劉丹寧，潘夢(mèng)雪，楊璐嘉，黃潔瑤，任 巧，袁呂江

枳實(shí)總黃酮對(duì)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的腸黏膜炎小鼠腸道菌群失調(diào)的影響

劉丹寧，潘夢(mèng)雪，楊璐嘉，黃潔瑤，任 巧*，袁呂江*

西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715

研究枳實(shí)總黃酮對(duì)5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）誘導(dǎo)的腸黏膜炎和腸道菌群的影響及作用機(jī)制。雄性昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及枳實(shí)總黃酮低、中、高劑量（50、100、200 mg/kg）組和洛哌丁胺（0.3 mg/kg組），ip 5-FU（50 mg/kg）5 d誘導(dǎo)腸黏膜炎模型，第6天開始，各給藥組ig相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)7 d，觀察小鼠體質(zhì)量、飲食量、飲水量、腹瀉評(píng)分、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、結(jié)腸形態(tài)、隱窩深度；采用蘇木素-伊紅（HE）染色考察小鼠結(jié)腸組織病理變化；采用ELISA法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平；檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性和丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）水平；采用細(xì)菌16S rRNA基因V3～4區(qū)高通量測(cè)序技術(shù)分析小鼠腸道菌群變化。與模型組相比，枳實(shí)總黃酮組小鼠體質(zhì)量和飲食量增加，飲水量減少，腹瀉評(píng)分降低，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著增加（＜0.05、0.01），結(jié)腸組織損傷減輕，結(jié)腸長(zhǎng)度和隱窩深度顯著增加（＜0.05、0.01），結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著降低（＜0.05、0.01），SOD和GSH-Px活性顯著升高（＜0.05、0.01），MDA水平顯著降低（＜0.01）。16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果顯示，模型組小鼠腸道菌群多樣性和豐度降低，枳實(shí)總黃酮組小鼠腸道菌群多樣性和豐度增加。門水平主要表現(xiàn)為厚壁菌門相對(duì)豐度升高；屬水平上擬桿菌屬、unidentified_、擬普雷沃菌屬、unidentified_和乳酸桿菌屬5個(gè)菌屬相對(duì)豐度升高。枳實(shí)總黃酮能夠有效改善5-FU所致的小鼠腸黏膜炎，其機(jī)制可能與抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)。

枳實(shí)總黃酮；5-氟尿嘧啶；腸黏膜炎；腸道菌群；抗氧化；抗炎；蕓香柚皮苷；柚皮苷；橙皮苷

5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是一種抗代謝藥物，為治療惡性腫瘤最常用的處方藥之一[1]。由于5-FU對(duì)DNA合成抑制的作用是非靶向性的，它不僅攻擊腫瘤細(xì)胞，還攻擊正常細(xì)胞，導(dǎo)致增殖抑制、DNA損傷和細(xì)胞死亡，引起廣泛的不良反應(yīng)[2-3]。其中最嚴(yán)重的不良反應(yīng)之一為腸黏膜炎并伴有嚴(yán)重腹瀉[4-5]。研究表明，活性氧（reactive oxygen species，ROS）[6]、炎性細(xì)胞因子[7-8]、細(xì)胞凋亡[9]以及腸道菌群失調(diào)是導(dǎo)致腸黏膜炎的主要因素[10-11]。50～80%接受5-FU治療的患者發(fā)展為腸黏膜炎或伴有嚴(yán)重腹瀉的黏膜炎[12-13]。目前治療腸黏膜炎和腸黏膜炎腹瀉的藥物大多是以對(duì)癥和短期治療為原則[14-15]。因此，開發(fā)安全有效的藥物對(duì)治療5-FU誘導(dǎo)的腸黏膜炎有重要意義。

