孟天偉 常 虹

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150036；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040）

急性心肌梗死（AMI）是以冠狀動脈粥樣硬化為主要機制，在此基礎(chǔ)上，由于內(nèi)膜損傷、血流變緩、血小板沉積等因素引起血栓形成，心肌供血進一步減少甚至中斷，使心肌嚴重而持久地急性缺血，即發(fā)生心肌梗死［1］。另外，心肌耗氧量增加或冠狀動脈痙攣也是誘發(fā) AMI的條件因素［2］。AMI屬于中醫(yī)“真心痛”“厥心痛”的范疇，《靈樞·厥病》有云“真心痛，手足清至節(jié)，心痛甚，旦發(fā)夕死，夕發(fā)旦死”。由此可見該病具有病情重，病勢急的特點。經(jīng)過歷代醫(yī)家總結(jié)發(fā)現(xiàn)本病為本虛標實證，本虛主要是以氣虛、陽虛、陰虛為主，其中心氣虛、心陰虛最為常見。標實主要有血瘀、氣滯、痰濕、寒凝，其中血瘀為該病最主要的病理特點，且常常夾雜于其他實邪之中。心陽虧虛，痰濁阻絡(luò)引發(fā)心痛也是臨床常見的一類癥型［3］。

復(fù)方丹參滴丸是由丹參、三七、冰片3種藥材經(jīng)過現(xiàn)代工藝特殊加工制成的丸劑型中成藥，具有活血化瘀，理氣止痛的作用，對于氣滯血瘀型冠心病，胸悶、心前區(qū)刺痛的心絞痛或心肌梗死患者具有較好的療效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，復(fù)方丹參滴丸具有抗鈣超載、抗炎、抗氧化、抑制血栓形成等作用。任宏強等［4］發(fā)現(xiàn)，復(fù)方丹參滴丸可通過降低AMI大鼠心肌細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達水平來抑制AMI細胞凋亡。李建等［5］發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸能抑制AMI患者左心室重構(gòu)，且副作用小。復(fù)方丹參滴丸是第一例通過美國認證的復(fù)方中成藥，在其治療AMI的眾多研究中，更多的是對于復(fù)方丹參滴丸治療AMI的單靶點、單通路的作用機制的相關(guān)研究。本次研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法構(gòu)建藥物、靶點以及相關(guān)通路的網(wǎng)絡(luò)圖，將可能治療疾病的相關(guān)靶點和通路展示，為后續(xù)的研究提供參考和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 復(fù)方丹參滴丸化學(xué)成分的獲取及相關(guān)靶點篩選在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫及分析平臺TCMSP（https：//tc?mspw.com/tcmsp.php）以復(fù)方丹參滴丸中主要成分丹參、三七、冰片的名稱為關(guān)鍵詞進行檢索，獲取復(fù)方丹參滴丸中各化合物的相關(guān)信息。并以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，半衰期（HL）≥4 h作為篩選指標，篩選出符合條件的有效成分。再通過Swiss Target Prediction［6］（http：//www.Swisstargetprediction.ch/）查找單個成分作用的靶點，將靶點輸入至UniProt（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫中，校正基因名稱。

1.2 急性心肌梗死相關(guān)靶點篩選 以“Acute myocar?dial infarction”為關(guān)鍵詞通過DisGENET數(shù)據(jù)庫（http：//www.disgenet.org/）以及 DrugBank數(shù)據(jù)庫（http：//www.drugbank.ca/）檢索疾病靶點，選取基因和疾病的相關(guān)性平均值以上的靶點，以保證此次研究的準確性。

1.3 復(fù)方丹參滴丸治療急性心肌梗死的核心靶點篩選將藥物靶點與疾病靶點映射獲得相關(guān)治療靶點，并將這些靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）獲得蛋白互作信息，篩選閾值高于0.900的高置信度互作信息。使用Cytoscape3.8.0［7］軟件構(gòu)建復(fù)方丹參滴丸與AMI疾病靶點網(wǎng)絡(luò)，并通過軟件中的Network Ana?lyzer功能進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，篩選節(jié)點自由度大于平均值的靶點作為核心靶點。

1.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析 使用Omicshare（http：//www.omicshare.com/tools/index.php/）平臺對核心靶點進行GO二級分類富集分析，物種選擇“智人”運行獲得生物過程，分子功能，細胞成分分析結(jié)果。利用DAVID平臺（https：//david.ncifcrf.gov/）對核心靶點進行基因組百科全書KEGG（kyoto encyclope?dia of genes and genomes）通路分析，篩選P值<0.01，頻次在10次或10次以上的條目，認為這些通路在復(fù)方丹參滴丸治療AMI的過程中起到重要作用，以此來獲得顯著性較高的分析結(jié)果。

