朱鎮(zhèn)星,覃松,馬密茸,李翠杰,歐陽曉輝(浙江宏元藥業(yè)股份有限公司,浙江 臨海 317016)
阿托伐他汀鈣[1-2],商品名LIPITOR,分子結(jié)構(gòu)式由式(1)表示,是HMG-CoA還原酶的選擇性、競爭性抑制劑,通過抑制肝臟內(nèi)HMG-CoA還原酶和膽固醇的合成從而降低血漿中膽固醇和脂蛋白水平,并通過增加細(xì)胞表明的肝臟LDL受體以增強(qiáng)LDL的攝取和代謝;適用于高膽固醇血癥和冠心病,是全球第1個年度銷售額超過百億美元的重磅新藥。
B-4,分子結(jié)構(gòu)式由式(2)表示,化學(xué)名:2-[2-(4-氟苯基)-2-氧代-1-苯基乙基]-4-甲基-3-氧代-N-苯基戊酰胺;英文名稱:2-[2-(4-Fluorophenyl)-2-oxo-1-phenylethyl]-4-methyl-3-oxo-Nphenylpentanamide. CAS號:125971-96-2,是合成阿托伐他汀鈣原料藥的關(guān)鍵中間體[3-5], 化學(xué)結(jié)構(gòu)如下。
B-4主要控制的雜質(zhì)有工藝雜質(zhì)去氟B-4雜質(zhì),分子結(jié)構(gòu)式由式(3)表示;前一步中間體B-3,分子結(jié)構(gòu)式由式(4)表示。B-4樣品的乙腈溶液在玻璃進(jìn)樣小瓶中,發(fā)生無法預(yù)測的,貌似隨機(jī)的降解。問題的詭異之處在于每個樣品溶液制備時(shí),均無法預(yù)測樣品是否會降解,隨著時(shí)間推移,回顧已經(jīng)制備的樣品溶液,在HPLC玻璃進(jìn)樣瓶中的溶液穩(wěn)定性,約10%的溶液顯示會降解,12 h內(nèi)降解0.2%~2%。我們通過研究確定溶液降解是由堿催化引起B(yǎng)-4降解,降解雜質(zhì)為B-4的烯醇式結(jié)構(gòu)[6],分子結(jié)構(gòu)式由式(5)表示,相關(guān)文獻(xiàn)中未報(bào)到B-4的烯醇式雜質(zhì)。
本次研究的意義在于:阿托伐他汀鈣是十分重要的降低膽固醇的藥物,B-4為阿托伐他汀鈣關(guān)鍵中間體,開發(fā)一個耐用性良好,能夠避免HPLC玻璃進(jìn)樣瓶的堿性物質(zhì)催化降解的B-4相關(guān)物質(zhì)檢測方法,對阿托伐他汀鈣原料藥的質(zhì)量控制具有重要意義。同時(shí),避免放行過程中不必要的OOS(超標(biāo))調(diào)查,對于提高QC實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)完整性合規(guī)性具有重要意義。
Agilent1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司) ,色譜柱:Agela XBP-C18 150 mm×4.6 mm,5 μm,XPE-105型電子天平(瑞士梅特勒公司)。
B-4樣品(批號:191003),B-4對照品(批號:20200222)含量99.7%,去氟B-4雜質(zhì)(批號:20200621)含量98.9%,B-3雜質(zhì)(批號:20201118)含量99.1%。純化水(超純水):乙腈(色譜級,德國默克公司),磷酸(色譜級,德國默克公司),碳酸氫鈉(分析級),HPLC玻璃進(jìn)樣瓶(Agilent 部件號:5182-0716,批號17306794,17171251,17278167,18283373)。
日常檢測發(fā)現(xiàn)RRT1.13(降解圖譜中12.019 min,正常圖譜如圖2所示)有個未知峰,在不同的HPLC玻璃進(jìn)樣瓶中的樣品溶液,檢測結(jié)果詭異,沒有規(guī)律性,色譜檢測中也叫鬼峰[7]或者異常峰[8]。
圖1 降解圖譜
圖2 正常圖譜
取其中一個異常批B-4(批號:191003,RRT1.13雜質(zhì)檢測結(jié)果2.2%)進(jìn)行復(fù)測調(diào)查,原進(jìn)樣瓶的復(fù)測結(jié)果為2.5%(放置進(jìn)樣瓶時(shí)間延長,雜質(zhì)增大),原容量瓶和重新新鮮配制均為0.0%,說明未知雜質(zhì)來源于HPLC玻璃進(jìn)樣瓶(調(diào)查復(fù)測結(jié)果如表1所示)。
表1 調(diào)查復(fù)測結(jié)果
通過查閱文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)關(guān)于HPLC玻璃進(jìn)樣瓶的原因?qū)е聵悠方到獬霈F(xiàn)鬼峰的報(bào)道:例如,進(jìn)樣瓶內(nèi)表面含有硝化物雜質(zhì),使氯法齊明(Clofazimine)在酸性條件下,氧化反應(yīng)生成未知雜質(zhì)氯法齊明亞硝酸酯(Clofazimine nitrite ester)[9];依折麥布(Ezetimeble)的純乙腈樣品溶液在某個特定的玻璃進(jìn)樣瓶中,由堿催化引起依折麥布降解形成二種二聚雜質(zhì)和依折麥布異構(gòu)體[10];另外,在文獻(xiàn)“The importance of vial composition in HPLC analysis: an unusual case of phosphorous pseudorotation.”中報(bào)道,索非布韋(Sofosbuvir)50%的乙腈水稀釋的樣品溶液在進(jìn)樣瓶中溶液不穩(wěn)定,當(dāng)稀釋液改為乙腈:0.1%磷酸水溶液,樣品溶液在HPLC玻璃進(jìn)樣瓶中穩(wěn)定性良好[11]。