枳實(shí)是酸橙L.及其栽培品種或甜橙Osbeck的干燥幼果，長(zhǎng)期以來作為中藥單味或入制劑治療腹瀉、胃脹脹痛和子宮脫垂等胃腸道疾病[16]。黃酮類、生物堿、揮發(fā)油和香豆素是枳實(shí)的主要活性成分[17-18]。枳實(shí)中的揮發(fā)油成分具有抗真菌[19]、抗焦慮[20]和抗乙酰膽堿酯酶活性[21]；辛弗林和-甲基酪胺等生物堿類成分通常作為食品補(bǔ)充劑，可以減輕體質(zhì)量并改善體態(tài)[22]；黃酮類成分中的蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷具有抗氧化[23]、抗癌[24]、抗炎[25]、保護(hù)胃黏膜[26]、抗凝、調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)[27]、保護(hù)神經(jīng)[28]等作用。然而，枳實(shí)黃酮類成分對(duì)化療誘導(dǎo)的腸黏膜炎的作用及機(jī)制少有報(bào)道。本研究從枳實(shí)中制備得到總黃酮，探究其對(duì)5-FU誘導(dǎo)的腸黏膜炎小鼠的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性昆明小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，8周齡，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCKK（湘）2016-0002。動(dòng)物在SPF級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，動(dòng)物房溫度控制在（20±5）℃，濕度控制在（55±5）%，通風(fēng)環(huán)境好，并且保持12 h明暗交替。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》和《中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物立法》（第398-2006號(hào)）進(jìn)行操作，并由西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)yxy201912）。

1.2 藥品與試劑

枳實(shí)（批號(hào)20190801）購(gòu)自重慶市忠縣中藥有限公司，經(jīng)西南大學(xué)藥學(xué)院李學(xué)剛教授鑒定為蕓香科植物酸橙L.；洛哌丁胺膠囊（批號(hào)H10910085）購(gòu)自西安楊森制藥有限公司；5-FU注射液（批號(hào)H20051113）購(gòu)自山西普德藥業(yè)有限公司；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)分別為20190426、20190319、20190321）購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）試劑盒（批號(hào)分別為20190313、20190319、20190425）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；柚皮苷（批號(hào)Y-006-171216，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、蕓香柚皮苷（批號(hào)Y-071-170917，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、橙皮苷（批號(hào)C-006-170216，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.3 儀器

LC-20AD型高效液相色譜儀（HPLC，日本島津公司）；KQ5200DB型超聲波清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司）；QVSW-20A型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海榮生化工儀器廠）；HHW-21CU-600B型恒溫水浴鍋（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；YP6000N型電子天平（上海精密儀器科技有限公司）；WK1000A型高速多功能粉碎機(jī)（山東青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司）；TDL-5A型臺(tái)式低速大容量離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器）；ELX808型酶標(biāo)分析儀（美國(guó)基因有限公司）；DY89型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SIM-FI40AY65型制冰機(jī)（日本松下電器）；OMYSS-325型全自動(dòng)高壓滅菌鍋（日本TOMY公司）；低溫微量高速離心機(jī)（重慶市醫(yī)療器械有限公司）；超凈工作臺(tái)（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 枳實(shí)總黃酮的制備

枳實(shí)總黃酮由本課題組采用低共熔溶劑（氯化膽堿/醋酸）進(jìn)行超聲波輔助提取，利用大孔吸附樹脂富集分離技術(shù)對(duì)溶液中黃酮類成分富集分離，采用HPLC儀檢測(cè)枳實(shí)總黃酮中蕓香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.36%、0.629%、15.96%。

2.2 造模、分組與給藥

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組以及枳實(shí)總黃酮低、中、高劑量（50、100、200 mg/kg）組和洛哌丁胺（0.3 mg/kg）組，每組10只。對(duì)照組ip 0.9%氯化鈉溶液，其余各組ip 5-FU（50 mg/kg）5 d誘導(dǎo)腸黏膜炎模型；從第6天開始，各給藥組ig相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組ig 0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)7 d。自造模第1天起，每天記錄各組小鼠體質(zhì)量、飲食量、飲水量、大便形狀及臨床表現(xiàn)，并對(duì)腹瀉狀態(tài)進(jìn)行腹瀉評(píng)分，評(píng)分≥1的小鼠被認(rèn)為是腹瀉，表現(xiàn)為自主活動(dòng)減少、肛周污染、體質(zhì)量減輕、糞便濕軟或呈水樣，評(píng)分為0表明小鼠大便正常，自主活動(dòng)和體質(zhì)量增加。