1.5 “化合物有效成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape 3.8.0軟件對復(fù)方丹參滴丸化合物有效成分、核心靶點與通路之間的關(guān)系進行可視化處理，構(gòu)建“化合物有效成分-靶點-通路”的網(wǎng)絡(luò)藥理圖，以便于后續(xù)的分析研究。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方丹參滴丸化合物、活性成分及潛在靶點的收集與篩選 通過TCMSP篩選獲得符合條件的丹參的化合物40個，三七的化合物7個，冰片的化合物3個。獲得靶點1 965個，篩除重復(fù)后共獲得靶點445個。將復(fù)方丹參滴丸中的50個化學(xué)成分以藥物名稱拼音加代號的方式代替，以便后續(xù)構(gòu)圖。對應(yīng)列表如表1所示。

表1 復(fù)方丹參滴丸化合物成分匯總表

續(xù)表1-1

2.2 AMI靶點的篩選 通過DrugBank數(shù)據(jù)庫共檢索到疾病靶點數(shù)量為34個，DisGENET數(shù)據(jù)庫共檢索到疾病靶點數(shù)量為766個，以基因和疾病的相關(guān)性（Score_gda）的平均值為篩選標準，選擇數(shù)值在0.0213以上的靶點共151個，兩個數(shù)據(jù)庫共獲得靶點185個，篩除重復(fù)靶點后最終獲得靶點數(shù)量159個。

2.3 復(fù)方丹參滴丸治療AMI的核心靶點篩選 將藥物靶點與疾病靶點映射后獲得治療靶點61個，通過“1.3項”的方法，獲得靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)如圖1，運用Cytoscape3.8.0構(gòu)建“藥物成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。通過拓撲分析篩選出自由度大于平均值8.018的靶點24個，認為這些靶點為核心靶點，結(jié)果如表2所示，并構(gòu)建“有效成分-疾病靶點”核心網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3所示。在網(wǎng)絡(luò)中，某個節(jié)點的自由度代表在本網(wǎng)絡(luò)中該節(jié)點與其他節(jié)點相互作用的數(shù)目，若自由度的值越大，則證明該節(jié)點的重要性越高，其中羧酸酯酶1（CES1）的自由度為23，是本網(wǎng)絡(luò)中度值最大的靶點，因此復(fù)方丹參滴丸治療AMI的過程中，該靶點起到關(guān)鍵作用。

表2 核心靶點

圖1 復(fù)方丹參滴丸治療AMI靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖2 “復(fù)方丹參滴丸-有效成分-疾病名稱-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 “有效成分-疾病靶點”核心網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO富集分析與KEGG通路富集分析結(jié)果 復(fù)方丹參滴丸治療AMI的GO富集分析如圖4～圖5所示。由圖可知，這些核心靶點可以通過細胞的生物過程，細胞的代謝過程，細胞對刺激的反應(yīng)等方面影響生物過程；通過離子結(jié)合、催化活性、分子功能調(diào)節(jié)劑等方面影響分子功能；通過細胞器、細胞膜、細胞膜部件、細胞外區(qū)等方面影響細胞組成。以P值<0.01，頻次在10次或10次以上的條目為篩選條件，共篩選出復(fù)方丹參滴丸治療AMI的KEGG通路富集分析25條，結(jié)果如表3所示。從表3可知，復(fù)方丹參滴丸治療AMI可能與多種通路相關(guān)，可能通過調(diào)節(jié)癌癥的途徑、HIF-1信號通路、TNF信號通路等相關(guān)。利用Cytoscape對藥物有效成分、核心靶點與通路之間的關(guān)系進行可視化處理，構(gòu)建“化合物有效成分-靶點-通路”的網(wǎng)絡(luò)藥理圖，如圖5所示。在各通路中癌癥通路自由度最大為21，該通路可能是復(fù)方丹參滴丸治療AMI的關(guān)鍵通路。

表3 復(fù)方丹參滴丸治療AMI的KEGG通路富集分析

圖4 復(fù)方丹參滴丸治療AMI的GO富集分析柱狀圖

圖5 復(fù)方丹參滴丸治療AMI的GO富集分析氣泡圖

3 討 論

本次研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸通過丹參酮、積雪草酸、槲皮素等50種化合物共同作用于MAPK8、CASP3、CES1等24個核心靶點，并通過調(diào)節(jié)癌癥的途徑、HIF-1信號通路、TNF信號通路等發(fā)揮治療AMI的作用。

