劉飛波 - 王 希 劉水平 -

(株洲市食品藥品檢驗所，湖南 株洲 412000)

6-芐基腺嘌呤是一種人工合成的生物生長調(diào)節(jié)劑，通過刺激細(xì)胞分裂引起植物生長和發(fā)育，抑制呼吸激酶而延長綠色蔬菜的保鮮，但長期過量食用會出現(xiàn)惡心、嘔吐等現(xiàn)象[1-3]。2015年，國家食品藥品監(jiān)督管理總局、農(nóng)業(yè)部、國家衛(wèi)生和計劃生育委員根據(jù)《中華人民共和國食品安全法》《中華人民共和國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》等相關(guān)法律的規(guī)定，禁止豆芽生產(chǎn)過程中使用6-芐基腺嘌呤等物質(zhì)[4]。

目前，GB/T 23381—2009規(guī)定的6-芐基腺嘌呤檢測方法提取凈化耗時較長，需要過SPE小柱處理，經(jīng)濟成本比較高。而QuEChERS法是一類快速、簡便、經(jīng)濟、高效、耐用和安全的樣品前處理方法，目前常用于植物源性產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留以及動物源性食品的檢測。曾志杰等[5]公開發(fā)表了非標(biāo)準(zhǔn)方法液質(zhì)方法測定豆芽中6-芐基腺嘌呤含量的合成不確定度，其前處理較為復(fù)雜，需要經(jīng)過MCX固相小柱處理，成本較高。研究嘗試結(jié)合QuEChERS前處理方法，采用高效液相色譜法檢測果蔬類農(nóng)產(chǎn)品中6-芐基腺嘌呤含量，根據(jù)CNAS-GL 06—2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》的要求，參考相關(guān)文獻[5-11]，通過分析各不確定度分量的來源，建立評定6-芐基腺嘌呤含量數(shù)學(xué)模型，計算分析過程，進行不確定度評定，利用不確定度評定對QuEChERS前處理果蔬類農(nóng)產(chǎn)品的檢測方法進行評價分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜儀：Thermo U3000型，美國賽默飛世爾科技公司；

電子天平：MS205DU型，瑞士梅特勒—托利多國際貿(mào)易有限公司。

6-芐基腺嘌呤：98.5%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；

提取鹽包、凈化包：中國上海安譜實驗科技股份有限公司；

甲醇：色譜純，美國Honeywell公司；

甲酸：優(yōu)級純，上海國藥集團化學(xué)試劑公司。

1.2 樣品

果蔬類樣品：黃豆芽4批，綠豆芽2批，草莓2批，黃瓜2批，市售。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理 稱取10.0 g均質(zhì)試樣于50 mL具塞離心管中，加入25.0 mL含體積分?jǐn)?shù)1%甲酸的甲醇溶液，再加入提取鹽包(內(nèi)含4.0 g無水MgSO4、1.0 g無水醋酸鈉)，高速均質(zhì)1 min，8 000 r/min離心5 min，取10 mL上清液于離心管中，加入凈化包(內(nèi)含有150 mg PSA及850 mg無水MgSO4，100 mg C18固相萃取吸附劑)，渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min，精確移取5.0 mL溶液至具塞離心管中，弱N2氣流吹干，用甲醇定容至1.0 mL，甲醇定容后的溶液經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾，作為待測液供HPLC分析[7]。

1.3.2 色譜條件 色譜條件的選擇參照GB/T 23381—2009以及相關(guān)文獻資料[7]，色譜柱：Welch Xtimate C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇—0.02 mol/L乙酸銨混合液(V甲醇∶V乙酸銨=1∶1)，等度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；檢測波長267 nm。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制參照GB/T 23381—2009 的要求，經(jīng)高效液相色譜檢測后，采用外標(biāo)法定量。

(1) 標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取6-芐基腺嘌呤對照品0.011 83 g置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度即得標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.165 mg/mL，于-18 ℃下保存。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)工作液：用甲醇稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配成5個不同質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別為0.058 26，0.116 5，0.291 5，0.582 6，1.165 0 μg/mL，采用外標(biāo)法進行定量。

1.3.4 6-芐基腺嘌呤含量計算

(1)

式中：

X——樣品中6-芐基腺嘌呤含量，mg/kg；

C——測試溶液中的質(zhì)量濃度，μg/mL；

C0——空白溶液中的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——定容體積，mL；

m——樣品取樣量，g；

f——稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

結(jié)合QuEChERS前處理方法，按“1.3.2項”色譜條件上機分析，6-芐基腺嘌呤與各雜質(zhì)峰及溶劑峰能很好地分離，見圖1。經(jīng)過檢測分析，1批黃豆芽有檢出6-芐基腺嘌呤。以黃豆芽為主要分析對象，評價新的前處理方法對果蔬類農(nóng)產(chǎn)品中6-芐基腺嘌呤含量測定的不確定度的影響。

2.1 不確定度來源分析

圖1 6-芐基腺嘌呤樣品和標(biāo)樣的HPLC分離效果圖Figure 1 Separation of sample and 6-benzyladeninestandards by HPLC

