程 慧 劉 順 黎 波 黃玉蘭 - 周 濤

(1. 黃梅縣公共檢驗檢測中心，湖北 黃岡 435501；2. 荊州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 荊州 434000；3. 石首市公共檢驗檢測中心，湖北 石首 434400)

氯霉素是一種高效的抑菌性廣譜抗生素，在蛋雞養(yǎng)殖過程中常作為治療抗生素，其在蛋雞體內(nèi)的消除半衰期較快，但是雞蛋中殘留的氯霉素最快需要12 d才可以完全消除[1-3]。因為氯霉素具有較強的毒性，若長期食用氯霉素殘留的雞蛋會引起機體因正常菌群失調(diào)而更易感染疾病。2019年中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號公告修訂了食品動物中禁止使用的藥品及化合物清單，氯霉素及其鹽、酯類再次明文規(guī)定禁止使用，說明食品安全檢測中氯霉素的殘留問題進(jìn)一步得到重視[4-6]。為滿足食品安全快速檢測和重大活動保障的相關(guān)訴求，有必要開發(fā)出適合于雞蛋中氯霉素的快速測定，進(jìn)一步加強市場管理和監(jiān)督[7-9]。

雞蛋中氯霉素的儀器檢測法為氣相色譜—質(zhì)譜、液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜，此方法適合于監(jiān)管部門對于樣品的周期性檢驗檢測，設(shè)備成本和維護(hù)成本都較高[10-12]。而目前中國基層檢驗檢測水平能夠?qū)崿F(xiàn)大型儀器檢測農(nóng)獸藥殘留較少，即使購買了大型儀器也存在缺少專業(yè)技術(shù)人員等其他因素導(dǎo)致儀器不能投入使用，若在基層大力推進(jìn)食品安全快速檢測，可實現(xiàn)大量農(nóng)副產(chǎn)品的有毒有害物質(zhì)檢測，將食品安全的風(fēng)險降至可防可控水平，及時守衛(wèi)餐桌安全。目前檢測氯霉素的快速檢測方法主要是膠體金免疫分析法，其原理是根據(jù)抗體可特異性識別目標(biāo)分子實現(xiàn)檢測，但雞蛋中農(nóng)獸藥殘留多為小分子物質(zhì)，由傳統(tǒng)化學(xué)方法得到的目標(biāo)半抗原后再進(jìn)行動物試驗，這對于及時應(yīng)對突發(fā)食品安全事件不具有時效性[13-15]。核酸適配體是可在體外進(jìn)行篩選的一種比抗體更加穩(wěn)定、高效的人工抗體，目標(biāo)小分子通常結(jié)合于適配體的折疊區(qū)域，通過掌握核酸適配體的篩選技術(shù)可以快速應(yīng)對突發(fā)事件，能大幅提升基層檢測機構(gòu)應(yīng)對食品安全未知風(fēng)險的能力[16-18]。

近年來研究食品中氯霉素殘留的適配體檢測方法主要有比色檢測法、熒光檢測法、化學(xué)發(fā)光檢測法和生物傳感檢測法等[19-21]，比色檢測法較其他在可操作性及便捷性等方面更適用于現(xiàn)場快速檢測[22-24]。例如，Yan等[25]基于生物素—鏈霉親和素信號放大測定氯霉素殘留；Huang等[26]基于DNA酶功能化納米探針催化顯色用于快速檢測氯霉素；高慧菊等[27]基于氯化鈀納米顆粒標(biāo)記聚合物螯合物的雙重信號放大快速檢測氯霉素；Mahbobeh等[28]利用金納米粒子在不同狀態(tài)下的顯色反應(yīng)間接檢測氯霉素殘留量。由此可見，以適配體特異性識別結(jié)合顯色反應(yīng)是目前現(xiàn)場快速檢測的最佳方法，目前適配體比色法通常會利用生物酶、金屬納米粒子實現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在溫育反應(yīng)和分離洗滌等操作過程中比較繁瑣，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，不利于現(xiàn)場快速檢測的有效分析。研究擬將雜交互補鏈反應(yīng)與顯色反應(yīng)同時應(yīng)用于適配體傳感器，建立一種快速檢測氯霉素的新方法，通過引入DNA酶及磁性納米微球?qū)崿F(xiàn)簡化操作及減少假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氯霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、多西環(huán)素、甲砜霉素：USP級，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

