韓秋煜 - 石崎松一郎 包 斌

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2. 東京海洋大學(xué)海洋技術(shù)研究科，日本 東京 1080075；3. 食品科學(xué)與工程國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心〔上海海洋大學(xué)〕，上海 201306)

低附加值的商品是魚類副產(chǎn)物開發(fā)的主要目標(biāo)市場(chǎng)，包括魚粉[1]、肥料、寵物食品等廉價(jià)商品。因此，將魚副產(chǎn)物進(jìn)行高值化利用，減少海洋生物資源浪費(fèi)和環(huán)境污染的同時(shí)也為食品行業(yè)提供更多潛在的受益[2]。由于陸生動(dòng)物來源的膠原蛋白及其水解物會(huì)誘發(fā)瘋牛病等疾病，存在使用風(fēng)險(xiǎn)[3]，而含有30%～40%膠原蛋白的魚類副產(chǎn)物則被認(rèn)為是其良好的替代品[4-5]。劍魚因魚體較大，在加工過程中產(chǎn)生的大量廢棄副產(chǎn)物(魚皮)可為制備膠原蛋白提供豐富的原料來源。

透明質(zhì)酸(Hyluronic acid，HA)是存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的糖胺聚糖，由N-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸的重復(fù)單元組成[6]。當(dāng)癌癥、炎癥、氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，內(nèi)源性高分子量HA被透明質(zhì)酸酶和活性氧迅速降解，導(dǎo)致低分子量(≤250 kDa)的HA增加，刺激促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生[7]， 繼而增加疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。因此HA的合成和降解之間的平衡是維護(hù)健康的重要因素。

肽活性的產(chǎn)生是由于其前體受外源酶水解或胃腸消化[8-9]。因其良好的生物活性、生物相容性和安全性[10-11]，膠原蛋白肽已被廣泛應(yīng)用于抗高血壓[12]、抗氧化[13]、抗腫瘤[14]和化妝品[15]等領(lǐng)域。Arunkumar等[16]研究發(fā)現(xiàn)，褐藻(S.tennerimum)葉片提取物中單寧含量較高，有較高的透明質(zhì)酸酶抑制率(37.67±2.30)%。Aryani等[17]發(fā)現(xiàn)科蘭當(dāng)魚尾鰭的乙酸乙酯提取物具有較好的透明質(zhì)酸酶抑制性(IC50為4 mg/mL)及一定的抗過敏作用。但是有關(guān)魚皮膠原蛋白肽的透明質(zhì)酸酶抑制性研究較少，其提取工藝的優(yōu)化尚未見報(bào)道。

試驗(yàn)擬以劍魚魚皮為原料，利用酶解法提取膠原蛋白中的膠原蛋白肽，通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝，并比較膠原蛋白肽粗提物和膠原蛋白透明質(zhì)酸酶的抑制性，旨在為從劍魚中提取具有潛在生物活性的膠原蛋白肽提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

劍魚(Xiphiasgladius)：將魚體運(yùn)入實(shí)驗(yàn)室后于4 ℃下保存至少6 h，分離魚皮及魚肉并切碎，處理后立即放入-85 ℃冰箱貯存，直至試驗(yàn)開始(劍魚種類已由實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行鑒定，X.gladius)，日本宮城縣氣仙沼市魚市場(chǎng)；

蛋白酶、木瓜蛋白酶、三硝基苯磺酸、透明質(zhì)酸、牛血清白蛋白、透明質(zhì)酸酶、胃蛋白酶(1∶10 000)、氫氧化鈉、乙酸、鹽酸、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷、異丙醇羥脯氨酸、氯胺T、ρ-二甲基氨基苯甲醛、異丙醇：日本大阪和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；

