強(qiáng)孟丹,吳劍榮,孫漢石,巫志遠(yuǎn),詹曉北

(1. 江南大學(xué) 糖化學(xué)與糖生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;2. 無錫小天鵝電器有限公司,江蘇無錫 214100)

有害微生物在自然環(huán)境中分布廣泛,許多針對(duì)家用電器微生物污染的研究證實(shí)了這些污染狀況會(huì)對(duì)人體健康造成一定危害[1-2]。其中我們?nèi)粘Ｊ褂妙l繁的洗衣機(jī)已被證明是微生物理想的棲息地[3],微生物和營養(yǎng)物質(zhì)通過水或臟衣服被引入洗衣機(jī)[4],潮濕的環(huán)境和營養(yǎng)供應(yīng)為洗衣機(jī)中的微生物提供了完美的生存條件?，F(xiàn)存的洗衣機(jī)抗菌、除菌技術(shù)都存在一定不足[5],因此如何安全、高效的抑制、殺滅這些微生物成為待解決的一大問題。

抗菌材料是指自身能抑制或殺滅微生物的一類功能材料[6]。目前普遍將抗菌劑分為無機(jī)、有機(jī)、天然抗菌劑[7]。最常用的天然抗菌劑有甲殼素、殼聚糖、膽礬等[8]。其中殼聚糖是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物,在自然界中來源廣泛。由于其無細(xì)胞毒性、生物可降解、具有廣譜抗菌等特性,在復(fù)合抗菌材料方面中得到了廣泛的應(yīng)用[9-10]。殼聚糖分子鏈上的功能基團(tuán)使其在一定條件下對(duì)金屬離子有螯合作用[11],在殼聚糖中添加金屬極大地提高了其抗菌活性,并在許多領(lǐng)域展現(xiàn)出優(yōu)異的效果。Malini等通過澆鑄法制備了納米氧化鋅殼聚糖復(fù)合膜,與殼聚糖相比此復(fù)合膜表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗菌活性[12]。Liang等發(fā)現(xiàn)通過控制殼聚糖/銀納米顆粒復(fù)合微球(CAgMs)尺寸可對(duì)其抗菌性能起到影響作用[13]。進(jìn)一步的,許多此類的研究均證實(shí)了殼聚糖金屬復(fù)合材料在抗菌領(lǐng)域有極好的效果[14-15]。

本研究選用天然抗菌材料殼聚糖,將其與無機(jī)抗菌劑Ag結(jié)合制備納米銀—?dú)ぞ厶?AgNPs-CTS)復(fù)合溶膠,并對(duì)復(fù)合溶膠的制備溫度進(jìn)行探究。通過紫外光譜、粒徑對(duì)AgNPs的大小、均一程度進(jìn)行測(cè)定,通過透射電鏡對(duì)溶膠中的Ag顆粒的形態(tài)進(jìn)行觀測(cè)。進(jìn)一步的將復(fù)合溶膠與含Cu的殼聚糖溶液混合,制備成AgNPs/Cu-CTS復(fù)合顆粒。對(duì)復(fù)合顆粒的機(jī)械強(qiáng)度、抑菌性能進(jìn)行測(cè)定,并利用掃描電鏡觀測(cè)其表面與截面形態(tài)。將制備好的顆粒應(yīng)用在洗衣機(jī)抗菌程序中,檢測(cè)其在機(jī)洗過程中的抑菌效果、損耗程度。旨在制備一種天然無污染的應(yīng)用于機(jī)洗過程的抗菌材料。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

殼聚糖(脫乙酰度80-95%)、硝酸銀、乙酸銅、硼氫化鈉、冰醋酸、鄰苯二甲酸二丁酯、戊二醛(25%水溶液)、氫氧化鈉、無水乙醇等,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。標(biāo)準(zhǔn)洗滌物,按照標(biāo)準(zhǔn)GB/T411要求中的漂白中平布。大腸桿菌(E.coli)ATCC-25922、金黃色葡萄球菌(S.aureus)ATCC-6538,上海保藏生物技術(shù)中心。

TB80V80WDCLG全自動(dòng)洗衣機(jī),無錫小天鵝電器有限公司;PXY-DHS-35X40隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;GI80DWS立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器,致微(廈門)儀器有限公司;KQ-2型顆粒強(qiáng)度測(cè)定儀,南京科環(huán)分析儀器有限公司;SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;U-3900紫外可見分光光度計(jì),日本日立株式會(huì)社;ZEN3700納米粒度及Zate電位分析儀,英國馬爾文儀器有限公司;Quanta 200掃描電子顯微鏡,荷蘭Fei公司;H-7650透射電鏡,日本日立株式會(huì)社。