隨機(jī)取4個不同批次由安捷倫生產(chǎn)的玻璃進(jìn)樣瓶,測定pH值(取20個進(jìn)樣瓶,用純化水超聲潤洗,測定清洗液的pH),再隨機(jī)取各個批次的進(jìn)樣小瓶,考察191003批B-4的溶液穩(wěn)定性24 h,發(fā)現(xiàn)其中一個批次進(jìn)樣瓶(批號:17306794)pH為8.16呈堿性與文獻(xiàn)報(bào)道一致,而且呈堿性的玻璃進(jìn)樣瓶溶液不穩(wěn)定(不同批次進(jìn)樣pH和樣品溶液穩(wěn)定性如表2所示)。
表2 不同批次進(jìn)樣pH和樣品溶液穩(wěn)定性
再取安捷倫進(jìn)樣瓶(部件號5182-0716),批號17306794的5個進(jìn)樣瓶和批號17278167的1個進(jìn)樣瓶(對照)進(jìn)行溶液穩(wěn)定性考察,樣品溶液放置于室溫0、2、4、6、8、10、12、24 h取樣檢測,發(fā)現(xiàn)不同進(jìn)樣瓶降解速度,不呈規(guī)律性,新鮮配制溶液RRT1.13的雜質(zhì)為0.0%;與日常檢測結(jié)果一致(17306794批次進(jìn)樣瓶降解規(guī)律研究如圖3所示)。通過以上調(diào)查,說明某些特定批次HPLC玻璃進(jìn)樣瓶含有堿性物質(zhì)導(dǎo)致樣品溶液降解生成RRT1.13的雜質(zhì)。
圖3 17306794批次進(jìn)樣瓶降解規(guī)律
對191003批次B-4的首次檢測樣品溶液進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析,判斷RRT1.13的雜質(zhì)分子量為417與B-4一致。從分子結(jié)構(gòu)分析,B-4結(jié)構(gòu)中兩個羰基之間的氫,因?yàn)檫B接兩個吸電子基團(tuán),極性翻轉(zhuǎn),容易在堿性條件下離去,形成酮式-烯醇式互變,結(jié)構(gòu)為化合物(5)。烯醇式通常為可逆反應(yīng),我們設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行確認(rèn)。
樣品A: 取B-4樣品50 mg,加10 mL乙腈溶解,加入0.1%碳酸氫鈉溶液10 mL,破壞30 min,用乙腈定容至50 mL(pH=8)。
樣品B:取B-4樣品50 mg,加10 mL乙腈溶解,加入0.1%碳酸氫鈉溶液10 mL,破壞30 min,再加入0.1%的磷酸水溶液15 mL中和,用乙腈定容至50 mL(pH=2.5)。
隨州市經(jīng)濟(jì)發(fā)展穩(wěn)速,面對經(jīng)濟(jì)新常態(tài)下增速換擋、風(fēng)險(xiǎn)防范等多重壓力,在2017年,全市實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)總值(GDP)935.72億元,按可比價(jià)格計(jì)算,同比增長6.8%。其中,第一產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)增加值150.99億元,增長3.7%;第二產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)增加值437.3億元,增長6%;第三產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)增加值347.43億元,增長9.2%。三次產(chǎn)業(yè)比重由2016年的16.5∶46.8∶36.7調(diào)整為16.1∶46.8∶37.1,服務(wù)業(yè)占GDP比重比上年提高0.4個百分點(diǎn)。
樣品C:取B-4樣品50 mg,加10 mL乙腈溶解,加入0.1%的磷酸水溶液10 mL,用乙腈定容至50 mL(pH=2.2)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:樣品A中RRT1.13的雜質(zhì)0.75%,樣品B和樣品C中RRT1.13的雜質(zhì)為0.0%,而且樣品B和樣品C的雜質(zhì)譜一致,主峰純度均為99.89%,說明RRT1.13的雜質(zhì)為B-4的烯醇式化合物(5)。
