朱鎮(zhèn)星，覃松，馬密茸，李翠杰，歐陽曉輝(浙江宏元藥業(yè)股份有限公司，浙江 臨海 317016)

0 引言

阿托伐他汀鈣[1-2]，商品名LIPITOR，分子結(jié)構(gòu)式由式(1)表示，是HMG-CoA還原酶的選擇性、競爭性抑制劑，通過抑制肝臟內(nèi)HMG-CoA還原酶和膽固醇的合成從而降低血漿中膽固醇和脂蛋白水平，并通過增加細(xì)胞表明的肝臟LDL受體以增強(qiáng)LDL的攝取和代謝；適用于高膽固醇血癥和冠心病，是全球第1個年度銷售額超過百億美元的重磅新藥。

B-4，分子結(jié)構(gòu)式由式(2)表示，化學(xué)名：2-[2-(4-氟苯基)-2-氧代-1-苯基乙基]-4-甲基-3-氧代-N-苯基戊酰胺；英文名稱：2-[2-(4-Fluorophenyl)-2-oxo-1-phenylethyl]-4-methyl-3-oxo-Nphenylpentanamide. CAS號：125971-96-2,是合成阿托伐他汀鈣原料藥的關(guān)鍵中間體[3-5], 化學(xué)結(jié)構(gòu)如下。

B-4主要控制的雜質(zhì)有工藝雜質(zhì)去氟B-4雜質(zhì)，分子結(jié)構(gòu)式由式(3)表示；前一步中間體B-3，分子結(jié)構(gòu)式由式(4)表示。B-4樣品的乙腈溶液在玻璃進(jìn)樣小瓶中，發(fā)生無法預(yù)測的，貌似隨機(jī)的降解。問題的詭異之處在于每個樣品溶液制備時(shí)，均無法預(yù)測樣品是否會降解，隨著時(shí)間推移，回顧已經(jīng)制備的樣品溶液，在HPLC玻璃進(jìn)樣瓶中的溶液穩(wěn)定性，約10%的溶液顯示會降解，12 h內(nèi)降解0.2%～2%。我們通過研究確定溶液降解是由堿催化引起B(yǎng)-4降解，降解雜質(zhì)為B-4的烯醇式結(jié)構(gòu)[6]，分子結(jié)構(gòu)式由式(5)表示，相關(guān)文獻(xiàn)中未報(bào)到B-4的烯醇式雜質(zhì)。

本次研究的意義在于：阿托伐他汀鈣是十分重要的降低膽固醇的藥物，B-4為阿托伐他汀鈣關(guān)鍵中間體，開發(fā)一個耐用性良好，能夠避免HPLC玻璃進(jìn)樣瓶的堿性物質(zhì)催化降解的B-4相關(guān)物質(zhì)檢測方法，對阿托伐他汀鈣原料藥的質(zhì)量控制具有重要意義。同時(shí)，避免放行過程中不必要的OOS(超標(biāo))調(diào)查，對于提高QC實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)完整性合規(guī)性具有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司) ，色譜柱：Agela XBP-C18 150 mm×4.6 mm，5 μm，XPE-105型電子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 試藥與對照品

B-4樣品(批號：191003)，B-4對照品(批號：20200222)含量99.7%，去氟B-4雜質(zhì)(批號：20200621)含量98.9%，B-3雜質(zhì)(批號：20201118)含量99.1%。純化水(超純水)：乙腈(色譜級，德國默克公司)，磷酸(色譜級，德國默克公司)，碳酸氫鈉(分析級)，HPLC玻璃進(jìn)樣瓶(Agilent 部件號：5182-0716，批號17306794，17171251，17278167，18283373)。

2 降解雜質(zhì)調(diào)查實(shí)驗(yàn)

2.1 B-4降解雜質(zhì)情況說明

日常檢測發(fā)現(xiàn)RRT1.13(降解圖譜中12.019 min，正常圖譜如圖2所示)有個未知峰，在不同的HPLC玻璃進(jìn)樣瓶中的樣品溶液，檢測結(jié)果詭異，沒有規(guī)律性，色譜檢測中也叫鬼峰[7]或者異常峰[8]。

圖1 降解圖譜

圖2 正常圖譜

2.2 B-4降解雜質(zhì)調(diào)查

取其中一個異常批B-4(批號：191003，RRT1.13雜質(zhì)檢測結(jié)果2.2%)進(jìn)行復(fù)測調(diào)查，原進(jìn)樣瓶的復(fù)測結(jié)果為2.5%(放置進(jìn)樣瓶時(shí)間延長，雜質(zhì)增大)，原容量瓶和重新新鮮配制均為0.0%，說明未知雜質(zhì)來源于HPLC玻璃進(jìn)樣瓶(調(diào)查復(fù)測結(jié)果如表1所示)。