胰蛋白酶、α-凝乳蛋白酶、膠原酶、L-亮氨酸、十二烷基硫酸鈉：美國Sigma公司；

馬弗爐：TMF-4000型，日本東京理化器械株式會(huì)社；

磁力攪拌器：RCH-1000型，日本東京理化器械株式會(huì)社；

冷凍離心機(jī)：CR22N21N型，日立株式會(huì)社；

冷凍干燥機(jī)：FD-1000型，日本東京理化器械株式會(huì)社。

1.2 原料理化成分分析

1.2.1 水分含量 采用比重法[18]。

1.2.2 粗蛋白含量 采用凱氏定氮法，計(jì)算時(shí)換算系數(shù)取6.25。

1.2.3 灰分含量 用馬弗爐于550 ℃下焚燒16 h。

1.3 膠原蛋白提取

將魚皮或魚肉均質(zhì)后，于0.1 mg/mL的NaOH中浸泡48 h以脫去非膠原蛋白，過濾清洗至中性，將固形物置于10%異丙醇中36 h以脫脂，每隔6 h更換浸泡液。將脫脂和脫非膠原蛋白的魚皮或魚肉清洗至中性，以m魚皮或魚肉∶V醋酸溶液為1∶40 (g/mL)于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%胃蛋白酶的0.5 mg/mL醋酸溶液中浸泡48 h，10 000 r/min離心60 min。將NaCl加入上清液中進(jìn)行鹽析，至終質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL，并保存過夜。10 000 r/min離心60 min，將沉淀以1∶10 (g/mL)完全溶解于0.5 mg/mL醋酸溶液中，用0.1 mg/mL NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7，加入NaCl至終質(zhì)量濃度為2.4 mg/mL后保持過夜。4 ℃、12 000 r/min離心40 min，收集沉淀物并于0.5 mg/mL醋酸溶液中復(fù)溶，用2.4 mg/mL NaCl鹽析出的沉淀物即為酶溶性膠原蛋白(PSC)。將膠原蛋白溶于0.5 mg/mL醋酸溶液中，先使用0.1 mg/mL醋酸溶液透析24 h，用冷蒸餾水透析至少48 h。PSC溶液凍干后于-25 ℃保存。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

根據(jù)Laemmli[19]的方法稍作修改。將膠原蛋白樣品溶于0.5 mg/mL的醋酸溶液中，使其終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，85 ℃孵育1 h，25 ℃、5 000 r/min離心5 min，除去不可溶解的碎片。上清液置于β-巰基乙醇中，與2倍濃度上樣緩沖液(60 mmol Tris-HCl，pH 8.0，含25%甘油、2% SDS、0.1% 溴酚藍(lán))以V上清液∶V緩沖液為1∶1混合。在7.5%解析凝膠和4%堆積凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的考馬斯亮藍(lán)R-250染色25 min，并使用微波法脫色。

1.5 水解度測(cè)定

采用TNBS法[20]。

1.6 透明質(zhì)酸酶抑制試驗(yàn)

根據(jù)Meyer[21]的方法稍作修改。將25 μL樣品與25 μL 30 U/mL的透明質(zhì)酸酶溶液混勻，37 ℃孵育10 min。加入50 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%的透明質(zhì)酸溶液(溶解于0.15 mg/mL NaCl—0.01 mg/mL磷酸緩沖液中，pH 5.3)，37 ℃孵育45 min。加入900 μL牛血清白蛋白(2.5 mg/mL)，室溫靜置10 min，于540 nm處測(cè)定吸光度。以超純水和單寧酸分別作為陰性、陽性對(duì)照，所有試驗(yàn)測(cè)定3次。按式(1)計(jì)算抑制率。

(1)

式中：

R——抑制率，%；

S——樣品吸光度；

Sb——不含透明質(zhì)酸酶的樣品空白的吸光度；

C——對(duì)照的吸光度；

Cb——不含透明質(zhì)酸酶的對(duì)照空白的吸光度。

1.7 膠原蛋白酶解響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇具有較大影響的復(fù)合酶比(m膠原蛋白酶∶m蛋白酶)、酶解溫度和酶解時(shí)間作為因素，以透明質(zhì)酸酶抑制率作為響應(yīng)因素，根據(jù)Box-Behnken原理優(yōu)化膠原蛋白酶解工藝條件。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Office 365和SPSS 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及繪圖；運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 成分分析