氯化血紅素(貯藏溫度2～8 ℃，hemin)：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

羧基磁珠(1.0～2.0 μm，10 mg/mL)：賽默飛世爾科技公司；

DNA酶(1)(5’-GGGTAGGGCGGGTTGGTGGGACAACTCACTGAAGGACATGTA-3)、適配體(2)(5’-NH2-(CH2)6-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-3’)：上海生工生物工程股份有限公司；

紫外可見分光光度計：T6型，北京普析通用儀器有限公司；

恒溫混勻儀：YN-H02-024型，杭州佑寧儀器有限公司；

16位磁力架：DynaMag-2型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

三重四級桿液相—質(zhì)譜聯(lián)用儀：CN18063026型，沃特世科技(上海)有限公司。

1.2 磁珠—適配體的制備

將5 μL 20 mg/mL羧基化磁珠清洗2～3次，按照產(chǎn)品說明進(jìn)行活化，以實現(xiàn)羧基化磁珠與氨基化適配體的偶聯(lián)。向清洗后的磁珠中加入EDC/NHS活化劑(300 μL，2 mg/mL溶于50 mmol/L pH 6.0 MES緩沖液)，置于振蕩器中室溫反應(yīng)30 min以上?；罨磻?yīng)后用緩沖溶液(50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl)清洗活化后的羧基磁珠，向清洗后的羧基化磁珠中加入氨基化氯霉素適配體(100 μL，3 μmol/L溶于50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl)，將上述混合物置于已調(diào)至37 ℃的恒溫混勻儀中反應(yīng)50 min，重復(fù)磁珠的清洗操作，再重新分散于300 μL pH 7.5的Tris-HCl緩沖溶液中，于4 ℃保存。

1.3 檢測條件優(yōu)化

1.3.1 溫育時間 在適配體濃度3 μmol/L，DNA酶濃度5 μmol/L，氯霉素濃度100 mg/kg，考察溫育時間(30，40，50，60，70 min)對體系吸光度的影響。

1.3.2 反應(yīng)時間 在適配體濃度3 μmol/L，DNA酶濃度5 μmol/L，氯霉素濃度100 mg/kg，考察溫育時間(30，35，40，45，50，55 min)對體系吸光度的影響。

1.3.3 顯色反應(yīng) 在適配體濃度3 μmol/L，DNA酶濃度5 μmol/L，氯霉素濃度100 mg/kg，考察溫育時間(5，10，15，20，25 min)對體系吸光度的影響。

1.4 均相反應(yīng)

向離心管中加入990 μL 10 mmol/L pH為7.5的Tris-HCl(含1 mmol/L EDTA)，進(jìn)一步向其中加入10 μL 5 μmol/L DNA酶，在恒溫混勻儀中25 ℃震蕩反應(yīng)45 min后待用。取上述磁珠適配體溶液300 μL與1 mL 0.02 μmol/L DNA酶溶液混勻，37 ℃渦旋混勻反應(yīng)90 min，磁分離后采用洗滌液和pH 7.0 Tris-HCl溶液交替洗3次，將該磁珠復(fù)合物重新分散于200 μL的pH 7.5 Tris-HCl緩沖溶液中4 ℃保存。

1.5 氯霉素的檢測

取30 μL上述磁珠復(fù)合物與20 μL按一定濃度梯度配制的氯霉素溶液充分混勻后，在恒溫混勻儀中37 ℃震蕩反應(yīng)50 min，磁分離后取上清液加入10 μL 1 μmol/L hemin充分混勻后進(jìn)行顯示反應(yīng)。先向反應(yīng)之后的溶液中加入60 μL包含有0.5 mmol/L TMB與0.5 mmol/L H2O2的25 mmol/L pH 5.0檸檬酸鹽緩沖溶液，室溫反應(yīng)15 min，向反應(yīng)體系中加入稀硫酸溶液(30 μ/L，2 mol/L)以終止四甲基聯(lián)苯的顯色反應(yīng)。將反應(yīng)體系靜置10 min后，測定吸光度，并建立吸光度值與氯霉素濃度之間的線性關(guān)系。

1.6 氯霉素檢測的特異性

為了驗證方法的特異性，將濃度為100 mg/kg的氯霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、多西環(huán)素、甲砜霉素7種抗生素按照1.4的步驟加入到磁珠復(fù)合物中混勻，進(jìn)行顯色反應(yīng)后使用分光光度計測量。

