朱鎮(zhèn)星，覃松，馬密茸，李翠杰，歐陽曉輝(浙江宏元藥業(yè)股份有限公司，浙江 臨海 317016)

0 引言

阿托伐他汀鈣[1-2]，商品名LIPITOR，分子結(jié)構(gòu)式由式(1)表示，是HMG-CoA還原酶的選擇性、競爭性抑制劑，通過抑制肝臟內(nèi)HMG-CoA還原酶和膽固醇的合成從而降低血漿中膽固醇和脂蛋白水平，并通過增加細胞表明的肝臟LDL受體以增強LDL的攝取和代謝；適用于高膽固醇血癥和冠心病，是全球第1個年度銷售額超過百億美元的重磅新藥。

B-4，分子結(jié)構(gòu)式由式(2)表示，化學(xué)名：2-[2-(4-氟苯基)-2-氧代-1-苯基乙基]-4-甲基-3-氧代-N-苯基戊酰胺；英文名稱：2-[2-(4-Fluorophenyl)-2-oxo-1-phenylethyl]-4-methyl-3-oxo-Nphenylpentanamide. CAS號：125971-96-2,是合成阿托伐他汀鈣原料藥的關(guān)鍵中間體[3-5], 化學(xué)結(jié)構(gòu)如下。

B-4主要控制的雜質(zhì)有工藝雜質(zhì)去氟B-4雜質(zhì)，分子結(jié)構(gòu)式由式(3)表示；前一步中間體B-3，分子結(jié)構(gòu)式由式(4)表示。B-4樣品的乙腈溶液在玻璃進樣小瓶中，發(fā)生無法預(yù)測的，貌似隨機的降解。問題的詭異之處在于每個樣品溶液制備時，均無法預(yù)測樣品是否會降解，隨著時間推移，回顧已經(jīng)制備的樣品溶液，在HPLC玻璃進樣瓶中的溶液穩(wěn)定性，約10%的溶液顯示會降解，12 h內(nèi)降解0.2%～2%。我們通過研究確定溶液降解是由堿催化引起B(yǎng)-4降解，降解雜質(zhì)為B-4的烯醇式結(jié)構(gòu)[6]，分子結(jié)構(gòu)式由式(5)表示，相關(guān)文獻中未報到B-4的烯醇式雜質(zhì)。

本次研究的意義在于：阿托伐他汀鈣是十分重要的降低膽固醇的藥物，B-4為阿托伐他汀鈣關(guān)鍵中間體，開發(fā)一個耐用性良好，能夠避免HPLC玻璃進樣瓶的堿性物質(zhì)催化降解的B-4相關(guān)物質(zhì)檢測方法，對阿托伐他汀鈣原料藥的質(zhì)量控制具有重要意義。同時，避免放行過程中不必要的OOS(超標(biāo))調(diào)查，對于提高QC實驗室數(shù)據(jù)完整性合規(guī)性具有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司) ，色譜柱：Agela XBP-C18 150 mm×4.6 mm，5 μm，XPE-105型電子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 試藥與對照品

B-4樣品(批號：191003)，B-4對照品(批號：20200222)含量99.7%，去氟B-4雜質(zhì)(批號：20200621)含量98.9%，B-3雜質(zhì)(批號：20201118)含量99.1%。純化水(超純水)：乙腈(色譜級，德國默克公司)，磷酸(色譜級，德國默克公司)，碳酸氫鈉(分析級)，HPLC玻璃進樣瓶(Agilent 部件號：5182-0716，批號17306794，17171251，17278167，18283373)。

2 降解雜質(zhì)調(diào)查實驗

2.1 B-4降解雜質(zhì)情況說明

日常檢測發(fā)現(xiàn)RRT1.13(降解圖譜中12.019 min，正常圖譜如圖2所示)有個未知峰，在不同的HPLC玻璃進樣瓶中的樣品溶液，檢測結(jié)果詭異，沒有規(guī)律性，色譜檢測中也叫鬼峰[7]或者異常峰[8]。

圖1 降解圖譜

圖2 正常圖譜

2.2 B-4降解雜質(zhì)調(diào)查

取其中一個異常批B-4(批號：191003，RRT1.13雜質(zhì)檢測結(jié)果2.2%)進行復(fù)測調(diào)查，原進樣瓶的復(fù)測結(jié)果為2.5%(放置進樣瓶時間延長，雜質(zhì)增大)，原容量瓶和重新新鮮配制均為0.0%，說明未知雜質(zhì)來源于HPLC玻璃進樣瓶(調(diào)查復(fù)測結(jié)果如表1所示)。