2.3 胸腺和脾臟指數(shù)的測(cè)定

各組小鼠于取材前1天（末次給藥后）禁食但不禁水12 h，樣本采集當(dāng)天首先稱定小鼠體質(zhì)量，小鼠ip 3%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉，采血后脫頸椎處死小鼠，緊靠心臟處取下胸腺，胃后面取下脾臟，濾紙吸去血跡，分別稱定質(zhì)量。無(wú)菌條件下收集結(jié)腸中糞便并測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度，計(jì)算胸腺和脾臟指數(shù)。

胸腺（脾臟）指數(shù)＝胸腺（脾臟）質(zhì)量/體質(zhì)量

2.4 腸黏膜病理觀察

取約2 cm長(zhǎng)的結(jié)腸段固定在4%甲醛溶液中，用石蠟包埋，切成4 μm切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察腸黏膜病理變化，評(píng)估結(jié)腸的病理變化，同時(shí)測(cè)量隱窩深度。

2.5 ELISA法測(cè)定結(jié)腸組織炎癥因子水平

按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)結(jié)腸組織中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

2.6 比色法測(cè)定結(jié)腸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)

按照試劑盒說明書檢測(cè)結(jié)腸組織中SOD、GSH-Px活性和MDA水平。

2.7 腸道菌群測(cè)序

使用QIAamp DNA糞便Mini Kit從樣品中提取微生物DNA。用帶條形碼的特異引物（338F，806R）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的區(qū)域（V3～4）。熱循環(huán)包括以下條件：98 ℃、2 min（1個(gè)循環(huán)）；95 ℃、30 s，50 ℃30 s，72 ℃、1 min（30個(gè)循環(huán)）；最后在72 ℃下延伸5 min。PCR產(chǎn)物的高通量測(cè)序在Illumina MiSeq平臺(tái)上進(jìn)行高質(zhì)量的生物信息學(xué)分析讀數(shù)，根據(jù)UCLUST，基于97%的序列相似性，每個(gè)樣品的所有有效讀數(shù)都被歸類為可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。對(duì)于α多樣性分析，將OTU劃分為多個(gè)指標(biāo)，包括OTU等級(jí)、稀釋曲線以及Shannon、Chao1、Simpson和ACE的計(jì)算指標(biāo)。對(duì)于β多樣性分析，使用QIIME進(jìn)行RDA識(shí)別的OTU熱圖、主成分分析（principal component analysis，PCA）、主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）、非度量多維標(biāo)度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）和帶算術(shù)平均值的非加權(quán)對(duì)組方法（unweighted-pair- group method with arithmetic averag，UPGMA）。進(jìn)行線性判別分析效應(yīng)大?。↙EfSe）分析以定量分析各組之間的生物標(biāo)志物。使用LEfSe分析，LDA閾值＞4，非參數(shù)階乘Kruskal-Wallis（KW）和秩檢驗(yàn)，然后（不成對(duì)的）Wilcoxon秩和檢驗(yàn)來識(shí)別差異最大的分類單元。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 枳實(shí)總黃酮對(duì)腸黏膜炎小鼠腹瀉相關(guān)指標(biāo)的影響

如圖1所示，對(duì)照組小鼠活動(dòng)敏捷，體質(zhì)量增加，飲食飲水正常，毛發(fā)光滑，無(wú)腹瀉情況。模型組小鼠出現(xiàn)腹瀉、扎堆、懶動(dòng)、體質(zhì)量減輕、飲食減少、飲水增加、翻毛和肛周污漬癥狀。各給藥組小鼠體質(zhì)量和飲食增加、飲水減少，第12天各給藥組腹瀉評(píng)分接近正常，表明腹瀉基本好轉(zhuǎn)。第12天除模型組外，其余各組小鼠糞便基本正常，進(jìn)一步說明枳實(shí)總黃酮明顯改善了5-FU誘導(dǎo)的小鼠腹瀉。