1.7 雞蛋樣品的準(zhǔn)備

雞蛋樣品購于當(dāng)?shù)爻小７Q取10 g攪拌均勻的樣品于50 mL具塞離心管中，加入1.0 mL 10 ng/mL間硝基氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液和30 mL乙酸乙酯，振蕩30 min，4 000 r/min 離心2 min后取上清液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，殘渣用30 mL乙酸乙酯再提取一次，合并提取液，于35 ℃ 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1～2 mL，加入1 mL甲醇溶解提取液，用20 mL 4%氯化鈉溶液和20 mL正己烷液液萃取，棄去正己烷層，水相用40 mL乙酸乙酯分兩次萃取，合并乙酸乙酯相于心形瓶中35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用氮氣緩慢吹干備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法原理

試驗擬將模擬過氧化物DNA酶引入雞蛋中氯霉素的適配體傳感器，當(dāng)氯霉素適配體與磁珠組合體結(jié)合后，可與DNA酶發(fā)生雜交鏈互補反應(yīng)，從而使催化活性呈失活狀態(tài)。加入不同濃度氯霉素目標(biāo)分子后，具有高催化活性的DNA酶得到釋放，試驗體系可催化四甲基聯(lián)苯胺—雙氧水顯色實現(xiàn)對雞蛋中氯霉素殘留的快速檢測，整個試驗過程原理如圖1所示。當(dāng)溶液中存在氯霉素時，復(fù)合物體系優(yōu)先與氯霉素結(jié)合，使模擬過氧化物DNA酶從復(fù)合物體系中解離出進(jìn)入上清液中。根據(jù)加入氯霉素含量的多少確定顏色變化，據(jù)此實現(xiàn)雞蛋中氯霉素的定量檢測。

2.2 DNA酶催化顯色反應(yīng)及磁珠適配體的建立

根據(jù)模擬過氧化物DNA酶的催化活性因與目標(biāo)分子適配體雜交結(jié)合后得到抑制的磁珠結(jié)合體，可通過改變DNA酶的序列結(jié)構(gòu)使催化活性的抑制效果提高。試驗通過在DNA酶序列的3′末端增加一個A-堿基與未修飾的DNA酶在相同條件下分別與氯霉素磁珠適配體反應(yīng)，在最優(yōu)化反應(yīng)條件下加入100 mg/kg氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)后進(jìn)行顯色反應(yīng)。如圖2所示，因氯霉素與DNA酶競爭適配體，導(dǎo)致DNA酶與適配體解離。針對不同試驗階段的雜交反應(yīng)分別進(jìn)行驗證分析，DNA酶和適配體(泳道3)與DNA酶(泳道1)、適配體(泳道2)相比電泳遷移速度較慢，證實DNA酶和適配體雜交成功，泳道5與泳道1的重合則充分說明氯霉素與適配體成功結(jié)合。從圖3可以看出，未修飾DNA酶a、修飾后的DNA酶b和氯霉素進(jìn)行的顯色反應(yīng)相比較，發(fā)現(xiàn)以修飾后的DNA酶進(jìn)行顯色反應(yīng)引起的吸光度響應(yīng)效應(yīng)強于未修飾的DNA酶。

圖1 基于核酸適配體識別引起DNA酶釋放比色分析原理示意圖

為進(jìn)一步證明氯霉素與適配體的結(jié)合，通過紫外—分光光度法驗證適配體與目標(biāo)物的結(jié)合。從圖4可看出，空白的TMB-H2O2溶液無明顯的紫外吸收峰(曲線a)，10 μL 5 μmol/L DNA酶、10 μmol/L hemin、TMB-H2O2溶液及終止液反應(yīng)后在紫外圖譜上出現(xiàn)了明顯的吸收峰(曲線c)，磁珠適配體溶液300 μL與1 mL DNA酶溶液混勻反應(yīng)后吸取上清液，加入顯色劑后有較弱的紫外吸收峰(曲線b)，當(dāng)將100 mg/kg氯霉素用于適配體反應(yīng)后，所得溶液產(chǎn)物加入顯色劑后也出現(xiàn)明顯紫外吸收峰(曲線d)。這一現(xiàn)象證明了氯霉素加入體系反應(yīng)之后與適配體結(jié)合釋放DNA酶，從而使顯色反應(yīng)強度進(jìn)一步提高。

1. DNA酶 2. 適配體 3. DNA酶和適配體 4. 適配體 5. 適配體和氯霉素

圖3 不同物質(zhì)反應(yīng)前后吸光度的比較Figure 3 Comparison of absorbance before and afterreaction of different substances

a. TMB-H2O2 b. 空白試劑 c. 100 mg/kg氯霉素 d. DNA酶

2.3 檢測條件優(yōu)化

2.3.1 溫育時間 由圖5可知，隨著第一次堿基互補配對溫育時間的增加，磁分離之后的溶液在顯色反應(yīng)之后吸光度響應(yīng)值逐步降低，說明磁珠上連接的適配體與DNA酶結(jié)合后，導(dǎo)致溶液中DNA酶含量減少，顯色反應(yīng)溶液的吸光度值也隨之趨于減小，當(dāng)溫育時間>50 min后得到的吸光度值趨于穩(wěn)定。故以50 min作為最佳反應(yīng)時間。

