楊艾華 - 宋姍姍 - 王微微 -

(遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000)

金黃色葡萄球菌是一種常見的食源性致病菌，廣泛分布于空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物等自然環(huán)境中[1-2]。據(jù)報(bào)道，中國20%～25%的細(xì)菌性食物中毒事件是由金黃色葡萄球菌所引起[3]，其存活能力強(qiáng)，能以生鮮肉、蛋、奶制品及速凍產(chǎn)品等食品為介質(zhì)生長繁殖，并產(chǎn)生腸毒素、殺白細(xì)胞素和表皮脫落素等外毒素，對(duì)人體健康造成嚴(yán)重威脅[4-5]。此外，金黃色葡萄球菌還能附著在物體表面形成生物被膜，增加了細(xì)菌本身對(duì)抑菌劑耐受性，以生物被膜狀態(tài)存在的金黃色葡萄球菌能夠抵抗多種不利的生存條件，在食品生產(chǎn)及加工環(huán)境中常規(guī)的清洗與消毒手段難以完全去除，為食品安全帶來巨大隱患[6-7]。

在食品中添加防腐劑是防止其變質(zhì)、腐敗的重要手段之一。但苯甲酸鹽、亞硝酸鹽、丙酸鹽等食品領(lǐng)域常用的化學(xué)防腐劑，長時(shí)間或過量使用時(shí)有較多副作用[8]。所以，具有安全無毒、作用高效及來源廣泛等優(yōu)點(diǎn)的天然防腐劑已越來越受到研究學(xué)者的關(guān)注與重視。研究[9]發(fā)現(xiàn)，植物提取物含有的多糖、多酚、生物堿、揮發(fā)油等多種活性成分，均具有不同程度的抑菌及抗氧化作用，可作為天然來源的食品防腐劑，防止食品污染并延長其保質(zhì)期，在食品行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。

火炭母為蓼科蓼屬植物(PolygonumchineseL.)，其味酸甘，性微涼，具有清熱除濕、涼血解毒、利肝明目、活血舒筋等功效[10]。火炭母作為民間常見的中草藥在中國分布廣泛，作為涼茶等保健品的主要原料之一，在廣東、廣西等地區(qū)得到普遍使用[11-12]。目前，關(guān)于火炭母的研究大多集中在成分提取、臨床治療等方面[13-15]。研究擬以火炭母提取物為對(duì)象，評(píng)價(jià)其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性，并對(duì)影響其抑菌活性的因素進(jìn)行初步探討，以期為火炭母作為天然防腐劑原料在食品防腐領(lǐng)域的開發(fā)及應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

火炭母：采集于遵義醫(yī)科大學(xué)校園內(nèi)，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所吳立宏研究員鑒定為蓼科植物火炭母植株；

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, CMCC26003)：遵義醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室；

氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、氫氧化鈉、濃鹽酸：分析純，成都化學(xué)試劑廠；

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-2000A型，上海亞榮生化儀器廠；

超凈工作臺(tái)：BCM-1000A型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

離心機(jī)：TD5M-WS型，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：YXQ-LS型，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；

酶標(biāo)儀：ELx800型，美國博騰儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理 選取健康的火炭母植株莖葉洗凈，置于50 ℃烘干，粉碎得火炭母粉末，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 火炭母提取物制備 參照文獻(xiàn)[16]。準(zhǔn)確稱取一定量火炭母粉末，按照m火炭母∶V水=1∶10 (g/mL)加入蒸餾水，室溫浸泡過夜。加熱煮沸1 h，紗布過濾，再加入蒸餾水煮沸。重復(fù)2～3次，合并濾液后用真空泵抽濾，濾液再經(jīng)40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得提取物浸膏，置于冰箱4 ℃冷藏備用。使用前，取適量提取物浸膏配制成100 mg/mL溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后使用。

1.2.3 菌懸液制備 從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取金黃色葡萄球菌單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，調(diào)整細(xì)菌濃度為1.5×106CFU/mL。