丹參作用于AMI的有效化合物成分主要是酮類，丹參酮ⅡA具有降低AMI后心律失常的發(fā)生率、擴張血管的作用，從而降低心梗死亡率。單宏麗等［8］發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA通過MAPK信號通路和SRF信號通路抑制miR-1從而改善心肌離子通道失衡，保護心肌。三七主要通過槲皮素等化合物，發(fā)揮著抗炎和抗動脈粥樣硬化的作用。唐玉等［9］發(fā)現(xiàn)槲皮素通過抑制細胞間黏附分子表達，保護AMI患者的心肌。積雪草酸為冰片治療AMI的主要化合物。史艷霞等［10］發(fā)現(xiàn)積雪草酸通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1以及NF-κB來改善AMI大鼠的心肌損傷；榮霞等［11］發(fā)現(xiàn)積雪草酸抑制SIRT3/β-catenin/PPARγ信號通路可以對AMI大鼠的心肌組織起到一定的保護作用。MAPK8基因是MAP激酶家族中的一員。MAP激酶參與多種細胞過程如增殖、分化和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。該激酶激活多種細胞刺激和目標特定的轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)即早期基因表達對細胞刺激的反應(yīng)。有研究表明，MAP激酶對于T細胞的增殖、凋亡和分化發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CASP3（半胱天冬酶3）在細胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用，而細胞凋亡的失敗是癌癥的重要標志之一［12］。CES1是CES（羧酸酯酶）家族中的一員，CES屬于藥物代謝酶的第一階段，該家族可以水解各種藥物酯、酰胺、氨基甲酸酯和類似結(jié)構(gòu)［13］。有學(xué)者［14］發(fā)現(xiàn)，一些功能CES1基因變異的（例如G143E）可能損害血管緊張素的激活，從而影響血管緊張素高活性化合物的治療結(jié)果。

圖6 化合物有效成分-靶點-通路

癌癥通路涉及血管生成、細胞增殖等過程。癌癥主要是由基因改變引起的，因為基因改變導(dǎo)致維持細胞動態(tài)平衡的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)紊亂。多數(shù)癌癥是由各種環(huán)境因素造成的體細胞突變和生殖細胞突變共同作用引起的。然而，多數(shù)突變位于基因組位置上缺乏蛋白編碼能力的區(qū)域，其中包括以RNA分子發(fā)揮功能的基因區(qū)［15］。HIF-1信號通路在多種心血管疾病、炎癥等過程中發(fā)揮重要作用。HIF-1蛋白是缺氧狀態(tài)下調(diào)控血管新生的重要分子［16-17］，HIF-1作為內(nèi)源性保護分子在缺血缺氧性腦血管疾病、急性心肌梗死等疾病中對神經(jīng)細胞的存活和心肌細胞的再生具有重要意義。萬俊等［18］發(fā)現(xiàn)HIF-1α反義寡核苷酸對BMMSCs治療AMI具有抑制作用，BMMSCs對大鼠AMI的部分治療作用可能是通過HIF-1α介導(dǎo)的。TNF家族目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)30多種細胞因子，研究表明TNF具有殺傷和抑制腫瘤細胞、提高中心粒細胞的吞噬抗感染等生物學(xué)活性，因此，TNF不僅是一種可引起腫瘤壞死的循環(huán)因子，同時也可被確定為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子。血管內(nèi)皮細胞對TNF因子的反應(yīng)是經(jīng)歷一系列促炎性改變，增加白細胞黏附、跨內(nèi)皮遷移和血管滲漏，促進血栓形成［19］。

綜上所述，本次研究充分證明復(fù)方丹參滴丸可以通過多個藥物化合物成分作用于多個AMI靶點，再對有效靶點進行通路分析后發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸通過癌癥的途徑、HIF-1信號通路、TNF信號通路等多條通路對AMI進行治療和調(diào)控?，F(xiàn)階段對于復(fù)方丹參滴丸治療AMI的通路研究并不全面，而有些相關(guān)通路如：癌癥的途徑、TNF信號通路等并未被提及或研究。此次研究不僅佐證了前期對復(fù)方丹參滴丸治療AMI的研究結(jié)論，同時研究出新的治療AMI的靶點方向與相關(guān)通路，為后續(xù)的研究提供新的思路和方向。