行相應(yīng)的功能表達(dá)及基因編輯。核殼蛋白在ASFV病毒組成體系中，起著至關(guān)重要的作用。

多聚結(jié)構(gòu)蛋白pp220是一個(gè)N-豆蔻?；那疤岫嚯模踩舛构邗；糠志哂心ゅ^定信號(hào)，能接收信號(hào)并將其表達(dá)。它可以將發(fā)育中的核芯殼，通過其介質(zhì)聯(lián)合到病毒粒子的內(nèi)部囊膜區(qū)域；是連接內(nèi)部核質(zhì)體和核外層之間的蛋白質(zhì)支架，起支持作用，能夠誘導(dǎo)分配空核體。因此，pp220是核芯組裝過程的必需成分[15]。pp220容易被蛋白酶水解，經(jīng)過SUMO1樣蛋白酶水解加工后，水解產(chǎn)生了p150、p37、p34、p14和p5等主要結(jié)構(gòu)蛋白[10]。多聚蛋白的加工過程與病毒組裝同時(shí)發(fā)生，pp220依賴于主要衣殼蛋白p72的表達(dá)。先進(jìn)行pp220前體的誘導(dǎo)表達(dá)，才能再進(jìn)行pp62的加工處理，研究表明這2種多聚蛋白前體彼此之間相互作用，能夠促進(jìn)核殼樣病毒結(jié)構(gòu)域的形成[16]。

1.2 囊膜蛋白

ASFV主要由內(nèi)囊膜層、衣殼層、外囊膜層以及被核殼蛋白包圍的病毒DNA基因組構(gòu)成。其中囊膜蛋白位于成熟病毒粒子的內(nèi)外囊膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，是ASFV所編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白。在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中，由于其具有良好的抗原性，與病毒的致病性及細(xì)胞的免疫功能密切相關(guān)。p54等囊膜蛋白的功能及其結(jié)構(gòu)已知。

ASFV侵染宿主細(xì)胞后，早起表達(dá)的膜蛋白主要包括p54，由ORF E183L 基因編碼。研究表明，p54囊膜蛋白存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生的內(nèi)膜前體處，對(duì)于病毒侵入宿主細(xì)胞及吸附細(xì)胞表面具有極其重要的作用[18-19]。p54過度表達(dá)能促講細(xì)胞凋亡。由于p54能與胞質(zhì)動(dòng)力蛋白輕鏈LC8發(fā)生特異性相互作用，使病毒在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行位置轉(zhuǎn)移并復(fù)制生長(zhǎng)。兩者發(fā)生作用的區(qū)域中有一段含有13個(gè)氨基酸殘基的序列片段，該序列片段能夠消除Bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡程序的運(yùn)行[20]。在ASFV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白中，p54是一種被證實(shí)能促進(jìn)細(xì)胞凋亡的囊膜蛋白，具有重大突破。由于p54具有良好的抗原性，被應(yīng)用于ASFV血清檢測(cè)研究，且檢測(cè)具有極高的特異性，準(zhǔn)確性高，應(yīng)用前景廣[21]。

1.3 衣殼蛋白

病毒衣殼具有保護(hù)病毒核酸的功能，避免其受到環(huán)境中存在的核酸酶或其他理化因素影響而被破壞，且衣殼層部位在病毒感染宿主細(xì)胞過程中具有顯著功能。由于病毒在感染宿主時(shí)需要破壞宿主細(xì)胞內(nèi)的免疫機(jī)制，而衣殼部分具有相應(yīng)的免疫原性，可以對(duì)宿主體內(nèi)的免疫系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)，影響其免疫過程，不僅使宿主細(xì)胞體內(nèi)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生防御物質(zhì)，還產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的免疫損傷，進(jìn)而使得病毒能在細(xì)胞內(nèi)快速?gòu)?fù)制表達(dá)。研究顯示，ASFV編碼的衣殼蛋白有p72等。

在ASFV感染宿主晚期，有一類由ORF E102R基因編碼的衣殼蛋白p72，其蛋白組成來自于病毒工廠。研究表明，在病毒二十一面體結(jié)構(gòu)中，衣殼蛋白p72是病毒的主要組成部分，能夠促進(jìn)病毒衣殼層的形成及作用表達(dá)。在病毒各部分的組裝過程中，宿主細(xì)胞核內(nèi)組裝的中間體被運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)一步包裝，此時(shí)p72衣殼蛋白被運(yùn)輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜上，進(jìn)行衣殼層的組裝。其作用機(jī)理主要是在感染細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的原生內(nèi)環(huán)境中，p72與相對(duì)應(yīng)的病毒分子CAP80相互影響并發(fā)生作用[22]。病毒在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)一步發(fā)育至成熟階段，p72的抗氧化功能也進(jìn)一步增強(qiáng)，為成熟病毒粒子的擴(kuò)散埋下基礎(chǔ)。在血清檢測(cè)試驗(yàn)中，p72衣殼蛋白的基因序列高度保守，且在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出較好的抗原性[23]，因而可以被用來血清病毒檢測(cè)，作為開發(fā)非洲豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒的抗原。