表1 調(diào)查復(fù)測結(jié)果

通過查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)關(guān)于HPLC玻璃進(jìn)樣瓶的原因?qū)е聵悠方到獬霈F(xiàn)鬼峰的報(bào)道：例如，進(jìn)樣瓶內(nèi)表面含有硝化物雜質(zhì)，使氯法齊明(Clofazimine)在酸性條件下，氧化反應(yīng)生成未知雜質(zhì)氯法齊明亞硝酸酯(Clofazimine nitrite ester)[9]；依折麥布(Ezetimeble)的純乙腈樣品溶液在某個特定的玻璃進(jìn)樣瓶中，由堿催化引起依折麥布降解形成二種二聚雜質(zhì)和依折麥布異構(gòu)體[10]；另外，在文獻(xiàn)“The importance of vial composition in HPLC analysis: an unusual case of phosphorous pseudorotation.”中報(bào)道，索非布韋(Sofosbuvir)50%的乙腈水稀釋的樣品溶液在進(jìn)樣瓶中溶液不穩(wěn)定，當(dāng)稀釋液改為乙腈：0.1%磷酸水溶液，樣品溶液在HPLC玻璃進(jìn)樣瓶中穩(wěn)定性良好[11]。

隨機(jī)取4個不同批次由安捷倫生產(chǎn)的玻璃進(jìn)樣瓶，測定pH值(取20個進(jìn)樣瓶，用純化水超聲潤洗，測定清洗液的pH)，再隨機(jī)取各個批次的進(jìn)樣小瓶，考察191003批B-4的溶液穩(wěn)定性24 h，發(fā)現(xiàn)其中一個批次進(jìn)樣瓶(批號：17306794)pH為8.16呈堿性與文獻(xiàn)報(bào)道一致，而且呈堿性的玻璃進(jìn)樣瓶溶液不穩(wěn)定(不同批次進(jìn)樣pH和樣品溶液穩(wěn)定性如表2所示)。

表2 不同批次進(jìn)樣pH和樣品溶液穩(wěn)定性

再取安捷倫進(jìn)樣瓶(部件號5182-0716)，批號17306794的5個進(jìn)樣瓶和批號17278167的1個進(jìn)樣瓶(對照)進(jìn)行溶液穩(wěn)定性考察，樣品溶液放置于室溫0、2、4、6、8、10、12、24 h取樣檢測，發(fā)現(xiàn)不同進(jìn)樣瓶降解速度，不呈規(guī)律性，新鮮配制溶液RRT1.13的雜質(zhì)為0.0%；與日常檢測結(jié)果一致(17306794批次進(jìn)樣瓶降解規(guī)律研究如圖3所示)。通過以上調(diào)查，說明某些特定批次HPLC玻璃進(jìn)樣瓶含有堿性物質(zhì)導(dǎo)致樣品溶液降解生成RRT1.13的雜質(zhì)。

圖3 17306794批次進(jìn)樣瓶降解規(guī)律

2.3 B-4降解雜質(zhì)解析

對191003批次B-4的首次檢測樣品溶液進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析，判斷RRT1.13的雜質(zhì)分子量為417與B-4一致。從分子結(jié)構(gòu)分析，B-4結(jié)構(gòu)中兩個羰基之間的氫，因?yàn)檫B接兩個吸電子基團(tuán)，極性翻轉(zhuǎn)，容易在堿性條件下離去，形成酮式-烯醇式互變，結(jié)構(gòu)為化合物(5)。烯醇式通常為可逆反應(yīng)，我們設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行確認(rèn)。

樣品A： 取B-4樣品50 mg，加10 mL乙腈溶解，加入0.1%碳酸氫鈉溶液10 mL，破壞30 min，用乙腈定容至50 mL(pH=8)。

樣品B：取B-4樣品50 mg，加10 mL乙腈溶解，加入0.1%碳酸氫鈉溶液10 mL，破壞30 min，再加入0.1%的磷酸水溶液15 mL中和，用乙腈定容至50 mL(pH=2.5)。

隨州市經(jīng)濟(jì)發(fā)展穩(wěn)速，面對經(jīng)濟(jì)新常態(tài)下增速換擋、風(fēng)險(xiǎn)防范等多重壓力，在2017年，全市實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)總值(GDP)935.72億元，按可比價(jià)格計(jì)算，同比增長6.8%。其中，第一產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)增加值150.99億元，增長3.7%;第二產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)增加值437.3億元，增長6%;第三產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)增加值347.43億元，增長9.2%。三次產(chǎn)業(yè)比重由2016年的16.5∶46.8∶36.7調(diào)整為16.1∶46.8∶37.1，服務(wù)業(yè)占GDP比重比上年提高0.4個百分點(diǎn)。

樣品C：取B-4樣品50 mg，加10 mL乙腈溶解，加入0.1%的磷酸水溶液10 mL，用乙腈定容至50 mL(pH=2.2)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：樣品A中RRT1.13的雜質(zhì)0.75%，樣品B和樣品C中RRT1.13的雜質(zhì)為0.0%，而且樣品B和樣品C的雜質(zhì)譜一致，主峰純度均為99.89%，說明RRT1.13的雜質(zhì)為B-4的烯醇式化合物(5)。

通過以上異常雜質(zhì)調(diào)查，結(jié)果表明RRT1.13的未知雜質(zhì)為某些含有堿性雜質(zhì)的玻璃進(jìn)樣瓶，堿催化生成B-4的烯醇式化合物(5)。

