王 柳 李淑芳

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021）

膿毒癥是一種由感染引起的生理、病理和生化異常綜合征，發(fā)病率和病死率高［1］。國(guó)外一項(xiàng)基于7個(gè)高收入國(guó)家的膿毒癥流行病學(xué)調(diào)查估計(jì)，全球每年可有3 150萬(wàn)例膿毒癥病例，并有530萬(wàn)病例死亡［2］，平均每人花費(fèi)3.2萬(wàn)美元［3］。隨著膿毒癥與腸道菌群研究的深入，目前發(fā)現(xiàn)膿毒癥與腸道菌群之間存在密切關(guān)聯(lián)，為探索膿毒癥的發(fā)病機(jī)制與治療開(kāi)辟了新的研究方向。前期臨床研究已證實(shí)炎調(diào)方可調(diào)控膿毒癥大鼠及患者的白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子水平，減輕炎癥反應(yīng)，從而降低膿毒癥患者的病死率［4］。據(jù)此可以猜測(cè)，炎調(diào)方正是通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)減輕炎癥反應(yīng)，達(dá)到治療膿毒癥的作用。本研究旨在探討炎調(diào)方對(duì)膿毒癥大鼠腸道微生態(tài)環(huán)境的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，由上海西普爾-必凱有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-2016，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物批號(hào)：1910150023。大鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫22～24℃，相對(duì)濕度40%～60%。每5只裝1個(gè)鼠籠，自由飲水，進(jìn)食普通標(biāo)準(zhǔn)飼料，每天7∶00～19∶00予以光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

炎調(diào)方由生大黃9 g（后下），芒硝10 g（沖），桃仁10 g，玄參15 g，赤芍15 g，當(dāng)歸15 g，金銀花15 g，連翹15 g，麥冬10 g組成。以上藥物購(gòu)自曙光醫(yī)院，采用藥物免煎劑，將藥物加入等體積蒸餾水，使藥液濃縮成含生藥1.0 g/mL，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊（培菲康，產(chǎn)自上海上藥信誼藥廠有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 S10950032，含菌量 5.8×1010CFU/g），使用時(shí)將0.035 g粉劑倒入eppendorf管中，加入2 mL的等滲NaCl溶液混勻，含益生菌≥1×109CFU/mL。

1.3 試劑與儀器

DNA抽提試劑盒DNeasy? PowerSoil? Pro Kit購(gòu)自QIAGEN公司。建庫(kù)試劑盒NEXTFLEX Rapid DNASeq Kit購(gòu)自Bioo Scientific公司，測(cè)序試劑盒MiSeq Re?agent Kit購(gòu)自Illumina公司，以上試劑盒均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供。ELISA試劑盒（IL-8、IL-10和TNF-α）購(gòu)自上海威奧有限公司。灌胃針、眼科剪、眼科鑷、血管鉗、手術(shù)縫針、手術(shù)縫線、穿刺針、凍存離心管、電子天平均由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 分組與給藥

采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，以SPSS25.0生成隨機(jī)數(shù)字，將40只SD大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、炎調(diào)方組、益生菌組、炎調(diào)方+益生菌組，每組8只。各組均常規(guī)飼養(yǎng)。假手術(shù)組、模型組以生理鹽水2 mL連續(xù)灌胃3 d，每天1次；參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［5］，換算大鼠使用的炎調(diào)方劑量為9.8 g/（kg·d），炎調(diào)方組以炎調(diào)方（9.8 g/kg）灌胃3 d，每天1次；益生菌組以益生菌灌胃（LGG 1×109CFU/mL）灌胃3 d，每天1次；聯(lián)合組以炎調(diào)方（9.8 g/kg）和益生菌灌胃（LGG 1×109CFU/mL）灌胃3 d，每天1次。