2.3.2 反應(yīng)時間 由圖6可知，將100 mg/kg的氯霉素用于添加DNA酶的磁珠適配體，其吸光度信號響應(yīng)隨反應(yīng)時間的增加而增加，說明DNA酶從磁珠適配體上解離的量逐步增加。當(dāng)氯霉素與反應(yīng)體系的溫育時間超過45 min時，反應(yīng)體系的吸光度值趨于穩(wěn)定。說明氯霉素與添加DNA酶的磁珠適配體反應(yīng)時間達(dá)到45 min時可反應(yīng)徹底。

圖5 溫育時間對吸收光譜的影響

圖6 反應(yīng)時間對吸收光譜的影響Figure 6 The effects of reaction times on the absorptionspectral responses obtained

2.3.3 顯色時間 由圖7可知，當(dāng)顯色反應(yīng)時間<15 min時，吸光度的響應(yīng)值隨時間的增加而增加，超過15 min后吸光度的響應(yīng)值達(dá)到穩(wěn)定。由此可見DNA酶與氯化血紅素的充分反應(yīng)時間為15 min，此時酶促反應(yīng)也達(dá)到最大限度。因此，以15 min為顯色反應(yīng)最佳時間。

2.4 線性分析

在優(yōu)化的條件(DNA酶與適配體的反應(yīng)時間為50 min，氯霉素加入后的反應(yīng)時間為45 min，顯色時間為15 min)下，研究不同質(zhì)量濃度氯霉素在試驗設(shè)計方法下的吸光度。比色反應(yīng)過程中，體系的吸光度值隨氯霉素濃度的增加呈線性增加(見圖8)，線性回歸方程為：y=0.101 1+0.549 5 lgC，相關(guān)系數(shù)為0.998。

2.5 特異性

分別考察了氯霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、多西環(huán)素、甲砜霉素7種抗生素在該試驗條件下吸光度的響應(yīng)值。由圖9可知，對目標(biāo)分析物氯霉素的響應(yīng)值較大，而在其他6種抗生素的很小。此結(jié)果證明該方法對氯霉素具有特異性，其他同系干擾物的交叉響應(yīng)可忽略。

圖7 顯色反應(yīng)時間對吸收光譜的影響

圖8 吸收光強度與氯霉素的線性關(guān)系

圖9 7種抗生素用于試驗設(shè)計的方法后產(chǎn)生的吸收強度響應(yīng)

2.6 準(zhǔn)確性

按照GB/T 22338—2008《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》對雞蛋樣品進(jìn)行適當(dāng)前處理后，用液相色譜—質(zhì)譜檢測基底之后，在基底中分別加入質(zhì)量濃度為5，10，25 mg/kg的氯霉素，得加標(biāo)樣品，分別用試驗設(shè)計的方法、液相色譜—質(zhì)譜和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法對加標(biāo)樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果見表1。由表1可知，3種方法的RSD分別為2.29%，4.07%，2.59%，回收率為98.4%～101.1%，通過計算3種方法分別所得結(jié)果的偏差后得出檢測結(jié)果基本一致，將表中所得試驗結(jié)果與加標(biāo)量進(jìn)行比較得出試驗設(shè)計的方法的檢測結(jié)果準(zhǔn)確度較高。

表1 與標(biāo)準(zhǔn)和常規(guī)方法的比較及準(zhǔn)確性試驗結(jié)果

3 結(jié)論

基于適配體—磁珠復(fù)合體與氯霉素的競爭反應(yīng)，以達(dá)到解離適配體與DNA酶的雜交結(jié)合，成功實現(xiàn)DNA酶與血紅素的催化顯色反應(yīng)，可用于雞蛋中氯霉素殘留量的快速檢測。結(jié)果顯示，該方法對氯霉素的檢測具有檢出限低、選擇性強、反應(yīng)時間短等優(yōu)勢，因該方法未涉及較貴重的儀器而且操作簡單易行，較適合基層檢測機構(gòu)用于現(xiàn)場快速檢測，便于及時篩查出氯霉素殘留超標(biāo)的樣品。