李書(shū)華，王艷曉

(河南質(zhì)量工程職業(yè)學(xué)院，河南 平頂山 467000)

0 引言

林可霉素為 Streptomycin lincolnensis 所發(fā)酵生產(chǎn)中廣效型抗生素，可以單獨(dú)使用或是與 spetniomycin 合并使用，以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)及改善飼料效率，對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌、霉?jié){菌及幽門(mén)桿菌均具有抗菌作用，常用于治療禽類及豬呼吸道感染癥或水產(chǎn)動(dòng)物鏈球菌感染，與紅霉素有拮抗作用，不可同時(shí)使用。

微生物檢測(cè)法是最早使用于檢測(cè)林可霉素的方法，但是其檢測(cè)的專一性與準(zhǔn)確度皆不理想，以儀器來(lái)分析林可霉素可得較準(zhǔn)確的結(jié)果。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)飼料中林可霉素檢驗(yàn)是以微生物方法為主，在消費(fèi)者對(duì)食品中動(dòng)物用藥品殘留愈來(lái)愈重視的今天，急需開(kāi)發(fā)儀器定性定量的方法以避免爭(zhēng)議。故本研究以常見(jiàn)的氣相層析質(zhì)譜儀為檢測(cè)儀器，開(kāi)發(fā)出高準(zhǔn)確度與高靈敏度的儀器分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

安捷倫(Agilent)氣相層析儀系統(tǒng)，包括氣相層析儀(6890 N)及質(zhì)譜儀(5973 N)。日立(Hitachi)高效能液相層析系統(tǒng)包括幫浦(L7100)、自動(dòng)取樣器(L7200)、光二極管偵測(cè)器(L7450)、試管震蕩器(Vortex Gene 2)、12孔吹氮器裝置(N-EVAP) 、離心機(jī)(KN70) 、純水系統(tǒng)(Millpore Synergy185) 。

1.2 試藥

林可霉素(lincomycin)及克林霉素(clindamycin)，分析級(jí)藥品，購(gòu)自Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，MO)；衍生試劑N-methyl-N(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(MSTFA)，購(gòu)自Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，MO)。甲醇(methanol) LC 級(jí)藥品、冰醋酸(acetic Acid)、醋酸鋅(zinic acetate hydrate) 及黃鐵鹽(potassium hexcyanolerrate(Ⅱ) trihydrate)皆為試藥級(jí)，購(gòu)自Merck KGaA.(Darmstadt，Germany)；去離子水(18 MΩ) 經(jīng)由Millpore Synergy185純水系統(tǒng)處理。

1.3 實(shí)驗(yàn)器具

15 mL及50 mL PP材質(zhì)(polypropylene) 含蓋離心管，1.5 mL及2 mL微量試管，10 mL及100 mL定量瓶，J.T.Baker 12孔固相萃取裝置，0.22 μm 孔徑PVDF材質(zhì)(polyvinylidene fluoride) 針筒過(guò)濾膜，OASIS hydrophilic-lipophilic balance(HLB)材質(zhì)3 mL 60 mg固相萃取匣。

1.4 卡瑞試劑

1)卡瑞試劑Ⅰ，取21.9 g醋酸鋅加入3 mL冰醋酸以去離子水定量至 100 mL。

2)卡瑞試劑Ⅱ，取 10.6 g磺鐵鹽以去離子水定量至 100 mL。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液與檢量線的制備

正確秤取林可霉素及克林霉素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg分別置于10 mL定量瓶中，以甲醇溶解，并定量至 10 mL，為儲(chǔ)存溶液(stock solution)。此儲(chǔ)存液溶含1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品并存放于2℃～8℃冰箱內(nèi)，不超過(guò)1個(gè)月。使用時(shí)將林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液以甲醇稀釋至濃度為10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL及0.625 μg/mL，作為檢量線溶液。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品(internal standard，IS) 克林霉素則以甲醇稀釋至濃度為 5 μg/mL。取100 μL 各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液及5 μg/mL內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于同一個(gè)玻璃樣品瓶中，以吹氮?dú)庋b置濃縮干燥后加入100 μL MSTFA，再以鋁蓋密封后置于烘箱中以 80℃加熱 40 min。