1.2 AgNPs-CTS復(fù)合溶膠與AgNPs/Cu-CTS復(fù)合顆粒的制備

AgNPs-CTS復(fù)合溶膠的制備參考文獻(xiàn)[16]中的方法進(jìn)行改進(jìn),稱取一定質(zhì)量的殼聚糖,并將之溶于體積分?jǐn)?shù)為2%的醋酸水溶液,配置質(zhì)量濃度為4%的CTS的醋酸水溶液,置于磁力攪拌器攪拌至殼聚糖完全溶解。量取40 mL上述配制的CTS的醋酸溶液,加入1 mL一定濃度的AgNO3水溶液,攪拌30 min使Ag+與CTS充分交聯(lián),然后加入硼氫化鈉溶液作為還原劑[反應(yīng)體系中n(AgNO3)∶ n(還原劑)=1∶ 1.5,確保還原反應(yīng)進(jìn)行完全],在60℃加熱攪拌,反應(yīng)至溶液顏色不再加深,自然冷卻至室溫,得到AgNPs-CTS復(fù)合溶膠。

AgNPs/Cu-CTS復(fù)合顆粒的制備參考文獻(xiàn)[17-18]中的方法進(jìn)行改進(jìn),將7.2 g殼聚糖與0.4 g乙酸銅溶于60 mL 4%乙酸中,然后加入40 mL AgNPs-CTS復(fù)合抗菌溶膠,攪拌均勻。加入2.5 mL鄰苯二甲酸二丁酯,攪拌5 min,然后加入10 mL 0.25%的戊二醛溶液,繼續(xù)攪拌10 min。溶液形成凝膠狀,取合適大小凝膠揉成顆粒狀,置于2 wt%的氫氧化鈉溶液中浸泡3 h,用蒸餾水洗滌后,再放入50%乙醇溶液中密封浸泡2 h后,用蒸餾水洗滌至中性取出。置于烘箱干燥后得到殼聚糖多孔顆粒。

1.3 AgNPs-CTS復(fù)合溶膠的表征

1.3.1 AgNPs-CTS復(fù)合溶膠的紫外吸收光譜

采用U-3900紫外可見分光光度計(jì)對(duì)AgNPs-CTS復(fù)合溶膠進(jìn)行紫外吸收光譜測(cè)定,表征不同制備條件下所得到的AgNPs的共振吸收峰。測(cè)試前,將待測(cè)樣品稀釋相同倍數(shù)并超聲分散5 min。取一定量分散后的溶液,置于石英樣品池中,待測(cè)。

1.3.2 AgNPs-CTS復(fù)合溶膠的粒徑

采用ZEN3700納米粒度及Zeta電位分析儀對(duì)AgNPs-CTS復(fù)合溶膠的粒徑進(jìn)行測(cè)定,表征不同制備條件下所得到的AgNPs的水合粒徑。測(cè)試前,將待測(cè)樣品稀釋相同倍數(shù)并超聲分散5 min。取1 mL分散后的溶液,置于樣品池中,待測(cè)。

1.3.4 AgNPs-CTS復(fù)合溶膠的抑菌性能

采用牛津杯[19-20]法進(jìn)行抑菌圈測(cè)定。將滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基液倒入培養(yǎng)皿中,待其凝固后移取0.2 mL稀釋度為10-3的菌液涂布均勻。用鑷子將滅過菌的牛津杯放入培養(yǎng)皿中,每個(gè)平皿中均勻地放置2只牛津杯。吸取0.2 mL AgNPs-CTS復(fù)合溶膠至牛津杯中。將培養(yǎng)皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后測(cè)定抑菌圈直徑,設(shè)置無菌水作為對(duì)照。

1.4 AgNPs/Cu-CTS復(fù)合顆粒的表征

1.4.1 AgNPs/Cu-CTS復(fù)合顆粒機(jī)械強(qiáng)度

取一定質(zhì)量制備好的抑菌顆粒置于鼓風(fēng)干燥箱中于60℃下干燥,失水至恒重。利用顆粒強(qiáng)度測(cè)定儀測(cè)定不同組顆粒的破碎強(qiáng)度,樣品測(cè)定5次取平均值。