表1 調(diào)查復(fù)測結(jié)果

通過查閱文獻，發(fā)現(xiàn)關(guān)于HPLC玻璃進樣瓶的原因?qū)е聵悠方到獬霈F(xiàn)鬼峰的報道：例如，進樣瓶內(nèi)表面含有硝化物雜質(zhì)，使氯法齊明(Clofazimine)在酸性條件下，氧化反應(yīng)生成未知雜質(zhì)氯法齊明亞硝酸酯(Clofazimine nitrite ester)[9]；依折麥布(Ezetimeble)的純乙腈樣品溶液在某個特定的玻璃進樣瓶中，由堿催化引起依折麥布降解形成二種二聚雜質(zhì)和依折麥布異構(gòu)體[10]；另外，在文獻“The importance of vial composition in HPLC analysis: an unusual case of phosphorous pseudorotation.”中報道，索非布韋(Sofosbuvir)50%的乙腈水稀釋的樣品溶液在進樣瓶中溶液不穩(wěn)定，當(dāng)稀釋液改為乙腈：0.1%磷酸水溶液，樣品溶液在HPLC玻璃進樣瓶中穩(wěn)定性良好[11]。

隨機取4個不同批次由安捷倫生產(chǎn)的玻璃進樣瓶，測定pH值(取20個進樣瓶，用純化水超聲潤洗，測定清洗液的pH)，再隨機取各個批次的進樣小瓶，考察191003批B-4的溶液穩(wěn)定性24 h，發(fā)現(xiàn)其中一個批次進樣瓶(批號：17306794)pH為8.16呈堿性與文獻報道一致，而且呈堿性的玻璃進樣瓶溶液不穩(wěn)定(不同批次進樣pH和樣品溶液穩(wěn)定性如表2所示)。

表2 不同批次進樣pH和樣品溶液穩(wěn)定性

再取安捷倫進樣瓶(部件號5182-0716)，批號17306794的5個進樣瓶和批號17278167的1個進樣瓶(對照)進行溶液穩(wěn)定性考察，樣品溶液放置于室溫0、2、4、6、8、10、12、24 h取樣檢測，發(fā)現(xiàn)不同進樣瓶降解速度，不呈規(guī)律性，新鮮配制溶液RRT1.13的雜質(zhì)為0.0%；與日常檢測結(jié)果一致(17306794批次進樣瓶降解規(guī)律研究如圖3所示)。通過以上調(diào)查，說明某些特定批次HPLC玻璃進樣瓶含有堿性物質(zhì)導(dǎo)致樣品溶液降解生成RRT1.13的雜質(zhì)。

圖3 17306794批次進樣瓶降解規(guī)律

2.3 B-4降解雜質(zhì)解析

對191003批次B-4的首次檢測樣品溶液進行高分辨質(zhì)譜分析，判斷RRT1.13的雜質(zhì)分子量為417與B-4一致。從分子結(jié)構(gòu)分析，B-4結(jié)構(gòu)中兩個羰基之間的氫，因為連接兩個吸電子基團，極性翻轉(zhuǎn)，容易在堿性條件下離去，形成酮式-烯醇式互變，結(jié)構(gòu)為化合物(5)。烯醇式通常為可逆反應(yīng)，我們設(shè)計了以下實驗組進行確認(rèn)。

樣品A： 取B-4樣品50 mg，加10 mL乙腈溶解，加入0.1%碳酸氫鈉溶液10 mL，破壞30 min，用乙腈定容至50 mL(pH=8)。

樣品B：取B-4樣品50 mg，加10 mL乙腈溶解，加入0.1%碳酸氫鈉溶液10 mL，破壞30 min，再加入0.1%的磷酸水溶液15 mL中和，用乙腈定容至50 mL(pH=2.5)。

隨州市經(jīng)濟發(fā)展穩(wěn)速，面對經(jīng)濟新常態(tài)下增速換擋、風(fēng)險防范等多重壓力，在2017年，全市實現(xiàn)生產(chǎn)總值(GDP)935.72億元，按可比價格計算，同比增長6.8%。其中，第一產(chǎn)業(yè)實現(xiàn)增加值150.99億元，增長3.7%;第二產(chǎn)業(yè)實現(xiàn)增加值437.3億元，增長6%;第三產(chǎn)業(yè)實現(xiàn)增加值347.43億元，增長9.2%。三次產(chǎn)業(yè)比重由2016年的16.5∶46.8∶36.7調(diào)整為16.1∶46.8∶37.1，服務(wù)業(yè)占GDP比重比上年提高0.4個百分點。

樣品C：取B-4樣品50 mg，加10 mL乙腈溶解，加入0.1%的磷酸水溶液10 mL，用乙腈定容至50 mL(pH=2.2)。

實驗結(jié)果：樣品A中RRT1.13的雜質(zhì)0.75%，樣品B和樣品C中RRT1.13的雜質(zhì)為0.0%，而且樣品B和樣品C的雜質(zhì)譜一致，主峰純度均為99.89%，說明RRT1.13的雜質(zhì)為B-4的烯醇式化合物(5)。

通過以上異常雜質(zhì)調(diào)查，結(jié)果表明RRT1.13的未知雜質(zhì)為某些含有堿性雜質(zhì)的玻璃進樣瓶，堿催化生成B-4的烯醇式化合物(5)。