由表1可知，魚肉中的水分和蛋白質(zhì)含量均顯著高于魚皮(P<0.05)，但灰分含量占魚皮的10.60%(1.73 g/100 g)。產(chǎn)于西班牙的劍魚(X.gladius)魚皮中的水分、蛋白質(zhì)、灰分含量分別為42.87，16.28，2.49 g/100 g[22]，而捕于廣西欽州的野生馬面魚(Navodonseptentrionalis)其粗蛋白含量(15.75%)[23]低于寧波產(chǎn)的(36.73%)[24]，說明魚種及生活水域影響魚類的基本理化成分。異丙醇羥脯氨酸也可以作為量化某一組織中膠原蛋白含量的參數(shù)[25]。假設(shè)組織中的異丙醇羥脯氨酸含量全部由膠原蛋白提供，以每100 g樣品中含有11.2 g和10.9 g異丙醇羥脯氨酸作為魚皮和魚肉膠原蛋白的計(jì)算指標(biāo)，劍魚魚皮中的膠原蛋白含量最高(11.03 mg/100 g)，但低于鱈魚皮(58.5 mg/100 g)[26]。此外，魚皮中異丙醇羥脯氨酸含量(0.99 mg/g)顯著高于魚肉(0.09 mg/g)(P<0.05)。從軟骨中提取的大眼鯛的異丙醇羥脯氨酸含量為5.71 mg/g，但魚皮的為19.5 mg/g[27]，表明魚體中不同部位含有的異丙醇羥脯氨酸含量不同。魚類之間膠原蛋白含量的差異可能取決于魚的種類、環(huán)境[26]和魚體部位。

表1 魚皮和魚肉組分分析?

2.2 SDS-PAGE圖譜

由圖1可知，魚皮和魚肉PSC提取物的電泳圖譜相似，均由2α1和α2鏈組成，并含有微量的β鏈。由于α3(I)的電泳遷移位置與α1(I)相同，因此無法確認(rèn)α3鏈的存在[28-29]。根據(jù)電泳遷移率和亞單位組成，認(rèn)為圖1所示的劍魚魚皮中提取的膠原蛋白為PSC-I。α1(I)鏈(130 kDa)和α2(I)鏈(120 kDa)的分子量略高于從鯉魚皮中分離的ASC-I (120，116 kDa)[30]，但與尼羅羅非魚皮中分離的ASC-I和PSC-I分子量相近[31]，說明物種的不同影響了分子量。此外，劍魚中提取的PSC-I對(duì)胃蛋白酶的敏感性較高，表現(xiàn)為魚肉來源的膠原蛋白存在多個(gè)低于100 kDa的弱α亞單位。正常情況下，在膠原蛋白的SDS-PAGE模式中可觀察到β帶和γ帶。但圖1中的β帶強(qiáng)度較低，所提膠原蛋白交聯(lián)度較低。而交聯(lián)度的變化可能是由于捕撈季節(jié)的不同，饑餓的魚含有更高的高交聯(lián)膠原蛋白(高分子量)[25,29]。

2.3 膠原蛋白酶解工藝優(yōu)化

2.3.1 水解度與透明質(zhì)酸酶抑制率的相關(guān)性分析 由圖2可知，水解度與透明質(zhì)酸酶抑制率的相關(guān)指數(shù)為0.719(P>0.001)，非常顯著，可以確定透明質(zhì)酸酶抑制率與水解度之間存在顯著正相關(guān)性，說明在一定范圍內(nèi)，膠原蛋白肽的水解度越高，透明質(zhì)酸酶抑制率越高，二者呈線性關(guān)系。因此，僅選擇透明質(zhì)酸酶抑制率作為響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)的相應(yīng)指標(biāo)，也可以得到具有較高可信度的結(jié)果。

2.3.2 響應(yīng)面回歸模型的建立及方差分析 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以復(fù)合酶比(m膠原蛋白酶∶m蛋白酶)、酶解溫度和酶解時(shí)間為影響因素，以透明質(zhì)酸酶抑制率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)膠原蛋白酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素和水平見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。由表3可知，膠原蛋白肽的透明質(zhì)酸酶抑制率為18.98%～41.93%，最佳抑制率高于從魷魚中提取的膠原蛋白肽(32.21%)[32]，但低于蠶繭提取物(約52%)[33]。