2.2 不確定度量化分析

根據(jù)樣品測定過程及數(shù)學(xué)模型，影響試驗不確定度的主要分量見圖2。

圖2 不確定度影響因素構(gòu)成圖Figue 2 Constitution of uncertainty of influential factor

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

配制5個梯度的6-芐基腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液(11.65 μg/mL→0.058 26 mg/mL)中使用1 mL的移液槍5次，10 mL A級容量瓶3次，100 mL A級容量瓶2次。引入的相對不確定度為：

綜上，6-芐基腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成為：

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度 6-芐基腺嘌呤和儀器響應(yīng)峰面積見表2。試驗將質(zhì)量濃度為0.058 26，0.116 5，0.291 3，0.582 6，1.165 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進樣3次，結(jié)果見表2。根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，擬合工作曲線方程為A=bC+d=0.792 7C-0.011 9(R2=0.998 2)。

表1 移液器引入的不確定度

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合數(shù)據(jù)

稱取10.24 g粉碎好的果蔬類(黃豆芽)樣品，對同一樣品進行5次測量，由校準(zhǔn)曲線求得6-芐基腺嘌呤濃度為0.686 5 μg/mL，含量為0.335 mg/kg。校正曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(curve)的計算公式為：

urel(curve)=u(curve)/c，

(2)

(3)

(4)

式中：

b——斜率，0.797 2；

p——測試次數(shù)，5；

n——校準(zhǔn)次數(shù)，15；

c——樣品黃豆芽中的質(zhì)量濃度，0.686 5 μg/mL；

Ai——第i個校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定峰面積，mAu·min；

ci——第i個校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，μg/mL；

d——標(biāo)曲截距，-0.011 9。

SR——標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，0.008 33。

將以上數(shù)據(jù)代入式(2)求得urel(curve)=0.028 2。

表3 回收率引入的不確定度

重復(fù)測定陽性樣品(黃豆芽)，平行測定6份，所得的峰面積按標(biāo)曲換算成質(zhì)量濃度，分別為0.335，0.331，0.339，0.336，0.333，0.326 mg/kg，平均質(zhì)量濃度為0.334 mg/kg；測量重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度為：

2.2.6 樣品前處理定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3 合成不確定度

綜上分析，HPLC法測定果蔬類農(nóng)產(chǎn)品中的6-芐基腺嘌呤的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的分量見表4。

將合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表4 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量表

取k=2，P=95%，則擴展相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度U=k×uc=0.026 mg/kg，則果蔬類農(nóng)產(chǎn)品(黃豆芽)中的6-芐基腺嘌呤含量可以表示為：(0.335±0.026) mg/kg，k=2(95%的置信區(qū)間)。即：6-芐基腺嘌呤的含量測定結(jié)果出現(xiàn)在(0.335±0.026) mg/kg區(qū)間的概率為95%。

由表4可見，文中不確定度的主要來源是標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合[urel(curve)=0.028 2]、梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液配制[urel(c)=0.018 2]以及測定的回收率[urel(r)=0.015 1]。曾志杰等[5]有關(guān)液質(zhì)方法測定豆芽中6-芐基腺嘌呤含量的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc=0.033 4，略低于文中的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度0.038 3，但其未考慮整個前處理定容所引入的不確定度，分析不夠全面。唐韻熙[6]有關(guān)液質(zhì)方法對豆芽中4-氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤殘留量的不確定度評定，其合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel=0.093 98，遠(yuǎn)高于文中的不確定度評定的數(shù)據(jù)，即使不考慮檢測儀器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(fm)=0.04，其合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(x)=0.079 6，也高于文中的。唐韻熙[6]的研究中不確定度的主要來源分別是樣品的前處理[urel(樣品)=0.057 74]、擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線[urel(curve)=0.040 113]、檢測儀器[urel(A)=0.04]以及梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液配制[urel(c)=0.030 16]。通過比較兩者之間的不確定度的主要來源，作者發(fā)現(xiàn)復(fù)雜的前處理方式，引入了大量的不確定度。新的前處理方法簡化了前處理步驟，減少了溶劑的消耗，有利于環(huán)境保護和檢驗人員的身體健康。

3 結(jié)論

對果蔬類農(nóng)產(chǎn)品中6-芐基腺嘌呤進行檢測時，采用QuEChERS法進行前處理，能夠提升前處理速度，減少溶劑的消耗，減少污染，保護人員身體健康。樣品的稱取、提取、凈化以及定容等過程都會引入不確定度，但其主要來源于擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求得樣品濃度過程以及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，而其他因素影響較小。因此，平時檢驗檢測過程中要注意前處理的規(guī)范性，盡可能選用高精度的A級量具以及精確配制標(biāo)準(zhǔn)溶液等。同時應(yīng)定期對高效液相色譜儀進行保養(yǎng)、期間核查以及檢定校準(zhǔn)，以保持儀器狀態(tài)良好，降低儀器本身帶來的不確定度的影響，保證測定結(jié)果的可靠性。