1.5 模型制備［6］

各組均于第3次灌胃2 h后造模。大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后剃去腹部被毛，75%酒精消毒腹部皮膚，沿腹中線位置剪開(kāi)1～2 cm，分離表皮和肌層，找到盲腸，小心分離盲腸，避免損傷腸系膜血管。在盲腸長(zhǎng)度1/2或3/4的位置用3號(hào)線結(jié)扎，結(jié)扎后使用8號(hào)針頭來(lái)回貫穿兩次，從針孔擠出少量腸內(nèi)容物，將盲腸放回腹腔，盡量避免腸內(nèi)容物黏附在手術(shù)切口，逐層縫合肌肉層和皮膚。術(shù)后予生理鹽水（30 mL/kg）皮下注射預(yù)防休克。假手術(shù)組麻醉后開(kāi)腹翻動(dòng)盲腸，隨即關(guān)腹。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.6.1 糞便標(biāo)本采集與16Sr DNA測(cè)序 單手捏住頸后皮毛將其提起，另一只手固定尾部（灌胃和腹腔注射樣姿勢(shì)），待大鼠自然排便后收集于5 mL Ep管中，-80℃保存，干冰寄送?；贗llumina Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行16Sr DNA測(cè)序。糞便標(biāo)本經(jīng)研磨、震蕩、離心、洗脫得到總DNA。完成DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。利用338F_806R引物（F端序列：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，R端序列：GG ACTACHVGGGTWTCTAAT）對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量與均一化，構(gòu)建Miseq文庫(kù)，最后借助Illumina Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行16Sr DNA測(cè)序。Miseq測(cè)序得到的原始序列首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，區(qū)分樣本后按照97%的相似度進(jìn)行OTU聚類，得到原始OTU表。測(cè)序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.6.2 血清標(biāo)本采集與炎癥因子（IL-8、IL-10和TNF-α）檢測(cè) 2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠，固定于固定架，剪去腹正中毛發(fā)，安爾碘消毒皮膚，置于超凈臺(tái)，鋪巾。用無(wú)菌手術(shù)器械沿腹正中線逐層剪開(kāi)，拉出腸等腔內(nèi)器官，打開(kāi)后腹膜層，暴露腹主動(dòng)脈，以5 mL無(wú)菌注射器緩慢抽血，裝入非抗凝無(wú)菌管中，以3 000 r/min離心15 min，取上清，分裝，-80℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定大鼠血清IL-8、IL-10和TNF-α，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)上操作方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS25.0及美吉生物云平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以（±s）差表示，符合正態(tài)分布且方差齊性的采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布且方差不齊的采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率或百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組炎癥因子水平比較

見(jiàn)表1。與假手術(shù)組比較，模型組IL-8、TNF-α水平升高，IL-10水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。炎調(diào)方組、益生菌組和聯(lián)合組TNF-α水平高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），IL-10水平低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，炎調(diào)方組、益生菌組和聯(lián)合組IL-8水平、TNF-α水平均較模型組降低，IL-10水平均較模型組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與炎調(diào)方組比較，IL-10水平益生菌組降低，聯(lián)合組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；TNF-α水平益生菌組、聯(lián)合組均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

表1 各組炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

注：與假手術(shù)組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與炎調(diào)方組相比，#P<0.05，##P<0.01。下同。

組別假手術(shù)組模型組炎調(diào)方組益生菌組聯(lián)合組n 8 8 8 8 8 IL-8 27.38±18.38**55.01±10.23▲▲29.06±4.60**28.89±3.15**37.19±9.17**IL-10 46.16±6.44**##17.26±3.76##▲▲30.59±4.76**▲▲24.37±2.52**##▲▲38.79±2.88**##▲▲TNF-α 163.43±31.58**#513.69±41.35##▲▲225.46±37.89**▲262.67±49.82**▲▲392.10±103.55**##▲▲

2.2 各組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)5組CLP膿毒癥大鼠共40個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序，得到有效序列數(shù)為1 921 430，有效堿基數(shù)為811 500 698 bp，平均序列長(zhǎng)度為422.34。按最小樣本序列數(shù)對(duì)原始OTU表進(jìn)行抽平后用于后續(xù)分析。隨著測(cè)序數(shù)量的增加，泛物種逐漸增加，核心物種逐漸減少，兩者曲線趨于平緩，根據(jù)Pan/Core曲線評(píng)估顯示樣本量充足，見(jiàn)圖1。

