王曉慧 - 姚茂君 - 陳怡君 - 朱露怡 - 黃湘宇 -

(1. 吉首大學(xué)林產(chǎn)化工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界 427000；2. 吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南 吉首 416000)

莓茶，又名藤茶、龍須茶、白茶等，為葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄[Ampelopsisgrossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wamg]的莖葉。其富含多糖、多酚和黃酮等多種活性成分[1]，具有清熱解毒、利濕消腫、平肝降壓等作用[2]。

植物多糖一般分布于細(xì)胞壁(或細(xì)胞)內(nèi)，傳統(tǒng)的提取技術(shù)主要集中于熱水提取[3]、超聲波輔助提取[4]、微波輔助提取[5]、酶法提取[6]、超臨界萃取[7]等。其中，熱水提取所需溫度高且效率低，高溫通常容易導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；單純的超聲輔助提取能有效提高提取效率，但提取時(shí)間長易造成多糖降解[8]；酶法提取雖兼具反應(yīng)條件溫和、得率高、節(jié)約時(shí)間等特點(diǎn)，且能較好地保留多糖生理活性[9]，但是酶的價(jià)格昂貴，單純采用酶法進(jìn)行提取成本較高。采用超聲波輔助復(fù)合酶提取多糖不但可以提高提取效率還可以節(jié)約成本，提高得率，該方法已被應(yīng)用于甘草酸[10]、大蒜多糖[11]和金錢草多糖[12]的提取，但尚未見采用超聲輔助復(fù)合酶對(duì)莓茶多糖進(jìn)行提取的報(bào)道。

研究擬以莓茶為原料，采用超聲波輔助復(fù)合酶法提取莓茶多糖，通過單因素試驗(yàn)研究各因素對(duì)提取莓茶多糖的影響，利用Plackett-Bueman(PB)試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化莓茶多糖的提取工藝條件，以期為莓茶多糖的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

莓茶：產(chǎn)地湖南省永順縣，干燥粉碎成粉末后，過60目篩備用；

纖維素酶、果膠酶：≥15 000 U/g，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

葡萄糖、無水乙醇、濃硫酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、苯酚、石油醚(60～90 ℃)：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

鼓風(fēng)干燥箱：GZX-9246MBE型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

紫外可見—分光光度計(jì)：UV-2450型，日本島津公司；

多用途恒溫超聲波提取機(jī)：TF-650CT型，上海拓紛機(jī)械設(shè)備有限公司；

電子天平：FA224型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)處理 取干燥的莓茶用超微粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過60目篩于50 ℃干燥至恒重。依次用石油醚、95%的乙醇進(jìn)行洗滌，以去除色素及小分子雜質(zhì)。再于50 ℃烘箱中干燥至恒重，過60目篩后，于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 莓茶多糖的提取 稱取2.0 g莓茶粉，以檸檬酸和檸檬酸鈉緩沖液為提取溶劑，先進(jìn)行超聲波處理再進(jìn)行酶解(經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，確定酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為2 h，m果膠酶∶m纖維素酶為1∶1)，依據(jù)試驗(yàn)所需提取條件設(shè)定相應(yīng)的超聲波和酶解參數(shù)進(jìn)行提取。提取結(jié)束后，于5 000 r/min 離心15 min，取上清液進(jìn)行抽濾。濃縮至原體積的1/5，加入無水乙醇至乙醇量為80%，4 ℃下靜置8 h，于5 000 r/min離心10 min，取其沉淀復(fù)溶，于50 ℃烘箱中揮發(fā)掉乙醇后于1 000 mL容量瓶中定容，測定莓茶多糖含量并計(jì)算其得率。

1.2.3 莓茶多糖含量的測定及其得率計(jì)算 采用硫酸—苯酚法測量莓茶提取液中多糖的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確稱取葡萄糖20 mg，用蒸餾水溶解后定容于200 mL容量瓶中，配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液，再將其稀釋成0.01，0.02，0.04，0.06，0.08 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，取上述6個(gè)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL于試管中，分別加入1 mL 5%的苯酚溶液，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，5 min后置于25 ℃的水浴鍋中靜置20 min 后于OD490 nm處測定其吸光度值，以蒸餾水為空白組，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)。計(jì)算回歸方程為A=0.009 47C-0.005 71，R2=0.998。用移液槍移取1.0 mL定容后的莓茶多糖液樣品，測定吸光度A，用蒸餾水作為空白對(duì)照組，平行測定3次。多糖得率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