1.2.4 抑菌圈測定 采用牛津杯法[17]。將100 μL菌液均勻涂布于平板上，取無菌牛津杯輕置于平板表面，再將100 μL火炭母提取物加入牛津杯，陽性對(duì)照組為0.5%山梨酸鉀溶液，陰性對(duì)照組為無菌水，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，37 ℃過夜培養(yǎng)后觀察結(jié)果，測量抑菌圈直徑。

1.2.5 最小抑菌濃度MIC測定 采用二倍稀釋法[17]。將火炭母提取物用無菌肉湯培養(yǎng)基稀釋為1～64 mg/mL等不同濃度，取96孔板每孔中加入100 μL同上制備的1.5×106CFU/mL金黃色葡萄球菌菌懸液，然后各孔加入100 μL 不同濃度的火炭母提取物，以不添加菌液和火炭母提取物的肉湯培養(yǎng)基作為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，37 ℃過夜培養(yǎng)后，肉眼觀察各孔中細(xì)菌生長情況，再以酶標(biāo)儀測定OD600 nm值[18]。

1.2.6 不同理化因素對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響

采用質(zhì)量濃度為8 mg/mL的火炭母提取物進(jìn)行該部分試驗(yàn)，具體方法如下：

(1) 溫度對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響：將火炭母提取物分別在20，40，60，80，100 ℃的水浴中處理30 min，以未處理組作為陽性對(duì)照，不加樣組作為陰性對(duì)照，以金黃色葡萄球菌為指示菌，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，采用96孔法分別檢測不同溫度對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響[19]。

(2) 紫外線對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響：將火炭母提取物敞開放置在20 W紫外燈光下，分別照射10，20，30，40，50，60 min，以未處理組作為陽性對(duì)照，不加樣組作為陰性對(duì)照，以金黃色葡萄球菌為指示菌，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，采用96孔法分別檢測紫外線對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響[19]。

(3) pH對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響：分別用1 mol/L的鹽酸和1 mol/L氫氧化鈉溶液將火炭母提取物的pH調(diào)為 4.0，6.0，8.0，10.0，以未處理組作為陽性對(duì)照，不加樣組作為陰性對(duì)照，以金黃色葡萄球菌為指示菌，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，采用96孔法分別檢測pH對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響[19]。

(4) 金屬離子對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響：將火炭母提取物分別與0.1 mol/L氯化鈉、氯化鉀和氯化鈣溶液按V提取物∶V鹽溶液=1∶1混合，使火炭母提取物終質(zhì)量濃度為8 mg/mL，以未處理組作為陽性對(duì)照，不加樣組作為陰性對(duì)照，以金黃色葡萄球菌為指示菌，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，采用96孔法分別檢測各金屬離子對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響[19]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 使用Graphpad Prism 8.0及Excel軟件進(jìn)行作圖和單因素方差分析，*表示具有顯著性差異(P<0.05)；**表示具有極顯著性差異(P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 火炭母提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用

2.1.1 抑菌圈直徑 按照藥敏試驗(yàn)以抑菌圈直徑進(jìn)行敏感性判斷[20]。結(jié)果顯示，與陽性對(duì)照相比，100 mg/mL的火炭母提取物對(duì)金黃色葡萄球菌具有更好的抑菌效果，抑菌圈直徑為(18.30±0.12) mm，表現(xiàn)為高度敏感，與歐陽蒲月等[21]的研究結(jié)果一致。

表1 火炭母提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑

2.1.2 最小抑菌濃度 如圖1所示，37 ℃培養(yǎng)后，除空白組無細(xì)菌生長，其余試驗(yàn)組均有細(xì)菌生長，其中1，2，4 mg/mL質(zhì)量濃度下有細(xì)菌生長，且與陽性對(duì)照組相比無明顯差異。采用單因素方差分析，與未加樣的陰性對(duì)照相比，在8～64 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的火炭母提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生長具有極顯著差異(P<0.01)，其中8 mg/mL質(zhì)量濃度下細(xì)菌生長受到抑制，即最低抑菌濃度為8 mg/mL，且火炭母提取物的濃度越高，抑菌效果越強(qiáng)。