圖1 樣本測(cè)序曲線

2.3 各組腸道菌群α多樣性指數(shù)分析

見(jiàn)表2。與假手術(shù)組比較，模型組simpson指數(shù)升高（P<0.01）。與模型組比較，炎調(diào)方組sobs指數(shù)升高（P<0.05），shannon指數(shù)升高（P<0.01），simpson指數(shù)降低（P<0.05）。與炎調(diào)方組比較，益生菌組shannon指數(shù)降低（P<0.01），simpson指數(shù)升高（P<0.01）；聯(lián)合組sobs指數(shù)和shannon指數(shù)均降低（P<0.01或P<0.05），simpson指數(shù)升高（P<0.05）。

表2 各組腸道菌群α多樣性指數(shù)分析比較（±s）

表2 各組腸道菌群α多樣性指數(shù)分析比較（±s）

images/BZ_43_1248_577_2252_643.png 假手術(shù)組模型組炎調(diào)方組益生菌組聯(lián)合組88888 213.30±29.70 227.10±38.30#262.60±20.70▲▲*239.30±25.40 240.50±17.30▲#3.10±0.30 2.90±0.40##3.50±0.10▲▲**3.20±0.20##3.20±0.20##0.10±0.03 0.13±0.08▲▲#0.06±0.01▲▲*0.09±0.02##0.09±0.03#

2.4 各組腸道菌群LEfSe多級(jí)物種差異判別分析

在α多樣性指數(shù)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行腸道菌群結(jié)構(gòu)分析，即采用線性判別分析（LDA）估算物種豐度對(duì)多樣性指數(shù)組間差異的影響大小，LDA閾值為2，結(jié)果見(jiàn)表3，圖2～圖4。1）在模型組中，理巖菌科（Rikenel?laceae）、黃桿菌科（Flavobacteriaceae）和葡萄球菌科（Staphylococcaceae）存在高豐度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；疣微菌門（Verrucomicrobiota）豐度相較于其他各組大大減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2）益生菌 組雙歧桿菌（Bifidobacteriaceae）存在高豐度（LDA值=2.50，P<0.001）。3）炎調(diào)方組疣微菌門存在高豐度，均高于其他各組（LDA值=4.11，P<0.05）。

表3 各組腸道菌群LEfSe多級(jí)物種差異判別分析

圖2 各組理巖菌科、黃桿菌科豐度比較

圖3 各組葡萄球菌科、雙歧桿菌科豐度比較

圖4 各組疣微菌門豐度比較

3 討論

腸道被認(rèn)為是膿毒癥和多臟器功能障礙的“始動(dòng)器官”和關(guān)鍵的促炎器官［1］，腸道微生態(tài)失調(diào)是導(dǎo)致膿毒癥免疫炎癥失衡以及多臟器功能障礙的核心。膿毒癥時(shí)，細(xì)胞旁通透性增加［7-8］，從而增加腸黏膜的通透性。此外，膿毒癥患者的腸上皮細(xì)胞凋亡顯著上升，進(jìn)一步降低了腸屏障功能，并因此導(dǎo)致腸道菌群易位。Robert P.Dickson等的實(shí)驗(yàn)表明肺菌群中腸道細(xì)菌的富集與急性全身性炎癥的嚴(yán)重程度相關(guān)［9］。目前已有實(shí)驗(yàn)證明腸道菌群與膿毒癥免疫炎癥反應(yīng)有密切關(guān)系［10-12］。因此，逆轉(zhuǎn)膿毒癥時(shí)的腸道菌群失衡可能是改善膿毒癥全身炎癥反應(yīng)的突破口。

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠、小鼠的腸道菌群主要為擬桿菌門、厚壁菌門，其次為變形菌門、放線菌門和疣微菌門等，與人體相似［13］。目前針對(duì)膿毒癥腸道菌群的調(diào)控，僅限于益生菌、益生元和糞便菌群移植（FMT）的應(yīng)用等，但是FMT技術(shù)并不成熟。因此，調(diào)節(jié)腸道菌群藥物和方法的局限性為探究中醫(yī)藥干預(yù)腸道菌群提供了更大的空間。