Y——多糖得率，%；

C——待測樣品液中莓茶多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——待測樣品液體積，mL；

n——樣品濃度稀釋倍數(shù)；

m——莓茶多糖粉質(zhì)量，g。

1.2.4 超聲輔助復(fù)合酶提取單因素試驗(yàn)

(1) 超聲波時(shí)間對(duì)莓茶多糖得率的影響：取2.0 g莓茶粉，溶解于pH為5.0的緩沖液中進(jìn)行超聲處理，超聲波功率為104 W，超聲波溫度為50 ℃，添加復(fù)合酶質(zhì)量1.00%，超聲波時(shí)間分別設(shè)置為20，30，40，50，60 min進(jìn)行提取。

(2) 超聲波溫度對(duì)莓茶多糖得率的影響：取2.0 g莓茶粉，溶解于pH為5.0的緩沖液中進(jìn)行超聲處理，超聲波功率為104 W，超聲波時(shí)間為40 min，添加復(fù)合酶1.00%。超聲波溫度分別設(shè)置為30，40，50，60，70 ℃進(jìn)行提取。

(3) 酶解pH對(duì)莓茶多糖得率的影響：取2.0 g莓茶粉，溶解于pH分別為2，3，4，5，6的緩沖液中進(jìn)行超聲處理，超聲波溫度為50 ℃，添加復(fù)合酶1.00%，超聲波時(shí)間為40 min，超聲波功率為104 W進(jìn)行提取。

(4) 超聲波功率對(duì)莓茶多糖得率的影響：取2.0 g莓茶粉，溶解于pH為5.0的緩沖液中進(jìn)行超聲處理，超聲波溫度為50 ℃，添加復(fù)合酶1.00%，超聲波時(shí)間為40 min，超聲波功率分別設(shè)置為78，91，104，117，130 W(超聲波提取機(jī)總功率為650 W，78，91，104，117，130 W分別對(duì)應(yīng)其12%，14%，16%，18%，20%的輸出功率)進(jìn)行提取。

(5) 復(fù)合酶添加量對(duì)莓茶多糖得率的影響：取2.0 g莓茶粉，溶解于pH為5.0的緩沖液中進(jìn)行超聲處理，超聲波溫度為50 ℃，超聲波時(shí)間為40 min，超聲波功率104 W，復(fù)合酶添加量0.10%，0.50%，1.00%，1.50%，1.90% 進(jìn)行提取。

1.2.5 Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman試驗(yàn)，每個(gè)因素選取高(+1)、低(-1)2個(gè)水平，考察超聲波溫度、酶解pH、超聲波時(shí)間、復(fù)合酶添加量、超聲波功率5個(gè)因素對(duì)莓茶多糖提取得率的影響，篩選出影響顯著的關(guān)鍵因素，得到一次擬合方程，進(jìn)行爬坡方向和步長設(shè)計(jì)來確定各重要因素最佳中心點(diǎn)。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)1.2.5的試驗(yàn)結(jié)果得出的顯著性關(guān)鍵因素進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)回歸模型，最后繪制等高線圖和響應(yīng)面圖。

1.2.7 不同方法提取效果的比較

(1) 熱水提?。簠⒄?.2.2的方法在80 ℃的恒溫水浴鍋中進(jìn)行提取，時(shí)間為2.5 h，不做超聲提取和酶處理。

(2) 超聲波提?。簠⒄?.2.2的方法，超聲提取后于水浴鍋中放置2 h，不做復(fù)合酶處理。

(3) 復(fù)合酶提取：參照1.2.2的方法，在50 ℃恒溫水浴鍋中放置30 min后，酶解2 h，不做超聲提取。

(4) 超聲復(fù)合酶提?。簠⒄?.2.2的方法，選取響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到的最佳條件進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有結(jié)果均以3次試驗(yàn)的平均值表示，數(shù)據(jù)分析用Design-Expert 8.0.6、Origin 9.0、Excel 2003軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲波時(shí)間對(duì)莓茶多糖得率的影響 由圖1可知，隨著超聲波時(shí)間延長，莓茶多糖得率隨之上升，超聲時(shí)間的延長能使莓茶與溶劑充分混合，超聲波處理40 min 時(shí)莓茶多糖得率達(dá)到(5.94±0.06)%，之后莓茶多糖得率開始下降，可能是由于超聲波處理時(shí)間過長導(dǎo)致莓茶多糖分子結(jié)構(gòu)被破壞，得率下降[13]。

