孫文丹， 孟 強(qiáng)， 王景超， 于燕萍， 田 靜， 于 軍， 商姍姍， 張 娟

(山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院 山東濟(jì)南 250100)

硒是人和動(dòng)物生長(zhǎng)必需的微量元素之一，適量的硒可以調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫力、提高抗氧化能力等[1]。人體一旦缺硒，會(huì)減弱組織細(xì)胞抗氧化損傷能力，影響人體細(xì)胞的分裂、繁殖、遺傳及生長(zhǎng)，進(jìn)而干擾核酸、蛋白質(zhì)、多糖和酶的合成及代謝[2-4]。

人體不能自行合成硒，而且人體各器官不具有長(zhǎng)期儲(chǔ)存硒的功能，人體所需的硒需要通過食物來(lái)獲取，因此合理提高農(nóng)產(chǎn)品中的硒含量是十分必要的[5]?！巴寥?植物-人”食物鏈?zhǔn)侨梭w獲取硒的有效途徑。農(nóng)產(chǎn)品中的硒主要來(lái)自于土壤中的硒，而我國(guó)約有三分之二的地區(qū)存在不同程度的缺硒，其中三分之一為嚴(yán)重缺硒地區(qū)[6]。這些地區(qū)的缺硒狀況可以通過在土壤中增施硒肥或向作物葉面噴施含硒制劑得到改善，進(jìn)而提高農(nóng)產(chǎn)品中的硒含量。

硒在生物體內(nèi)以有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒兩種形態(tài)存在。與無(wú)機(jī)硒相比，有機(jī)硒的安全性和可利用性更高。目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，外源施硒多選用的是無(wú)機(jī)硒、富硒酵母等，其中無(wú)機(jī)硒在農(nóng)產(chǎn)品生長(zhǎng)過程中能否轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒及其轉(zhuǎn)化程度，需要進(jìn)行硒形態(tài)分析[7-8]。因此，建立簡(jiǎn)單準(zhǔn)確的有機(jī)硒含量測(cè)定方法十分必要。目前硒的形態(tài)分析方法主要有原子熒光光譜法[9]、高效液相色譜法[10]、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ICP-MS)[11]、電泳-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(CE-ICP-MS)[12]等，其中原子熒光光譜法具有操作簡(jiǎn)單、干擾少、靈敏度高等特點(diǎn)。本文采用原子熒光光譜法對(duì)糧谷中有機(jī)硒含量的測(cè)定進(jìn)行了研究。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

選取小麥、玉米和大米等3種主要糧食作物作為試驗(yàn)樣品。樣品脫粒后，除去雜物，清洗烘干，縮分至約50 g，粉碎，完全通過孔徑為0.25 mm(60目)的尼龍篩，混勻貯存于聚乙烯瓶中。

硝酸(HNO3)、高氯酸(HClO4)、過氧化氫(H2O2)、氫氧化鉀(KOH)，優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸(HCl)，優(yōu)級(jí)純，煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司；正辛醇(C8H18O)、環(huán)己烷(C6H12)、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硼氫化鉀(KBH4)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，1 000 μg/mL，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；硒標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，1 μg/mL；硒代蛋氨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

硼氫化鉀溶液(8 g/L)：稱取8 g硼氫化鉀，溶于1 000 mL氫氧化鉀溶液(5 g/L)中，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

鐵氰化鉀溶液(100 g/L)：稱取10 g鐵氰化鉀，溶于100 mL水中，混勻。

硝酸-高氯酸(9+1)混合酸：將900 mL硝酸與100 mL高氯酸混勻。

1.2 儀器與設(shè)備

AFS-9760型雙道原子熒光光度計(jì)，北京海光儀器公司；MARS6型微波消解儀，美國(guó)CEM公司；BSA224S型電子天平，瑞士Sartorius公司；SP-1005型零污染制樣破碎機(jī)，天津拓至明實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)開發(fā)有限公司；SHY-2A型恒溫水浴振蕩器，上海梅香儀器有限公司；HC-3018型離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；DR-600型數(shù)顯恒溫電熱板，北京盈安美誠(chéng)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 儀器測(cè)定條件

負(fù)高壓：300 V；燈電流：80 mA；原子化溫度：800 ℃；爐高：8 mm；載氣流量：500 mL/min；屏蔽氣流量：1 000 mL/min；測(cè)量方式：標(biāo)準(zhǔn)曲線法；讀數(shù)方式：峰面積；延遲時(shí)間：1 s；讀數(shù)時(shí)間：15 s；加液時(shí)間：8 s；進(jìn)樣體積：2 mL。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 總硒的測(cè)定