2.4 方法優(yōu)化

由于玻璃進(jìn)樣瓶堿性物質(zhì)，降解雜質(zhì)沒有規(guī)律性，容易產(chǎn)生不必要的OOS結(jié)果，所以必須對新采購的進(jìn)樣瓶進(jìn)行使用前評估或者更換成酸性稀釋劑中和，顯然采取更換酸性稀釋液，操作更簡單。

將稀釋液由乙腈改為乙腈與0.1%的磷酸水溶液的混合液(體積比=60∶40)。配制1 mg ·mL-1的樣品溶液轉(zhuǎn)移至不同HPLC玻璃進(jìn)樣小瓶中(批號17306794，已確認(rèn)有堿性雜質(zhì))，置于室溫，進(jìn)行穩(wěn)定性考察1、2、3天。

檢測結(jié)果RRT1.13的含量均為0.0%，說明更換成酸性稀釋劑，可以避免B-4降解成B-4烯醇式結(jié)構(gòu)。

2.5 最終優(yōu)化的方法參數(shù)

安捷倫色譜儀配VWD檢測器，色譜柱XBP-C18 4.6×150 mm， 5 μm，流動相：60%乙腈水溶液，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，VWD檢測器波長為246 nm，樣品濃度為1.0 mg·mL-1，稀釋液：乙腈與0.1%磷酸水溶液的混合液(體積比=60∶40)，進(jìn)樣量10 μL，運(yùn)行30 min，面積歸一化法計(jì)算。

3 方法學(xué)論證

3.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

雜質(zhì)B-3與去氟B-4之間的分離度為13.2，去氟B-4與B-4之間的分離度為3.1(分離度譜圖如圖4所示)，表明專屬性良好。

圖4 分離度譜圖

3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

配制6份B-4濃度為1.0 mg·mL-1，B-3濃度為1.2 μg·mL-1，B-4濃度為1.2 μg·mL-1的精密度溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，B-3：RSD%=0.5%，去氟B-4：RSD%=0.0%，B-4：RSD%=0.1%，結(jié)果表明本方法精密度良好(精密度結(jié)果如表3所示)。

表3 精密度結(jié)果 單位：%

3.3 回收率實(shí)驗(yàn)

配制三份供試品溶液，分別加入1.0 μg·mL-1、1.2 μg·mL-1、1.4 μg·mL-1的B-3和去氟B-4，對照溶液為供試品溶液不加雜質(zhì)，每個回收率溶液進(jìn)樣3針(回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示)，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4 線性實(shí)驗(yàn)

配制各個組分線性溶液，濃度詳見下表，依次進(jìn)樣以峰面積Y為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，B-3的線性方程Y=35.902 4X-0.052 0(R2=0.999 7)，B-4去氟的線性方程Y=37.157 5X+0.151 9(R2=0.999 8)，B-4的線性方程Y=31.043 3X- 2 476.177 4(R2=0.999 3)結(jié)果表明，各組分線性關(guān)系良好。線性測試結(jié)果如表5所示。

表5 線性測試結(jié)果 單位：μg·mL-1

3.5 定量限、檢測限

用稀釋法稀釋至B-3，B-4，去氟B-4的組分的基線與噪音比約為10時(shí)即為LOQ濃度，B-3，B-4，去氟B-4的濃度為0.3 μg·mL-1，相當(dāng)于B-4的樣品濃度為0.03%；配制6份LOQ的濃度，進(jìn)樣測試，B-3，B-4，去氟B-4的峰面積RSD%分別為0.6%、0.8%、2.3%，精密度良好。

用稀釋法稀釋至B-3，B-4，去氟B-4的組分的基線與噪音比約為3時(shí)即為LOD濃度，B-3，B-4，去氟B-4的濃度為0.1 μg·mL-1，相當(dāng)于B-4的樣品濃度為0.01%。

即檢測方法的最小檢測量為0.3 μg·mL-1，最低檢測限為0.1 μg·mL-1。

4 討論

(1)本次還進(jìn)行相關(guān)物質(zhì)B-3和去氟B-4的校正因子研究，B-3和去氟B-4的校正因子均為1.0，說明檢測波長設(shè)定為246 nm合理；B-4主峰線性良好，可以采用面積歸一化法計(jì)算各個雜質(zhì)的含量。

(2)本次還對安捷倫，島津，沃特世等主要品牌供應(yīng)商的HPLC玻璃進(jìn)樣小瓶，進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明，優(yōu)化后的檢測方法耐用性良好。

5 結(jié)語

通過研究表明B-4乙腈溶液在含有堿性物質(zhì)的HPLC玻璃進(jìn)樣瓶中，易被堿催化降解，生成烯醇式異構(gòu)體；通過優(yōu)化B-4樣品溶液的pH值，可以避免由于進(jìn)樣瓶原因?qū)е碌南┐际交プ?；?yōu)化后的B-4相關(guān)物質(zhì)的HPLC檢測方法的精密度、準(zhǔn)確度、專屬性和線性良好，方法靈敏度高，耐用性良好，可以簡單、快速、準(zhǔn)確地用于測定B-4的相關(guān)物質(zhì)。