2.4 方法優(yōu)化

由于玻璃進樣瓶堿性物質(zhì)，降解雜質(zhì)沒有規(guī)律性，容易產(chǎn)生不必要的OOS結(jié)果，所以必須對新采購的進樣瓶進行使用前評估或者更換成酸性稀釋劑中和，顯然采取更換酸性稀釋液，操作更簡單。

將稀釋液由乙腈改為乙腈與0.1%的磷酸水溶液的混合液(體積比=60∶40)。配制1 mg ·mL-1的樣品溶液轉(zhuǎn)移至不同HPLC玻璃進樣小瓶中(批號17306794，已確認(rèn)有堿性雜質(zhì))，置于室溫，進行穩(wěn)定性考察1、2、3天。

檢測結(jié)果RRT1.13的含量均為0.0%，說明更換成酸性稀釋劑，可以避免B-4降解成B-4烯醇式結(jié)構(gòu)。

2.5 最終優(yōu)化的方法參數(shù)

安捷倫色譜儀配VWD檢測器，色譜柱XBP-C18 4.6×150 mm， 5 μm，流動相：60%乙腈水溶液，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，VWD檢測器波長為246 nm，樣品濃度為1.0 mg·mL-1，稀釋液：乙腈與0.1%磷酸水溶液的混合液(體積比=60∶40)，進樣量10 μL，運行30 min，面積歸一化法計算。

3 方法學(xué)論證

3.1 專屬性實驗

雜質(zhì)B-3與去氟B-4之間的分離度為13.2，去氟B-4與B-4之間的分離度為3.1(分離度譜圖如圖4所示)，表明專屬性良好。

圖4 分離度譜圖

3.2 重復(fù)性實驗

配制6份B-4濃度為1.0 mg·mL-1，B-3濃度為1.2 μg·mL-1，B-4濃度為1.2 μg·mL-1的精密度溶液，連續(xù)進樣6針，B-3：RSD%=0.5%，去氟B-4：RSD%=0.0%，B-4：RSD%=0.1%，結(jié)果表明本方法精密度良好(精密度結(jié)果如表3所示)。

表3 精密度結(jié)果 單位：%

3.3 回收率實驗

配制三份供試品溶液，分別加入1.0 μg·mL-1、1.2 μg·mL-1、1.4 μg·mL-1的B-3和去氟B-4，對照溶液為供試品溶液不加雜質(zhì)，每個回收率溶液進樣3針(回收率實驗結(jié)果如表4所示)，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表4 回收率實驗結(jié)果

3.4 線性實驗

配制各個組分線性溶液，濃度詳見下表，依次進樣以峰面積Y為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，B-3的線性方程Y=35.902 4X-0.052 0(R2=0.999 7)，B-4去氟的線性方程Y=37.157 5X+0.151 9(R2=0.999 8)，B-4的線性方程Y=31.043 3X- 2 476.177 4(R2=0.999 3)結(jié)果表明，各組分線性關(guān)系良好。線性測試結(jié)果如表5所示。

表5 線性測試結(jié)果 單位：μg·mL-1

3.5 定量限、檢測限

用稀釋法稀釋至B-3，B-4，去氟B-4的組分的基線與噪音比約為10時即為LOQ濃度，B-3，B-4，去氟B-4的濃度為0.3 μg·mL-1，相當(dāng)于B-4的樣品濃度為0.03%；配制6份LOQ的濃度，進樣測試，B-3，B-4，去氟B-4的峰面積RSD%分別為0.6%、0.8%、2.3%，精密度良好。

用稀釋法稀釋至B-3，B-4，去氟B-4的組分的基線與噪音比約為3時即為LOD濃度，B-3，B-4，去氟B-4的濃度為0.1 μg·mL-1，相當(dāng)于B-4的樣品濃度為0.01%。

即檢測方法的最小檢測量為0.3 μg·mL-1，最低檢測限為0.1 μg·mL-1。

4 討論

(1)本次還進行相關(guān)物質(zhì)B-3和去氟B-4的校正因子研究，B-3和去氟B-4的校正因子均為1.0，說明檢測波長設(shè)定為246 nm合理；B-4主峰線性良好，可以采用面積歸一化法計算各個雜質(zhì)的含量。

(2)本次還對安捷倫，島津，沃特世等主要品牌供應(yīng)商的HPLC玻璃進樣小瓶，進行研究，研究結(jié)果表明，優(yōu)化后的檢測方法耐用性良好。

5 結(jié)語

通過研究表明B-4乙腈溶液在含有堿性物質(zhì)的HPLC玻璃進樣瓶中，易被堿催化降解，生成烯醇式異構(gòu)體；通過優(yōu)化B-4樣品溶液的pH值，可以避免由于進樣瓶原因?qū)е碌南┐际交プ?；?yōu)化后的B-4相關(guān)物質(zhì)的HPLC檢測方法的精密度、準(zhǔn)確度、專屬性和線性良好，方法靈敏度高，耐用性良好，可以簡單、快速、準(zhǔn)確地用于測定B-4的相關(guān)物質(zhì)。