稱取0.500 0 g試樣，置于消解罐中，加5 mL硝酸，振搖混合均勻，放入微波消解儀中消化。消解結(jié)束，待冷卻后，將消解液轉(zhuǎn)入錐形瓶中，加幾粒玻璃珠，在電熱板上繼續(xù)加熱至近干。再加 6 mol/L鹽酸溶液5 mL，繼續(xù)加熱至溶液變清亮，冷卻，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加入100 g/L鐵氰化鉀溶液1 mL，用水定容，混勻待測(cè)。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

1.4.2 無(wú)機(jī)硒的測(cè)定

稱取1.000 0 g試樣于50 mL離心管中，加入0.1 mol/L鹽酸溶液20 mL，混勻靜置8～12 h，置于70 ℃的恒溫水浴振蕩器中，以160 r/min振蕩2 h。提取完畢，冷卻至室溫后，以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取上層清液。將收集的上清液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入環(huán)己烷5 mL萃取。收集水相于燒杯中，在70 ℃水浴上蒸發(fā)至5～10 mL。然后加入硝酸-高氯酸混合酸10 mL及幾粒玻璃珠，在電熱板上加熱至清亮無(wú)色并有白煙出現(xiàn)。冷卻，加6 mol/L鹽酸溶液5 mL，再置于電熱板上加熱沸騰幾分鐘后取下。冷卻后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加入100 g/L鐵氰化鉀溶液1 mL，用水定容，混勻待測(cè)。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

1.4.3 有機(jī)硒含量的計(jì)算

有機(jī)硒含量為總硒含量與無(wú)機(jī)硒含量的差值。

1.5 工作曲線

移取一系列硒標(biāo)準(zhǔn)工作溶液至100 mL容量瓶中，分別加入100 g/L鐵氰化鉀溶液10 mL，用鹽酸(5+95)溶液定容，配制成質(zhì)量濃度為0、1.00、5.00、10.0、20.0、30.0 μg/L的系列工作溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 無(wú)機(jī)硒樣品前處理方法的選擇

2.1.1 提取劑

生物體內(nèi)的無(wú)機(jī)硒主要以硒酸鹽和亞硒酸鹽的形式存在，有機(jī)硒以硒蛋白、硒多糖、硒核酸等大分子化合物以及硒代氨基酸等小分子化合物形式存在[13]。測(cè)定無(wú)機(jī)硒常用的提取劑主要有水[14]、酸[15]和乙醇[16]等，其中稀酸為良好的硒提取劑，通常首選鹽酸體系。

考察了不同濃度的鹽酸溶液對(duì)小麥中無(wú)機(jī)硒提取的影響，結(jié)果見表1。

表1 鹽酸濃度對(duì)無(wú)機(jī)硒提取的影響

由表1可知：當(dāng)鹽酸溶液濃度小于0.1 mol/L時(shí)，無(wú)機(jī)硒的測(cè)定值隨鹽酸溶液濃度的升高而增大，其原因是隨著鹽酸溶液濃度的升高，無(wú)機(jī)硒逐漸被溶解出來(lái)；當(dāng)鹽酸溶液濃度增大至0.5 mol/L時(shí)，無(wú)機(jī)硒的測(cè)定值基本不變，說明在稀酸條件下，無(wú)機(jī)硒可以完全溶出；但繼續(xù)升高鹽酸溶液濃度，無(wú)機(jī)硒的測(cè)定值有大幅增加，其原因可能是酸濃度過高，有機(jī)硒的結(jié)構(gòu)遭到破壞后溶解出來(lái)，影響了無(wú)機(jī)硒的測(cè)定。因此，試驗(yàn)選用0.1 mol/L的鹽酸溶液作為提取劑。

2.1.2 提取溫度和提取時(shí)間

考察了溫度和時(shí)間對(duì)小麥中無(wú)機(jī)硒提取的影響，結(jié)果見表2和表3。

表2 溫度對(duì)無(wú)機(jī)硒提取的影響

表3 時(shí)間對(duì)無(wú)機(jī)硒提取的影響

結(jié)果表明：70 ℃下提取2 h，無(wú)機(jī)硒的測(cè)定值較高；隨著提取溫度的升高和提取時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)機(jī)硒的測(cè)定值增加不明顯。因此，試驗(yàn)選取提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間為2 h。

2.1.3 可溶性淀粉類物質(zhì)

雜糧中的可溶性淀粉類物質(zhì)會(huì)對(duì)硒元素的檢測(cè)產(chǎn)生干擾。在無(wú)機(jī)硒的提取過程中，雜糧中的可溶性淀粉類物質(zhì)會(huì)溶出，導(dǎo)致無(wú)機(jī)硒提取液的成分復(fù)雜。當(dāng)直接測(cè)試提取液時(shí)，硒的熒光信號(hào)為0。這是因?yàn)樘崛∫褐械奈镔|(zhì)與還原劑反應(yīng)產(chǎn)生大量泡沫，影響了氫化物的傳輸。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，消泡劑可以破壞和抑制泡沫薄膜的產(chǎn)生，選用正辛醇作為消泡劑可抑制大量泡沫，解決大量泡沫影響熒光測(cè)定的問題[17]。試驗(yàn)考察了在5 μg/L硒標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中正辛醇對(duì)硒熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果見表4。