1.6 固相萃取測(cè)試

將固相萃取匣裝置于固相萃取裝置中，預(yù)先以5 mL甲醇及 5 mL 去離子水平衡(condition)后，依序加入5 mL 10 μg/mL 的林可霉素溶液(溶于5%的甲醇溶液)、2 mL去離子水、2 mL 5%甲醇溶液及5 mL甲醇。分別收集此4部份沖提(eluted) 樣品以HPLC檢測(cè)。

1.7 樣品的配制

正確秤取飼料樣品5±0.01 g，置于50 mL離心管中，加入25 mL 5%的甲醇，再添加 125 μL 1 000 g/mL克林霉素，振蕩 10 min后，以4 000 rpm離心5 min，取上清液5 mL于15 mL的離心管中，加入0.5 mL卡瑞試劑Ⅰ及0.5 mL卡瑞試劑Ⅱ，振蕩混合后以4 000 rpm離心5 min。通過(guò)以 5 mL甲醇及5 mL去離子水潤(rùn)溼過(guò)的固相萃取管柱，以2 mL去離子水沖洗，再以2 mL 5%甲醇洗凈后抽干5 min，最后以5 mL甲醇沖出。取0.1 mL甲醇溶液以氮?dú)獯蹈?，再?.1 mL MSTFA置于80℃烘箱反應(yīng)30 min，即為待測(cè)樣品。

1.8 分析條件

液相層析儀分析管柱為 Luna 250×4.6 mm I.D.，粒徑為 5 μm，移動(dòng)相為0.01%磷酸:乙腈=88:12(v/v)，波長(zhǎng)設(shè)定為 210 nm，以 50 μL 注入儀器分析。

氣相層析儀分析管柱為 DB-5MS 30 m × 0.25 mmI.D.入口壓力13.2 psi，He流速1 mL/min，溫度條件為 injector:300℃，升溫程序設(shè)定150℃恒溫1.5 min，以 20℃/min升溫至230℃再恒溫3 min，以20℃/min升溫至300℃再恒溫5 min。總分析時(shí)間為15.92 min。以 1 μL 注入分析，分析模式為不分流，以全掃描模式(SCAN) 分析。

2 結(jié)果與討論

林可霉素的分子量為406.54 g/moL，pKa=7.6，易溶于甲醇。在固相萃取方面，本實(shí)驗(yàn)選擇了3種品牌的固相萃取匣測(cè)試，并在各萃取階段收集分析，因萃取液含有5%甲醇，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大部分C18固相萃取匣在5%甲醇環(huán)境下無(wú)法將林可霉素完全吸附。本實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行3 d的測(cè)試，在添加10 μg/g、5 μg/g及1 μg/g的濃度時(shí)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為9.13%、4.00%及13.60%。除了在添加1 μg/g 時(shí)的再現(xiàn)性超過(guò)10%，其余皆在10%以內(nèi)。依測(cè)試的結(jié)果來(lái)看，此分析方法的回收率平均為84%、重復(fù)性 RSD%平均為7%與再現(xiàn)性RSD%平均為9%，與一般文獻(xiàn)中驗(yàn)證的結(jié)果差異不大，符合分析方法一般要求，因此可以應(yīng)用于飼料中林可霉素的檢驗(yàn)分析。

林可霉素的分析較少見(jiàn)到以 GC/MS 的分析方法，經(jīng) MSTFA 衍生化后可以提高其特異性，有助于增加檢測(cè)感度。依實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，此方法具有良好的回收率、重復(fù)性與再現(xiàn)性，儀器一次分析時(shí)間約16 min而且不需要復(fù)雜的前處理，定性定量方面皆優(yōu)于HPLC 法，亦不須使用LC/MS/MS貴重儀器即能準(zhǔn)確的分析，故本方法可應(yīng)用于飼料中的殘留檢驗(yàn)。