2.1.2 超聲波溫度對(duì)莓茶多糖得率的影響 由圖2可知，隨著超聲波溫度的上升多糖得率上升，當(dāng)超聲波溫度為50 ℃時(shí)莓茶多糖得率達(dá)到(5.94±0.06)%，之后莓茶多糖得率開始下降，可能與超聲波的空化效應(yīng)和細(xì)胞壁的擴(kuò)散作用有關(guān)。隨著超聲波溫度的升高，表面張力和黏度降低，液體的蒸汽壓力增加，溶質(zhì)形成空化氣泡，當(dāng)超聲波功率較低時(shí)，產(chǎn)生空化效應(yīng)來加速細(xì)胞的破裂，隨著溫度的升高，空化形成的氣泡的表面張力降低，蒸汽壓強(qiáng)增加，細(xì)胞不易破壞，因此莓茶多糖得率開始下降[14]。

圖1 超聲波時(shí)間對(duì)莓茶多糖得率的影響

圖2 超聲波溫度對(duì)莓茶多糖得率的影響

2.1.3 酶解pH對(duì)莓茶多糖得率的影響 由圖3可知，隨著酶解pH的增大莓茶多糖得率上升，當(dāng)酶解pH為4時(shí)莓茶多糖得率達(dá)最大值(6.37±0.14)%，隨后多糖得率開始下降。這可能是pH值會(huì)影響酶活性中心上必需基團(tuán)的解離程度，從而影響酶分子與底物的結(jié)合與催化，最適的pH能夠?qū)⒚阜肿优c底物充分結(jié)合，進(jìn)而使酶解反應(yīng)達(dá)到最大[15]。

2.1.4 超聲波功率對(duì)莓茶多糖得率的影響 由圖4可知，莓茶多糖得率隨著超聲波功率的增大，先增加后下降，超聲波功率為104 W時(shí)達(dá)到最大值(6.56±0.11)%，主要原因是對(duì)莓茶進(jìn)行超聲處理時(shí)，會(huì)產(chǎn)生空洞效應(yīng)和振動(dòng)作用，一開始植物細(xì)胞壁破碎，加快了莓茶多糖的溶出，但隨著功率的增大，超聲波空化效應(yīng)增強(qiáng)并產(chǎn)生氣泡，氣泡中生成的自由基與莓茶多糖發(fā)生反應(yīng)，使莓茶多糖被降解，得率下降[16]。

圖3 酶解pH對(duì)莓茶多糖得率的影響

圖4 超聲波功率對(duì)莓茶多糖得率的影響

2.1.5 復(fù)合酶添加量對(duì)莓茶多糖得率的影響 由圖5可知，隨著復(fù)合酶添加量增加，莓茶多糖得率先增加，當(dāng)復(fù)合酶添加量達(dá)到1.0%時(shí)莓茶多糖得率達(dá)到最大值(7.09±0.16)%，之后隨著復(fù)合酶的添加，莓茶多糖得率開始下降。這可能是由于復(fù)合酶的增加加大了與底物接觸的機(jī)會(huì)，釋放出更多的多糖，當(dāng)復(fù)合酶繼續(xù)增加，兩種酶之間出現(xiàn)競爭，抑制了酶的催化作用，導(dǎo)致莓茶多糖得率下降。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察超聲波時(shí)間、超聲波溫度、酶解pH、超聲波功率、復(fù)合酶添加量5個(gè)因素對(duì)莓茶多糖得率的影響，以這5個(gè)因素進(jìn)行顯著因素篩選，見表1。

各因素的效應(yīng)評(píng)價(jià)及Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果見表2、表3。