M. 蛋白標(biāo)品 1. 魚皮膠原蛋白 2. 魚肉膠原蛋白圖1 劍魚中PSC-I的SDS-PAGE圖譜Figure 1 SDS-PAGE pattern of PSC-I derivedfrom swordfish

利用線性項(xiàng)和二次項(xiàng)的回歸系數(shù)對(duì)表3進(jìn)行多元回歸擬合，得透明質(zhì)酸酶抑制率與各酶解條件的二次回歸方程為：

Y=40.12+1.91A-2.98B+1.57C-0.42AB-9.01AC+2.87BC-6.80A2-8.09B2-2.85C2。

(2)

圖2 水解度與透明質(zhì)酸酶抑制率的相關(guān)性分析Figure 2 Correlation analysis of DH and HAaseinhibition rate

表2 響應(yīng)面分析因素和水平Table 2 Response surface analysis factors and levels

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表4可知，模型F值為23.22，擬合性顯著[34]；失擬項(xiàng)P值為0.252 5>0.05，不顯著[35]。因此，該模型的擬合值可以用來分析膠原蛋白肽的最佳水解條件。方差分析結(jié)果表明透明質(zhì)酸酶抑制率受酶解時(shí)間的影響比酶解溫度和復(fù)合酶比的更顯著。

2.3.3 響應(yīng)面交互分析 由圖3可知，BC的響應(yīng)面陡峭，說明酶解溫度和酶解時(shí)間的相互作用顯著；酶解時(shí)間和復(fù)合酶比有相對(duì)顯著的交互作用，而酶解溫度與復(fù)合酶比的交互作用相對(duì)較弱。

2.3.4 最佳工藝驗(yàn)證 根據(jù)響應(yīng)面分析，從劍魚魚皮中得到PSC-I肽的最佳工藝條件為復(fù)合酶比(m膠原蛋白酶∶m蛋白酶)7.98∶2.02，酶解溫度31.70 ℃，酶解時(shí)間6.00 h。在此工藝條件下，理論預(yù)測(cè)I型膠原蛋白肽的透明質(zhì)酸酶抑制率為41.06%。為方便操作，將最佳條件修正為復(fù)合酶比(m膠原蛋白酶∶m蛋白酶)8∶2，酶解溫度32 ℃，酶解時(shí)間6 h，此條件下的透明質(zhì)酸酶抑制率為(42.35±0.06)%(n=3)，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅3.05%，說明建立的模型與實(shí)際較為吻合。經(jīng)優(yōu)化后，膠原蛋白的透明質(zhì)酸酶抑制率顯著高于陰性對(duì)照(2.32%)(P<0.05)，但僅為陽性對(duì)照的0.51倍。由于粗肽的純度不高，各肽段由于C端和N端的氨基酸序列不同，出現(xiàn)抑制作用。因此，該粗肽需進(jìn)一步純化篩選，以獲得更高的透明質(zhì)酸酶抑制活性。

3 結(jié)論

對(duì)劍魚皮中I型膠原蛋白進(jìn)行提取后，利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到具有透明質(zhì)酸酶抑制活性的膠原蛋白肽的最佳酶解條件為復(fù)合酶比(m膠原蛋白酶∶m蛋白酶)8∶2，酶解溫度32 ℃，酶解時(shí)間6 h，此條件下的透明質(zhì)酸酶抑制率為(42.35±0.06)%(n=3)，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為3.05%，說明建立的模型與實(shí)際較為吻合。但是膠原蛋白肽對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制機(jī)理仍沒有充分研究，因此對(duì)該活性肽的進(jìn)一步純化和表征，并分析其抑制機(jī)理將是下一步研究的方向。

表4 回歸模型的方差分析?

圖3 各因素交互作用的響應(yīng)面及等高線圖Figure 3 Response surface and contour plots of interactive effects