通過以上異常雜質(zhì)調(diào)查,結(jié)果表明RRT1.13的未知雜質(zhì)為某些含有堿性雜質(zhì)的玻璃進(jìn)樣瓶,堿催化生成B-4的烯醇式化合物(5)。
由于玻璃進(jìn)樣瓶堿性物質(zhì),降解雜質(zhì)沒有規(guī)律性,容易產(chǎn)生不必要的OOS結(jié)果,所以必須對新采購的進(jìn)樣瓶進(jìn)行使用前評估或者更換成酸性稀釋劑中和,顯然采取更換酸性稀釋液,操作更簡單。
將稀釋液由乙腈改為乙腈與0.1%的磷酸水溶液的混合液(體積比=60∶40)。配制1 mg ·mL-1的樣品溶液轉(zhuǎn)移至不同HPLC玻璃進(jìn)樣小瓶中(批號17306794,已確認(rèn)有堿性雜質(zhì)),置于室溫,進(jìn)行穩(wěn)定性考察1、2、3天。
檢測結(jié)果RRT1.13的含量均為0.0%,說明更換成酸性稀釋劑,可以避免B-4降解成B-4烯醇式結(jié)構(gòu)。
安捷倫色譜儀配VWD檢測器,色譜柱XBP-C18 4.6×150 mm, 5 μm,流動相:60%乙腈水溶液,流速為1.0 mL·min-1,柱溫為30 ℃,VWD檢測器波長為246 nm,樣品濃度為1.0 mg·mL-1,稀釋液:乙腈與0.1%磷酸水溶液的混合液(體積比=60∶40),進(jìn)樣量10 μL,運(yùn)行30 min,面積歸一化法計(jì)算。
雜質(zhì)B-3與去氟B-4之間的分離度為13.2,去氟B-4與B-4之間的分離度為3.1(分離度譜圖如圖4所示),表明專屬性良好。
圖4 分離度譜圖
配制6份B-4濃度為1.0 mg·mL-1,B-3濃度為1.2 μg·mL-1,B-4濃度為1.2 μg·mL-1的精密度溶液,連續(xù)進(jìn)樣6針,B-3:RSD%=0.5%,去氟B-4:RSD%=0.0%,B-4:RSD%=0.1%,結(jié)果表明本方法精密度良好(精密度結(jié)果如表3所示)。
表3 精密度結(jié)果 單位:%
配制三份供試品溶液,分別加入1.0 μg·mL-1、1.2 μg·mL-1、1.4 μg·mL-1的B-3和去氟B-4,對照溶液為供試品溶液不加雜質(zhì),每個回收率溶液進(jìn)樣3針(回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示),結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好。
表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果
配制各個組分線性溶液,濃度詳見下表,依次進(jìn)樣以峰面積Y為縱坐標(biāo),濃度X為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,B-3的線性方程Y=35.902 4X-0.052 0(R2=0.999 7),B-4去氟的線性方程Y=37.157 5X+0.151 9(R2=0.999 8),B-4的線性方程Y=31.043 3X- 2 476.177 4(R2=0.999 3)結(jié)果表明,各組分線性關(guān)系良好。線性測試結(jié)果如表5所示。
表5 線性測試結(jié)果 單位:μg·mL-1
用稀釋法稀釋至B-3,B-4,去氟B-4的組分的基線與噪音比約為10時(shí)即為LOQ濃度,B-3,B-4,去氟B-4的濃度為0.3 μg·mL-1,相當(dāng)于B-4的樣品濃度為0.03%;配制6份LOQ的濃度,進(jìn)樣測試,B-3,B-4,去氟B-4的峰面積RSD%分別為0.6%、0.8%、2.3%,精密度良好。
用稀釋法稀釋至B-3,B-4,去氟B-4的組分的基線與噪音比約為3時(shí)即為LOD濃度,B-3,B-4,去氟B-4的濃度為0.1 μg·mL-1,相當(dāng)于B-4的樣品濃度為0.01%。
即檢測方法的最小檢測量為0.3 μg·mL-1,最低檢測限為0.1 μg·mL-1。
(1)本次還進(jìn)行相關(guān)物質(zhì)B-3和去氟B-4的校正因子研究,B-3和去氟B-4的校正因子均為1.0,說明檢測波長設(shè)定為246 nm合理;B-4主峰線性良好,可以采用面積歸一化法計(jì)算各個雜質(zhì)的含量。
(2)本次還對安捷倫,島津,沃特世等主要品牌供應(yīng)商的HPLC玻璃進(jìn)樣小瓶,進(jìn)行研究,研究結(jié)果表明,優(yōu)化后的檢測方法耐用性良好。
通過研究表明B-4乙腈溶液在含有堿性物質(zhì)的HPLC玻璃進(jìn)樣瓶中,易被堿催化降解,生成烯醇式異構(gòu)體;通過優(yōu)化B-4樣品溶液的pH值,可以避免由于進(jìn)樣瓶原因?qū)е碌南┐际交プ?;?yōu)化后的B-4相關(guān)物質(zhì)的HPLC檢測方法的精密度、準(zhǔn)確度、專屬性和線性良好,方法靈敏度高,耐用性良好,可以簡單、快速、準(zhǔn)確地用于測定B-4的相關(guān)物質(zhì)。