圖1 枳實(shí)總黃酮對(duì)腸黏膜炎小鼠體質(zhì)量 (A)、飲水量(B)、飲食量(C)、腹瀉評(píng)分(D) 和糞便外觀 (E) 的影響

3.2 枳實(shí)總黃酮對(duì)腸黏膜炎小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，枳實(shí)總黃酮中、高劑量組和洛哌丁胺組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)顯著增加（＜0.05、0.01），表明枳實(shí)總黃酮可以使腸黏膜炎小鼠胸腺和脾臟指數(shù)恢復(fù)至正常水平。

3.3 枳實(shí)總黃酮對(duì)腸黏膜炎小鼠結(jié)腸形態(tài)和組織病理學(xué)的影響

如圖3-A、B所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度顯著縮短（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組結(jié)腸長(zhǎng)度顯著增加（＜0.05、0.01）。如圖3-C所示，模型組小鼠結(jié)腸組織隱窩深度顯著降低（＜0.01），各給藥組隱窩深度明顯恢復(fù)（＜0.01），表明枳實(shí)總黃酮可以恢復(fù)腸黏膜炎小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度，增加隱窩深度。如圖3-D所示，對(duì)照組小鼠基本沒有出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，隱窩結(jié)構(gòu)保持完整且排列規(guī)則；模型組小鼠結(jié)腸組織中，上皮細(xì)胞壞死，隱窩結(jié)構(gòu)被破壞，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)到黏膜層；與模型組相比，各給藥組腸上皮細(xì)胞、隱窩的形狀和分布得以恢復(fù)，表明枳實(shí)總黃酮可以修復(fù)5-FU誘導(dǎo)的結(jié)腸黏膜損傷，減輕腸道炎癥反應(yīng)。

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖3 枳實(shí)總黃酮對(duì)腸黏膜炎小鼠結(jié)腸形態(tài) (A)、結(jié)腸長(zhǎng)度(B)、隱窩深度(C)和結(jié)腸組織病理變化(D) 的影響

3.4 枳實(shí)總黃酮對(duì)腸黏膜炎小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子水平的影響

如圖4所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著增加（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著降低（＜0.05、0.01），表明枳實(shí)總黃酮能夠調(diào)節(jié)腸黏膜炎小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子水平。

3.5 枳實(shí)總黃酮對(duì)腸黏膜炎小鼠結(jié)腸組織中SOD、GSH-Px活性和MDA水平的影響

如圖5所示，與對(duì)照組相比，各造模組小鼠結(jié)腸組織中SOD和GSH-Px活性顯著降低（＜0.01），MDA水平顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，洛哌丁胺組結(jié)腸組織中GSH-Px活性顯著升高（＜0.01），MDA水平顯著降低（＜0.01）；枳實(shí)總黃酮各劑量組結(jié)腸組織中SOD和GSH-Px活性顯著升高（＜0.05、0.01），MDA水平顯著降低（＜0.01），表明枳實(shí)總黃酮可以改善腸黏膜炎小鼠的氧化應(yīng)激參數(shù)。

3.6 枳實(shí)總黃酮對(duì)腸黏膜炎小鼠腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的影響

如圖6-A所示，每個(gè)樣品的平均有效序列為77 099條，各組之間的DNA序列無(wú)顯著差異。分析表明，盡管通過更高的測(cè)序覆蓋率可以獲得新的系統(tǒng)，但每個(gè)樣品中的腸道菌群多樣性大都可以在當(dāng)前測(cè)序深度下得到充分捕獲（圖6-B）。Illumina Hiseg測(cè)序系統(tǒng)產(chǎn)生了929個(gè)可操作分類單位，相似度截止為97%。組間OTU重疊表明，6組共有455個(gè)相同的OTU，對(duì)照組、模型組、洛哌丁胺組以及枳實(shí)總黃酮低、中、高劑量組分別有14、11、28、18、9、4個(gè)獨(dú)立的OUT（圖6-C）。與對(duì)照組相比，模型組OTU數(shù)量略有減少；與模型組相比，枳實(shí)總黃酮中劑量組OUT數(shù)量明顯增加，枳實(shí)總黃酮低、高劑量組對(duì)OUT數(shù)量沒有產(chǎn)生影響（圖6-D）。OUT數(shù)據(jù)表明，通過枳實(shí)總黃酮中劑量可以恢復(fù)腸道菌群的多樣性。