1.4 DNA結(jié)合蛋白

在ASFV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白中，DNA結(jié)合蛋白部分包被非洲豬瘟病毒的基因組，從而組成ASFV的類核區(qū)域。其DNA結(jié)合蛋白包括p10和pA104R，都位于成熟病毒粒子的類核外層，能夠促進(jìn)病毒類核的組裝以及加快病毒粒子成熟的進(jìn)度，對(duì)病毒粒子結(jié)構(gòu)具有顯著影響。研究表明，結(jié)合蛋白還參與病毒DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄翻譯等過程，在ASFV作用機(jī)制里具有不可替換的作用。當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)ASFV蛋白質(zhì)組具有復(fù)雜性和靈活性[24]。

ASFV編碼一種類組織蛋白pA104R和參與基因組復(fù)制及包裝的細(xì)菌蛋白具有高度序列同源性。位于pA104R DNA結(jié)合區(qū)域69位的精氨酸被發(fā)現(xiàn)與高效的DNA結(jié)合位點(diǎn)活性相關(guān)。siRNA敲除實(shí)驗(yàn)表明，pA104R在病毒DNA復(fù)制和基因表達(dá)時(shí)發(fā)揮著關(guān)鍵作用，轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯示更低的病毒子代(最多-82.0%)、更低的病毒基因組拷貝數(shù)(-78.3%)和更低的晚期病毒基因轉(zhuǎn)錄(-47.6%)[22]。

pA104R與細(xì)菌HU/IHF家族成員在序列和功能上具有相似性，是病毒復(fù)制所必需的。Apo-pA104R形成同源二聚體，并折疊成保存在細(xì)菌熱不穩(wěn)定核蛋白/整合宿主因子(HUS/IHFs)中的結(jié)構(gòu)。而pA104R-DNA復(fù)合體結(jié)構(gòu)揭示了pA104R具有與其細(xì)菌同源物不同的DNA結(jié)合模式[25]。

pA104R與參與基因組復(fù)制和包裝的細(xì)菌蛋白具有廣泛的序列同源性。通過定點(diǎn)誘變，發(fā)現(xiàn)位于pA104R DNA結(jié)合區(qū)域69位的精氨酸與高效的DNA結(jié)合活性相關(guān)。研究表明，pA104R參與了病毒DNA拓?fù)涞恼{(diào)控，可能參與了病毒DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和包裝。pA104R在感染后期表達(dá)，并在病毒DNA復(fù)制位點(diǎn)積累。這些結(jié)果表明pA104R參與了病毒DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和基因組包裝的調(diào)控，提示A104R缺失突變體可能是一種很好的AFS疫苗開發(fā)對(duì)象[22]。

2 致病機(jī)理

2.1 ASFV與宿主細(xì)胞

ASFV侵入宿主體內(nèi)后，其復(fù)制主要在家豬和野豬的巨噬細(xì)胞內(nèi)完成。前期階段，ASFV首先跟體內(nèi)紅細(xì)胞粘合，再經(jīng)過血液運(yùn)輸至巨噬細(xì)胞，由細(xì)胞骨架微管轉(zhuǎn)移至巨噬細(xì)胞核殼處，再侵入細(xì)胞核內(nèi)核酸處，開始進(jìn)行復(fù)制表達(dá)，從而制造大量的ASFV并運(yùn)輸至身體各部分的組織中。這個(gè)過程首先進(jìn)行mRNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯，提供合成DNA病毒所需的原材料，隨后在細(xì)胞核內(nèi)開始復(fù)制，產(chǎn)生中間體后轉(zhuǎn)移至核外繼續(xù)包裝；后期階段，病毒DNA、膜組分、結(jié)構(gòu)蛋白、某些宿主蛋白被波形蛋白和線粒體包裹，與此同時(shí)病毒RNA也轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核的周圍，進(jìn)行大量高效的病毒復(fù)制，最終包裝完整的病毒粒子沿微管被運(yùn)送至細(xì)胞膜并釋放到細(xì)胞外[26]。當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，ASFV蛋白質(zhì)組具有復(fù)雜性和靈活性，具有病毒復(fù)制、吸附、侵入宿主細(xì)胞、復(fù)制與裝配、逃避免疫防御系統(tǒng)等功能。ASFV的復(fù)制表達(dá)與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)聯(lián)，感染細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的DNA復(fù)制開始后，病毒轉(zhuǎn)錄發(fā)生轉(zhuǎn)變，使得ASFV 的復(fù)制具有相對(duì)自主性，其基因表達(dá)可以精確調(diào)控。