根據(jù)表2得到影響莓茶多糖得率的一次回歸方程：

Y=4.88-0.046A1+0.062A2+0.36A3-0.20A4+0.19A5。

(2)

圖5 復(fù)合酶添加量對(duì)莓茶多糖得率的影響

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素及水平取值

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)確定最佳中心點(diǎn)

根據(jù)超聲波功率、復(fù)合酶添加量和酶解pH的系數(shù)設(shè)計(jì)爬坡方向和步長，其中超聲波功率、復(fù)合酶添加量為正效應(yīng)，取其高水平；酶解pH為負(fù)效應(yīng)，取其低水平。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析?

由表4可知，在第3組處莓茶多糖得率達(dá)到最高，即第3組附近存在最優(yōu)點(diǎn)，因此以酶解pH為4、超聲波功率為104 W、復(fù)合酶添加量為1%為響應(yīng)面的試驗(yàn)中心點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化分析

以酶解pH、超聲波功率、復(fù)合酶添加量為自變量，莓茶多糖得率為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化，莓茶多糖提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及結(jié)果分別見表5、表6。

通過多元回歸方程擬合和方差分析得到方程：

(3)

表4 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

表5 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表6 回歸模型方差分析及結(jié)果?

圖6 兩因素間交互作用響應(yīng)面圖Figure 6 Response surface plots of interaction between two factors

圖6(a)和圖6(b)顯示復(fù)合酶添加量為0水平時(shí)，隨著酶解pH值從3增加到5，超聲波功率從91 W增加到117 W，莓茶多糖得率先上升后下降。圖6(c)和圖6(d)顯示超聲波功率為0水平時(shí)，莓茶多糖隨酶解pH和復(fù)合酶添加量的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)。圖6(e)和圖6(f) 顯示莓茶多糖含量隨復(fù)合酶添加量和超聲波功率的增加也呈先增加后降低的趨勢(shì)。

對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化分析得出的最佳工藝為酶解pH 4.28，超聲波功率104.59 W，復(fù)合酶添加量1.23%。為滿足實(shí)際操作的可行性，對(duì)其最佳工藝條件進(jìn)行修正，設(shè)定酶解pH 4.30，超聲波功率104 W，復(fù)合酶添加量1.20%。通過3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其最佳工藝的準(zhǔn)確性，測得莓茶多糖得率(7.22±0.06)%，與模型預(yù)測值(7.25%)基本吻合，說明該回歸方程能夠真實(shí)可靠地反映各因素對(duì)莓茶多糖得率的影響。

2.5 不同提取方法的比較

如圖7所示，與熱水提取、超聲波提取和復(fù)合酶提取相比，超聲輔助復(fù)合酶提取多糖得率提高了106.83%，86.35%，54.46%，4種方法之間存在顯著性差異。超聲波的機(jī)械作用和空化效應(yīng)可有效地破壞原材料的細(xì)胞壁并加速分子運(yùn)動(dòng)，而復(fù)合酶可以使莓茶細(xì)胞壁降解加速且作用條件溫和，將超聲處理與復(fù)合酶結(jié)合，能夠使得莓茶中的多糖更充分地釋放出來，從而提高了提取效率。

3 結(jié)論

試驗(yàn)最終得到的超聲輔助復(fù)合酶提取莓茶多糖的最佳工藝為：酶解pH 4.30，超聲波功率104 W，復(fù)合酶添加量1.20%，超聲波時(shí)間40 min，超聲波溫度50 ℃。超聲輔助復(fù)合酶提取莓茶多糖工藝可以顯著提高莓茶多糖得率，其得率為(7.22±0.06)%。與熱水提取、超聲波提取和酶法提取相比，超聲波處理與復(fù)合酶結(jié)合能夠較大程度地將多糖提取出來，提高提取效率。試驗(yàn)從多糖得率角度對(duì)莓茶多糖的超聲輔助復(fù)合酶法提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，但未能對(duì)比其不同工藝提取出來的多糖結(jié)構(gòu)和生理活性的差異，后續(xù)將對(duì)此進(jìn)行深入研究。

字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)圖7 不同提取方法莓茶多糖得率比較