圖4 枳實(shí)總黃酮對(duì)腸黏膜炎小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響

圖5 枳實(shí)總黃酮對(duì)腸黏膜炎小鼠結(jié)腸組織中SOD、GSH-Px活性和MDA水平的影響

A-每個(gè)糞便樣品的質(zhì)量序列均低于97%一致性閾值 B-反光分析 C-OTU維恩圖 D-各組OUT E-PCA散點(diǎn)圖 F-NMDS散點(diǎn)圖 G-Chao1指數(shù) H-ACE指數(shù) I-Simpson指數(shù) J-Shannon指數(shù)

為了闡明不同群體之間微生物群結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)行β多樣性分析包括PCA和NMDS。如圖6-E所示，PC1和PC2變化的百分比分別為18.85%和12.46%，模型組與其他5組樣本相距較遠(yuǎn)，枳實(shí)總黃酮各劑量組較洛哌丁胺組更接近對(duì)照組，NMDS分析也觀察到同樣的結(jié)果（圖6-F）。如圖6-G～J所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，枳實(shí)總黃酮中劑量組Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)顯著升高（＜0.05），洛哌丁胺組Chao1、ACE、Simpson和Shannon指數(shù)顯著降低（＜0.05）。

綜上，5-FU通過減少微生物群落豐富度和多樣性改變了腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)，枳實(shí)總黃酮中劑量有效地恢復(fù)了腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)，洛哌丁胺使腸道微生物的豐富性和多樣性的降低，使得腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)進(jìn)一步惡化。

3.7 枳實(shí)總黃酮對(duì)腸黏膜炎小鼠腸道菌群的影響

如圖7所示，在門水平上，擬桿菌門、厚壁菌門和變形桿菌門是各組的主要菌門。擬桿菌門、厚壁菌門、變形桿菌門、unidentified_Bacteria和放線菌門相對(duì)豐度分別為58.31%、34.52%、1.45%、4.10%和1.00%，占總豐度的99.38%。與對(duì)照組比較，模型組擬桿菌門和變形桿菌門分別增加至65.70%和3.67%，厚壁菌門和放線菌門分別減少至26.21%和0.37%；洛哌丁胺組及枳實(shí)總黃酮低、中劑量組厚壁菌門相對(duì)豐度分別恢復(fù)到31.70%、29.54%、37.86%。與對(duì)照組比較，模型組厚壁菌門/擬桿菌門（F/B）顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，洛哌丁胺組及枳實(shí)總黃酮低、中劑量組F/B顯著升高（＜0.05、0.01）。

如圖8所示，在屬水平上，對(duì)照組擬桿菌屬、擬普雷沃菌屬、乳酸桿菌屬、unidentified_、、unidentified_、副擬桿菌屬、幽門螺桿菌屬、相對(duì)豐度分別為10.47%、10.56%、7.03%、0.32%、2.50%、2.64%、2.12%、3.65%、0.07%，占總豐度的39%以上；與對(duì)照組相比，模型組擬桿菌屬、unidentified_、相對(duì)豐度分別增加到32.7%、1.69%、0.56%，擬普雷沃菌屬、乳酸桿菌屬、、unidentified_相對(duì)豐度分別降低到5.33%、6.07%、0.90%、0.96%。與模型組相比，各給藥組擬桿菌屬相對(duì)豐度降低，枳實(shí)總黃酮低、中劑量組unidentified_相對(duì)豐度降低；陽(yáng)性藥組和枳實(shí)總黃酮高劑量組擬普雷沃菌屬相對(duì)豐度增加，枳實(shí)總黃酮高劑量組的乳酸桿菌屬相對(duì)豐度升高。表明5-FU導(dǎo)致了明顯的腸道菌群失調(diào)，枳實(shí)總黃酮可以有效地改善腸道菌群失調(diào)情況。