2.2 理化因素對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響

2.2.1 溫度對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響 以金黃色葡萄球菌的OD600 nm值為指標(biāo)探討火炭母提取物的抑菌活性[22]。如圖2所示，與陽性對(duì)照組相比，20～80 ℃處理過的火炭母提取物抑菌活性較為穩(wěn)定；而經(jīng)過100 ℃處理后的火炭母提取物抑菌活性有所下降，但仍具有一定抑菌效果，可能是因高溫造成提取物中的抑菌有效成分發(fā)生變化[23]。與陰性對(duì)照組相比，所有試驗(yàn)組均有極顯著的抑菌活性(P<0.01)，表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性，但保存及使用時(shí)不宜長時(shí)間處于高溫環(huán)境，避免抑菌效果減弱。

圖1 火炭母提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度Figure 1 MIC of Polygonum chinense Linnextracts on S. aureus

圖2 溫度對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響

2.2.2 紫外線對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響 如圖3所示，隨著紫外線照射時(shí)間延長，火炭母提取物的抑菌活性相對(duì)穩(wěn)定，與未處理組相比無顯著變化。而與未加藥的陰性對(duì)照組比較，所有試驗(yàn)組均有極顯著的抑菌活性(P<0.01)。說明火炭母提取物中的活性物質(zhì)能夠?qū)棺贤饩€的破壞，對(duì)紫外線處理表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，實(shí)際應(yīng)用中可使用紫外線對(duì)提取物進(jìn)行滅菌處理，同時(shí)亦不會(huì)影響其本身的抑菌能力。因此，火炭母提取物運(yùn)用在食品加工及防腐過程中可結(jié)合紫外線共同進(jìn)行殺菌處理。

2.2.3 pH對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響 如圖4所示，隨著環(huán)境pH的升高或降低，火炭母提取物的抑菌活性都出現(xiàn)下降，可能因?yàn)樗嵝曰驂A性條件破壞了提取物中抑菌活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或者活性[24]；而與未加藥的陰性對(duì)照組比較，所有試驗(yàn)組均有極顯著的抑菌活性(P<0.01)，說明火炭母提取物表現(xiàn)出良好的酸堿穩(wěn)定性。

圖3 紫外線對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響

圖4 pH對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響

2.2.4 金屬離子對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響 如圖5所示，與陽性對(duì)照組相比，火炭母提取物在0.1 mol/L NaCl和0.1 mol/L KCl條件下，抑菌活性有所下降，但與陰性對(duì)照組相比仍具有極顯著(P<0.01)抑菌活性。而在0.1 mol/L CaCl2條件下，火炭母提取物喪失抑菌活性，原因可能是某些金屬離子本身可與抑菌成分螯合，從而降低其抑菌能力[25]。不同金屬離子與火炭母提取物中的活性物質(zhì)結(jié)合形成的絡(luò)合物在結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性上存在一定差異，導(dǎo)致對(duì)其抑菌活性產(chǎn)生不同的影響[26-27]。因此，火炭母提取物在應(yīng)用于食品保鮮或防腐過程中，應(yīng)考慮到食品本身或包裝中涉及到的金屬離子種類和數(shù)量等問題。

圖5 金屬離子對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響

3 結(jié)論

火炭母提取物對(duì)金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌活性，其最小抑菌濃度為8 mg/mL。經(jīng)過不同溫度加熱處理后，火炭母提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性略有減弱，但仍然保持一定的敏感性；而隨著紫外線照射時(shí)間的延長，火炭母提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性相對(duì)穩(wěn)定，說明火炭母提取物對(duì)紫外線不敏感，在食品加工及防腐過程中可結(jié)合紫外線共同進(jìn)行殺菌處理；在不同pH條件下，火炭母提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性略有下降，但仍具有一定的抑菌活性；Ca2+、Na+、K+等不同金屬離子對(duì)火炭母提取物抑菌活性的影響具有明顯差異，其中Na+、K+能夠降低其抑菌活性，而Ca2+的加入導(dǎo)致其活性喪失?？傮w上，火炭母提取物表現(xiàn)出了良好的體外抑菌活性和穩(wěn)定性。

由于火炭母提取物中成分較為復(fù)雜，后續(xù)將繼續(xù)對(duì)火炭母提取物的安全性、抑菌機(jī)制及活性成分組成等進(jìn)行研究，以期為火炭母資源的開發(fā)和利用打下基礎(chǔ)。