表4 正辛醇對(duì)無(wú)機(jī)硒測(cè)定的影響

由表4可知，加入3滴正丁醇的硒標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的測(cè)定值降低，這說明消泡劑在一定程度上會(huì)減弱硒的熒光信號(hào)，使測(cè)定結(jié)果偏低。

加大正辛醇的用量后，泡沫消失，但硒標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的熒光強(qiáng)度降為零，說明加入消泡劑不能有效解決可溶性淀粉類物質(zhì)對(duì)硒含量測(cè)定的影響。試驗(yàn)采用將提取液消解后再進(jìn)行測(cè)定的方法，得到了準(zhǔn)確可靠的測(cè)定數(shù)據(jù)。

2.1.4 小分子有機(jī)硒的分離

用稀鹽酸提取糧谷中無(wú)機(jī)硒的同時(shí)也會(huì)將部分小分子有機(jī)硒提取出來(lái)。研究表明，水相中的小分子有機(jī)硒經(jīng)甲苯[18]、環(huán)己烷[19]等有機(jī)溶劑的萃取，可以與無(wú)機(jī)硒有效分離?？紤]到試驗(yàn)的安全性，采用環(huán)己烷萃取分離提取液中的小分子有機(jī)硒。選用小分子有機(jī)硒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)硒代蛋氨酸進(jìn)行驗(yàn)證。

配制一定濃度的硒代蛋氨酸溶液，按試驗(yàn)方法進(jìn)行無(wú)機(jī)硒的測(cè)定。結(jié)果表明：使用環(huán)己烷萃取分離得到的水相提取液中未檢測(cè)出硒元素；未使用環(huán)己烷萃取分離的上層水相清液，硒的回收率為93.1%。說明環(huán)己烷能有效萃取分離小分子有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒。

2.2 工作曲線及檢出限

在相同試驗(yàn)條件下，對(duì)0～30.0 μg/L的硒系列工作溶液進(jìn)行測(cè)定，硒的線性回歸方程為If=279.463ρ+13.161，相關(guān)系數(shù)大于0.999。對(duì)樣品空白溶液連續(xù)測(cè)定11次，按3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法的檢出限為0.1 μg/L。按稱樣量1 g、定容體積25 mL，計(jì)算無(wú)機(jī)硒的檢出限為0.003 mg/kg。

2.3 方法的精密度與回收率

2.3.1 精密度試驗(yàn)

對(duì)小麥、大米、玉米等樣品中的無(wú)機(jī)硒進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定6次，計(jì)算方法的精密度，結(jié)果見表5。

表5 精密度試驗(yàn)結(jié)果

從表5可以看出：玉米樣品中的無(wú)機(jī)硒含量較低，未檢出；小麥和大米樣品中無(wú)機(jī)硒測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.20%和4.93%，說明試驗(yàn)方法具有良好的重復(fù)性，可用于糧谷中無(wú)機(jī)硒含量的測(cè)定。

2.3.2 回收試驗(yàn)

對(duì)小麥、大米、玉米等樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。分別向樣品中加入0.200、0.500 mg/kg硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)樣品平行測(cè)定2次，取2次結(jié)果的平均值作為測(cè)定值，結(jié)果見表6。

表6 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

從表6可以看出，糧谷中無(wú)機(jī)硒的加標(biāo)回收率為89.0%～93.8%，說明試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度較高。

2.4 實(shí)際樣品中有機(jī)硒的測(cè)定

有機(jī)硒含量通過總硒含量與無(wú)機(jī)硒含量的差減得到。按試驗(yàn)方法測(cè)定2個(gè)小麥樣品、2個(gè)大米樣品、2個(gè)玉米樣品，結(jié)果見表7。

表7 各樣品中總硒、無(wú)機(jī)硒、有機(jī)硒的測(cè)定結(jié)果

由表7可以看出：小麥、大米樣品中有機(jī)硒占總硒百分比分別為76.7%、77.2%、85.7%、86.1%；玉米樣品中總硒含量較少，未能檢出無(wú)機(jī)硒。

3 結(jié)語(yǔ)

本文建立了糧谷中無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒的測(cè)定方法，用鹽酸溶液在70 ℃水浴中提取其中的無(wú)機(jī)硒，離心，然后用環(huán)己烷提純上清液，分離得到含無(wú)機(jī)硒的水相，采用原子熒光光譜法測(cè)定總硒和無(wú)機(jī)硒含量，有機(jī)硒含量為總硒與無(wú)機(jī)硒含量的差值。本方法中無(wú)機(jī)硒的加標(biāo)回收率為89.0%～93.8%，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，具有良好的重復(fù)性，為糧谷中無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒的測(cè)定提供了一種可靠的檢測(cè)方法。