1.4.2 AgNPs/Cu-CTS復(fù)合顆粒平板抑菌

選取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為代表菌種。將滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基液倒入培養(yǎng)皿中,迅速放入制備好的殼聚糖抑菌顆粒,待其凝固后移取2 mL稀釋度為10-3的菌液涂布均勻。將培養(yǎng)皿于生化培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)12 h,記錄抑菌圈大小。

1.5 AgNPs/Cu-CTS復(fù)合顆粒的機(jī)洗應(yīng)用

1.5.1 抑菌性能損耗

將抑菌顆粒在標(biāo)準(zhǔn)程序下進(jìn)行洗滌,每洗滌20次后取樣,依據(jù)1.3.2方法進(jìn)行平板抑菌實(shí)驗(yàn),測(cè)定抑菌圈大小。以抑菌圈的大小衡量復(fù)合抗菌材料抑菌性能損耗。

1.5.2 抑菌效果檢測(cè)

依據(jù)GB 21551.5-2010[21]附錄AA《帶有除菌功能電動(dòng)洗衣機(jī)除菌試驗(yàn)方法》方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上,獲得的值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(ˉX±SD)。使用軟件SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析,基于Duncan的多重比較檢驗(yàn),確定值之間的差異,不同字母標(biāo)注表示具有顯著差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 AgNPs-CTS復(fù)合溶膠的制備和表征

首先考察了制備條件對(duì)AgNPs-CTS復(fù)合溶膠的影響,并對(duì)其微觀形態(tài)進(jìn)行了表征,結(jié)果如圖1所示。從紫外—可見光譜分析可以看出,所有溫度下制備的樣品均在400 nm～450 nm之間出現(xiàn)吸收峰。根據(jù)之前的研究可知?dú)ぞ厶峭ㄟ^氨基和羥基與銀離子相互作用,AgNPs在410 nm左右處出現(xiàn)特征吸收峰[22-23]。隨著溫度的升高AgNPs的特征吸收峰逐漸增強(qiáng),峰形逐漸變寬,說明所生成的AgNPs顆粒濃度增大并且粒徑分布趨向不均勻。升高溫度可能會(huì)提高還原反應(yīng)的速度,增加反應(yīng)體系中AgNPs的成核率,導(dǎo)致AgNPs的成核速率大于AgNPs晶核的生長速率,從而形成更多的納米Ag顆粒。同時(shí),反應(yīng)體系中存在有大量水溶劑,水在高溫時(shí)易揮發(fā),使得反應(yīng)體系中的AgNO3濃度增加,從而導(dǎo)致制備的AgNPs粒徑較大、分布較寬。因而,本實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)溫度選擇在60℃為制備復(fù)合抗菌劑的最佳反應(yīng)溫度。

圖1 AgNPs-CTS復(fù)合溶膠的表征

測(cè)定不同反應(yīng)溫度下制備的AgNPs-CTS復(fù)合溶膠的粒徑和PDI,如圖1所示。粒徑即為顆粒的大小,在本研究中來反映納米Ag顆粒大小。PDI是多分散性指數(shù),用于描述聚合物分子量分布,在本研究中用來反映納米Ag顆粒的粒度分布情況?？梢钥闯?隨著反應(yīng)溫度的提升,樣品粒徑呈現(xiàn)出先減小后增大的趨勢(shì)。在反應(yīng)溫度為60℃時(shí)樣品的粒徑最小,且PDI值也最低。這表明納米Ag顆粒在此條件下尺寸最小,且分布更為均一。因此60℃為制備AgNPs-CTS復(fù)合溶膠的最優(yōu)溫度,這與紫外—可見光譜的結(jié)果一致。對(duì)AgNPs-CTS復(fù)合溶膠的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。進(jìn)一步對(duì)納米Ag顆粒進(jìn)行TEM分析,發(fā)現(xiàn)制得的納米Ag顆粒均呈近球形,粒徑約為20 nm左右,大小相對(duì)均勻,并未發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象,這與之前的研究[24]結(jié)果一致。

采用平板培養(yǎng)法測(cè)定AgNPs-CTS復(fù)合溶膠對(duì)大腸桿菌和金黃素葡萄球菌的抑菌效果,以抑菌圈大小作為衡量指標(biāo),其中左側(cè)為空白對(duì)照,右側(cè)為復(fù)合溶膠。如圖2所示,復(fù)合溶膠對(duì)兩種菌都起到了明顯的抑制作用,其中大腸桿菌的抑菌圈大小約為2.3 cm,金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小約為2.5 cm,而空白對(duì)照則并未有明顯抑菌圈出現(xiàn)。