圖7 枳實(shí)總黃酮對(duì)腸黏膜炎小鼠腸道菌群門水平相對(duì)豐度的影響

圖8 枳實(shí)總黃酮對(duì)腸黏膜炎小鼠腸道菌群屬水平相對(duì)豐度的影響

4 討論

本研究結(jié)果表明，小鼠給予5-FU后，體質(zhì)量嚴(yán)重降低，腹瀉、飲食減少，飲水增加，皮毛松弛，懶動(dòng)；枳實(shí)總黃酮可顯著改善腸黏膜炎小鼠的一般狀態(tài)，表明枳實(shí)總黃酮可以改善5-FU引起的不良反應(yīng)[29]；枳實(shí)總黃酮可以恢復(fù)腸黏膜炎小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度，改善隱窩萎縮，抑制炎癥因子水平，表明枳實(shí)總黃酮對(duì)結(jié)腸形態(tài)和黏膜具有保護(hù)作用；枳實(shí)總黃酮能夠通過改善胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)恢復(fù)了腸黏膜炎小鼠受損的免疫功能。綜上所述，枳實(shí)總黃酮可有效減輕5-FU引起的腸道不良反應(yīng)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[30-31]。

ROS、DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜相互作用以調(diào)節(jié)信號(hào)通路，通過產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子導(dǎo)致組織破壞和炎癥反應(yīng)。5-FU通過抑制內(nèi)源性抗氧化劑（如SOD、過氧化氫酶、GSH、GSH-Px）活性及升高M(jìn)DA和促炎細(xì)胞因子（包括TNF-α、IL-1β、IL-6）水平，誘導(dǎo)腸黏膜炎[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠給予5-FU后，結(jié)腸組織中SOD和GSH-Px活性降低，MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高；枳實(shí)總黃酮能夠提高SOD和GSH-Px活性，抑制MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。因此，枳實(shí)總黃酮能夠通過抗氧化和抗炎來治療5-FU誘導(dǎo)的腸黏膜炎。

5-FU干擾腸道微生物群落。通過16S rDNA擴(kuò)增測(cè)序技術(shù)分析了各組小鼠糞便樣本中的微生物群。結(jié)果表明，5-FU造模后小鼠腸道菌群的豐富度和多樣性顯著降低，從而腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；枳實(shí)總黃酮中劑量組通過增加豐富度和多樣性將腸道微生物群的整體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)到正常水平。

在門水平上，模型組小鼠腸道厚壁菌門相對(duì)豐度降低，擬桿菌門和變形桿菌門相對(duì)豐度增加，F(xiàn)/B降低；枳實(shí)總黃酮使腸道厚壁菌門相對(duì)豐度增加，擬桿菌門和變形桿菌門相對(duì)豐度降低，從而提高F/B。由于厚壁菌和變形桿菌是糞便相關(guān)菌，而擬桿菌被認(rèn)為是黏膜相關(guān)菌，它們的豐度變化最有可能引發(fā)細(xì)菌感染和胃腸道疾病如腹瀉和腸炎[33]。F/B是評(píng)估腸易激綜合征[34]、炎癥性腸病[35]和代謝紊亂[36]等腸病患者的常用指標(biāo)。

在屬水平上，模型組小鼠腸道擬桿菌屬、unidentified_和相對(duì)豐度顯著增加，而擬普雷沃菌屬、乳酸桿菌屬、和unidentified_相對(duì)豐度顯著降低。擬桿菌是與5-FU治療相關(guān)的重要病原菌之一，一些梭狀芽孢桿菌如肉毒梭菌，由于產(chǎn)生外毒素而被認(rèn)為是致病菌。益生菌乳桿菌可以改善5-FU引起的腸道損傷和生態(tài)失調(diào)[37]。瘤胃球菌通過產(chǎn)生丁酸鹽為腸上皮細(xì)胞提供必需的能量，以提高腸道免疫力[38]。枳實(shí)總黃酮能夠抑制潛在致病菌并促進(jìn)了糞便中的益生菌，從而改善5-FU誘導(dǎo)的腸道微生物群失調(diào)。