膿毒癥屬于中醫(yī)學(xué)“熱病”范疇，發(fā)病關(guān)鍵為熱、毒、瘀。本課題組總結(jié)膿毒癥的病機(jī)為熱毒積聚，毒陷入腑，致腑實(shí)營(yíng)熱，治療上當(dāng)以通腑、清熱、活血為要［14］。炎調(diào)方全方一通腑氣，暢達(dá)氣機(jī)；二解熱毒，拔本塞源；三護(hù)陰津，陰陽(yáng)和合。由于炎調(diào)方的目標(biāo)作用器官在腸腑，且前期臨床試驗(yàn)已證實(shí)炎調(diào)方可降低IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α水平以減輕膿毒癥患者和膿毒癥大鼠的炎癥反應(yīng)［4，15］。故此，本實(shí)驗(yàn)以腸道菌群為切入點(diǎn)，通過(guò)益生菌、炎調(diào)方等不同的干預(yù)方式，探究炎調(diào)方對(duì)腸道菌群的調(diào)控作用是否是其治療膿毒癥的潛在機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，模型組較假手術(shù)組IL-8、TNF-α水平升高，IL-10水平下降，說(shuō)明CLP造模成功。炎調(diào)方與益生菌聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于調(diào)控IL-10水平效果比單用炎調(diào)方效果顯著，而在調(diào)控TNF-α水平方面，炎調(diào)方優(yōu)于益生菌組和炎調(diào)方+益生菌組。炎調(diào)方的干預(yù)成功減輕了膿毒癥大鼠過(guò)度的炎癥反應(yīng)。在α多樣性分析中，以sobs指數(shù)反映群落豐富度，其與群落豐富度呈正相關(guān)；以shannon指數(shù)、simpson指數(shù)反映群落多樣性，shannon指數(shù)與群落多樣性呈正相關(guān)；simpson指數(shù)與群落多樣性呈負(fù)相關(guān)。膿毒癥大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，模型組shannon指數(shù)較假手術(shù)組減低，simp?son指數(shù)升高，反映了膿毒癥大鼠腸道菌群多樣性降低。炎調(diào)方、益生菌、炎調(diào)方和益生菌聯(lián)合干預(yù)均可以提高膿毒癥大鼠腸道菌群多樣性，炎調(diào)方組優(yōu)于兩外兩組。本實(shí)驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)在提高腸道菌群多樣性方面，益生菌與炎調(diào)方二者之間存在協(xié)同性。

在α多樣性指數(shù)分析基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步采用LDA分析篩選對(duì)組間差異影響較大的物種。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組中存在高豐度且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的菌群為黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、理巖菌科（Rikenellace?ae）和葡萄球菌科（Staphylococcaceae）?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，黃桿菌科可能是替加環(huán)素抗性基因tet（X）的潛在祖先來(lái)源［16］，布洛芬等非甾體抗炎藥物的使用可以增加理巖菌科的細(xì)菌數(shù)量［17］，金黃色葡萄球菌是常見(jiàn)的致病菌，可引起皮膚和軟組織感染、手術(shù)部位感染、肺炎和敗血癥等多種疾病［18-19］。而益生菌組雙歧桿菌的高豐度極可能由培菲康干預(yù)導(dǎo)致。另外，疣微菌門作為炎調(diào)方組區(qū)別與其他各組的菌種，其與炎調(diào)方作用機(jī)制可能存在潛在關(guān)聯(lián)，需今后進(jìn)一步探索研究。本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)在于通過(guò)炎調(diào)方與益生菌干預(yù)的對(duì)照，明確了炎調(diào)方在減輕過(guò)度的炎癥反應(yīng)和提高膿毒癥大鼠腸道菌群多樣性方面的優(yōu)勢(shì)，并且排除了臨床上抗生素應(yīng)用、喂養(yǎng)方式以及大便標(biāo)本采集時(shí)間和不同感染部位等多因素對(duì)腸道菌群的干擾。但是本實(shí)驗(yàn)采用統(tǒng)一的創(chuàng)傷性造模方式，與臨床上非創(chuàng)傷性感染引起的膿毒癥存在差異。在腸道菌群豐度和多樣性方面，炎調(diào)方組、益生菌組和炎調(diào)方+益生菌組均高于假手術(shù)組這一現(xiàn)象需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜合以上分析，炎調(diào)方在調(diào)控膿毒癥大鼠炎癥因子水平，減輕過(guò)度的炎癥反應(yīng)的同時(shí)，可以提高膿毒癥大鼠腸道菌群多樣性和豐富度。其減輕炎癥反應(yīng)與調(diào)節(jié)腸道菌群之間的關(guān)聯(lián)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。