圖2 AgNPs-CTS復(fù)合溶膠的抑菌圈

2.2 AgNPs/Cu-CTS復(fù)合顆粒的制備和表征

抑菌材料在機(jī)洗過程中需要承受水流的沖擊和機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)產(chǎn)生的摩擦,因此不能直接以溶膠狀進(jìn)行應(yīng)用。本研究進(jìn)一步以上述制備的AgNPs-CTS復(fù)合溶膠為基礎(chǔ),制備了AgNPs/Cu-CTS復(fù)合顆粒。利用顆粒強(qiáng)度測(cè)定儀對(duì)制備好的抑菌顆粒進(jìn)行檢測(cè),測(cè)定其機(jī)械強(qiáng)度為554.1±17.9 N,達(dá)到相關(guān)強(qiáng)度要求。進(jìn)一步對(duì)AgNPs/Cu-CTS復(fù)合顆粒的表面和截面進(jìn)行了掃描電鏡分析,結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯?復(fù)合顆粒的內(nèi)部和表面均呈現(xiàn)出孔狀結(jié)構(gòu),這可能與致孔劑鄰苯二甲酸二丁酯的加入有關(guān)。此外,本研究中復(fù)合顆粒的多孔結(jié)構(gòu)可為被吸附物Ag、Cu提供更多的吸附位點(diǎn)。同時(shí),較高總表面積和多孔結(jié)構(gòu)可能更有利于復(fù)合顆粒對(duì)細(xì)菌的殺滅。

圖3 AgNPs/Cu-CTS復(fù)合顆粒的SEM圖

采用平板培養(yǎng)法測(cè)定AgNPs/Cu-CTS復(fù)合顆粒對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果,以抑菌圈大小作為衡量指標(biāo)。如圖4所示,復(fù)合顆粒對(duì)兩種菌都起到了明顯的抑制作用,其中大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑菌圈半徑均為0.5 cm。與復(fù)合溶膠相比顆粒材料抑菌圈大小有所減弱,但顆粒形態(tài)的復(fù)合材料能更好的應(yīng)用在機(jī)洗程序中,且能更好的保持長效抑菌的效果。

圖4 AgNPs/Cu-CTS復(fù)合顆粒的抑菌圈

2.3 AgNPs/Cu-CTS復(fù)合顆粒的機(jī)洗應(yīng)用損耗測(cè)試

抑菌顆粒長期置于洗衣機(jī)內(nèi)部使用,其壽命參數(shù)也十分關(guān)鍵。損耗測(cè)試結(jié)果如表1所示,隨著洗滌次數(shù)的增多,抑菌顆粒在平板上的抑菌圈大小有所減弱,但其減弱并不明顯。未經(jīng)洗滌的抑菌材料其抑菌圈大小在0.50 cm,當(dāng)進(jìn)行50次時(shí)后抑菌圈大小仍有0.40 cm。殼聚糖能夠通過離子交換、螯合等機(jī)制吸附金屬離子[25],金屬離子與殼聚糖通過氨基和羥基發(fā)生相互作用。這可能對(duì)抑菌顆粒在長期洗滌損耗的抑菌效果中起到了正向作用。

表1 抑菌顆粒機(jī)洗損耗

對(duì)復(fù)合顆粒機(jī)洗的抑菌效果進(jìn)行了測(cè)試,結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明,抑菌顆粒對(duì)菌布上的細(xì)菌有著較強(qiáng)的殺滅作用,且洗滌條件改變后抑菌效果達(dá)到了99.15%。這可能是因?yàn)锳gNps、Cu+和CTS在洗滌環(huán)境中對(duì)菌體的作用使得很大一部分細(xì)菌被殺滅,同時(shí)改變后的環(huán)境更不利于菌體的存在。本復(fù)合材料在應(yīng)用中具有較優(yōu)的效果。

表2 復(fù)合顆粒機(jī)洗抑菌率

3 結(jié)論

本研究制備了AgNPs-CTS復(fù)合溶膠,對(duì)溶膠性能進(jìn)行了表征,證明復(fù)合溶膠具有良好的抗菌性能。進(jìn)一步的制備得到了AgNPs/Cu-CTS復(fù)合顆粒,對(duì)其形態(tài)、抑菌效果和在機(jī)洗中的應(yīng)用進(jìn)行了研究。AgNPs/Cu-CTS復(fù)合顆粒是一種具有多孔結(jié)構(gòu)和長效抑菌性的復(fù)合抗菌材料。此材料在機(jī)洗過程中取得了較好的抑菌效果。