枳實(shí)總黃酮的黏膜保護(hù)作用、枳實(shí)總黃酮中活性成分與腸道微生物群之間的具體關(guān)系仍待進(jìn)一步確定。一是糞便群落不能完全代表生活在腸道中的細(xì)菌群落[39]；二是當(dāng)枳實(shí)總黃酮調(diào)節(jié)腸道微生物群的整體結(jié)構(gòu)時(shí)，其黏膜保護(hù)作用和成分可能會(huì)受到腸道微生物代謝和藥動(dòng)學(xué)的影響[40]。例如，在枳實(shí)總黃酮中分別占15.45%、39.19%的柚皮苷和橙皮苷對(duì)人體腸道微生物群（半乳糖擬桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、鏈狀雙歧桿菌、布氏瘤胃球菌、大腸桿菌）沒有表現(xiàn)出體外抑制活性，但苷元缺表現(xiàn)出體外抑制活性[41]。因此，枳實(shí)總黃酮活性成分和腸道微生物群變異之間關(guān)系的系統(tǒng)和全面解釋將是本課題組后續(xù)研究的重點(diǎn)。

綜上所述，枳實(shí)總黃酮可以通過抑制氧化應(yīng)激、抑制促炎細(xì)胞因子分泌并調(diào)節(jié)腸道微生物群的整體結(jié)構(gòu)和組成，有效減輕5-FU誘導(dǎo)的腸黏膜炎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of total flavonoids fromon intestinal flora imbalance in mice with intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil

LIU Dan-ning, PAN Meng-xue, YANG Lu-jia, HUANG Jie-yao, REN Qiao, YUAN Lyu-jiang

College of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China

To study the effect and mechanism of total flavonoids from Zhishi (, AFIF) on mice with intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil (5-FU).Male Kunming mice were randomly divided into control group, model group, low-, medium- and high-dose AFIF (50, 100, 200 mg/kg) groups and loperamide (0.3 mg/kg) group. 5-FU (50 mg/kg) was injected intraperitoneally for 5 d to induce intestinal mucositis model. Beginning on day 6, rats in each administration group were ig corresponding drugs, once a day for 7 consecutive days. The body weight, diet intake, water intake, diarrhea score, thymus index, spleen index, colon morphology and crypt depth were observed. Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to investigate the pathological changes of colon. Levels of interlerkin-6 (IL-6), IL-1β and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in colon tissues were determined by ELISA; Superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) activities, and malondialdehyde (MDA) level were detected; 16S rRNA gene V3—4 regions for high throughput sequencing technology was used to analysis the changes of intestinal flora.Compared with model group, body weight and food intake of mice in AFIF groups were increased, water intake and diarrhea score were decreased, thymus and spleen index were significantly increased (< 0.05, 0.01), colon tissue damage was reduced, colon length and crypt depth were significantly increased (< 0.05, 0.01); Levels of pro-inflammatory cytokines IL-6, IL-1β and TNF-α in colon tissue were significantly reduced (< 0.05, 0.01); Activities of SOD and GSH-Px were significantly increased (< 0.05, 0.01), and MDA level was significantly decreased (< 0.01). 16S rRNA gene sequencing results showed that diversity and abundance of intestinal flora of mice in model group was reduced, diversity and abundance of intestinal flora of mice in AFIF groups were increased. At phylum level, the relative abundance of Firmicutes was increased in AFIF groups. At genus level, the relative abundance of, unidentified_,, unidentified_andwere increased.AFIF can effectively improve 5-FU induced intestinal mucositis in mice, and its mechanism may be related to the anti-oxidation, anti-inflammatory and regulation of intestinal flora.

total flavonoids from; 5-fluorouracil; intestinal mucositis; intestinal flora; anti-oxidant; anti-inflammatory; narirutin; naringin; hesperidin

R285.5

A

0253 - 2670(2021)23 - 7204 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.014

2021-08-16

重慶科委社會(huì)事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新專項(xiàng)（cstc2017shmsA10004）

劉丹寧（1993—），女，碩士研究生，主要從事中藥活性成分研究。E-mail: 2427817565@qq.com

袁呂江，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥活性成分研究。E-mail: yuanlujiang@hotmail.com

任 巧，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥活性成分研究。E-mail: qren2014@swu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]