單核-巨噬細(xì)胞是最先被感染的地方，其次是樹突細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨核細(xì)胞、血小板、中性粒細(xì)胞和肝細(xì)胞[27，28]。ASFV結(jié)構(gòu)最外層的核殼部分，上面存在與目的細(xì)胞表層結(jié)合位點(diǎn)相識(shí)別的信息物質(zhì)，細(xì)胞表層物質(zhì)有利于病毒的侵染及加快病毒在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散，在病毒防治上具有研究意義[29]。

2.2 ASFV與宿主動(dòng)物

非洲豬瘟主要在家豬和野豬中傳染，因而是ASFV入侵的主要宿主生物。ASFV侵入宿主細(xì)胞后進(jìn)行復(fù)制表達(dá)，在胞內(nèi)快速繁殖，入侵宿主體內(nèi)的各系統(tǒng)。研究表明，病毒主要入侵宿主的呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)，病毒首先在扁桃體內(nèi)增殖，然后進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，引起呼吸及免疫系統(tǒng)損傷等表現(xiàn)[30]。隨后病毒在骨髓、肺臟及肝臟處進(jìn)行復(fù)制表達(dá)。

ASFV在不同宿主間作用跟病毒的致病性密切相關(guān)。對(duì)于家豬而言，不同毒株對(duì)家豬的致病力表現(xiàn)不同，機(jī)體感染病毒后出現(xiàn)亞臨床感染到急性死亡等不同的癥狀；對(duì)于野豬而言，其與家豬表現(xiàn)出不同的特征，野豬感染ASFV后常表現(xiàn)為無明顯癥狀且僅伴有低病毒血癥，

3 展望

非洲豬瘟在我國(guó)的流行，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。面對(duì)嚴(yán)峻形勢(shì)，除了加強(qiáng)生物安全宣傳外，加快疫苗研制是目前最佳的防控手段。哈爾濱獸醫(yī)研究所研制了某株 ASFV復(fù)制基因片段缺失的弱毒性病毒，該疫苗病毒敲除了控制ASFV復(fù)制表達(dá)的基因片段，保留其病毒蛋白的良好抗原性。臨床試驗(yàn)表明，接種該疫苗的豬群生長(zhǎng)狀況良好，無明顯感染非洲豬瘟癥狀。其作用機(jī)理是影響病毒在宿主細(xì)胞體內(nèi)的復(fù)制擴(kuò)散，可以有效抵抗同源病毒株系的侵染，以及保護(hù)非同源株系病毒的感染。但弱毒性病毒在豬體內(nèi)是否會(huì)發(fā)生病毒基因重組以及出現(xiàn)毒力返強(qiáng)現(xiàn)象，敲除控制復(fù)制的基因片段是否會(huì)導(dǎo)致原保護(hù)作用的丟失，以及疫苗病毒的生物安全性等都需要更進(jìn)一步的研究；亞單位疫苗的制備主要是利用ASFV編碼某些蛋白具有誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的機(jī)理，其疫苗本身不含核酸，但能誘導(dǎo)受體產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)株系的抗體。相較于弱毒性疫苗，不會(huì)出現(xiàn)基因重組誘導(dǎo)毒力返強(qiáng)現(xiàn)象，但未證實(shí)某種編碼蛋白只提供免疫保護(hù)。此外，研究表明缺乏pA104R基因的ASFV可以作為開發(fā)ASF疫苗的一種策略。

AsfvAP采用了一種不同于其他APs的新型DNA結(jié)合模式。AsfvAP擁有許多獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，包括一個(gè)窄nucleotide-binding口袋活性部位，C16～C20的二硫鍵包含區(qū)域等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)可知，這些特性對(duì)AsfvAP適應(yīng)酸性和氧化環(huán)境很重要，可以作為設(shè)計(jì)小分子抑制劑的靶標(biāo)，從而破壞修復(fù)ASFV基因組的過程以對(duì)抗該病毒[31]。

目前在弱毒性疫苗研制上取得了重大突破，且技術(shù)相對(duì)成熟。出于對(duì)弱毒性疫苗生物安全性的考慮，需要優(yōu)化敲除控制ASFV復(fù)制的基因片段組合。一方面需要確保弱毒性疫苗的免疫原性在宿主體內(nèi)正常表達(dá)；另一方面要確保其在宿主內(nèi)不發(fā)生基因重組，使毒性返強(qiáng)。因而，生物安全性是制約弱毒性疫苗大規(guī)模生產(chǎn)的重要因素。